專利名稱：一種檢測人細胞色素p450 cyp2c19基因突變的方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種檢測人細胞色素P450CYP2C19基因突 變的方法及試劑盒。
背景技術：
細胞色素P450CYP2C19基因編碼S-美芬妥英羥化酶，主要存在于人類肝臟細胞， 催化羥化、氧化、環化等I相代謝反應，參與多種藥物的代謝。CYP2C19酶活性在人群中存 在遺傳差異，以美芬妥英或類似底物作為表型探針，可將CYP2C19分為不同表型羥化反應 速度快者為強代謝表型(Extensive MetabolisnuEM)，羥化反應速度慢者為弱代謝型(Poor MetabolisnuPM)。白種人PM的發生率較低(1_2% )，而亞洲人群中PM表型頻率較高，中國 漢族人群的PM的發生率為13 18%，維吾爾族人群PM頻率則低于漢族。CYP2C19基因含9個外顯子，全長約55kb。cDNA全長1940bp，編碼區1473bp共編 碼490個氨基酸，第421至432位氨基酸是血紅素結合位點。系列研究發現代謝表型差異 源于CYP2C19基因突變，最主要為Ml和M2兩種單核苷酸多態性突變。Ml突變為外顯子5上第681位堿基G — A突變，產生異常拼接位點，導致轉錄過 程中外顯子5，端40bp (643-682bp)缺失，翻譯過程中丟失215-227位氨基酸，并從215位 氨基酸處發生移碼，在其下游第20個氨基酸處產生異常終止密碼，蛋白合成過早被終止， 合成僅含234個氨基酸的截短蛋白，為缺失血紅素結合區的無功能蛋白。Ml突變決定是PM 表型的最主要基因型，73-83%的PM表型個體攜帶Ml突變。M2突變是外顯子4第636位堿基G — A突變，編碼色氨酸的密碼子突變為終止密 碼子，導致蛋白合成提前終止，形成無血紅素及底物結合區的無功能蛋白。在中國人群中， M2突變的發生頻率為Ml突變的1/9 1/10，M1和M2突變幾乎可以解釋所有的PM表型。CYP2C19等位基因呈獨立遺傳特性，在Ml純合基因型個體，未發現M2突變等位基 因；同樣在M2純合基因型個體，也不含有Ml突變等位基因。就是說，Ml和M2等位基因在 同一基因位點上可獨立地進行分離，并遺傳給下一代，在同一條染色體上尚未發現兩個突 變等位基因同時存在的狀況。質子泵抑制劑是目前臨床最常用的抑酸藥物，包括奧美拉唑、蘭索拉唑、潘托拉 唑、埃索美拉唑和雷貝拉唑等。主用于治療消化道潰瘍、食管反流癥等疾病。此類藥物化 學結構相似，均包含有非對稱性硫原子和苯并咪唑主鏈，并主要經肝臟CYP2C19酶代謝。 CYP2C19基因多態性分析有助于預測質子泵抑制劑藥物的療效，臨床醫師據此可決定適合 患者的藥物、劑量及經濟的治療方案，為臨床合理用藥、個體化用藥和治療提供指導。以奧美拉唑為例。奧美拉唑是目前應用最多的質子泵抑制劑藥物，也最先被證實 為CYP2C19代謝底物。奧美拉唑主要代謝途徑是5-甲基經CYP2C19羥化，再經CYP3A硫化 氧化生成奧美拉唑砜。次要代謝途徑包括CYP3A催化3-羥化反應和CYP2C19催化5_0_脫 甲基化，代謝產物進一步經CYP3A和CYP2C19代謝生成羥基砜衍生物。
臨床研究發現PM表型個體服用奧美拉唑后的血漿藥物濃度-時間曲線下面積 (AUC)比EM表型個體高5倍。長期服用奧美拉唑等質子泵抑制劑藥物，高胃泌素血癥副作 用多數發生于PM表型患者，EM表型患者則很少發生。長期持續用質子泵抑制劑藥物治療 致^)11丨叫吐411化011綜合征，血漿維生素B12濃度降低，PM表型患者血漿維生素B12降 低程度較EM表型患者更為嚴重。以奧美拉唑為基礎的胃、十二指腸潰瘍聯合治療及幽門螺 桿菌根治的臨床研究發現在相同用藥劑量和給藥方案時，PM表型患者治愈率顯著優于EM 表型患者，EM表型患者需增大藥物劑量方可達到相同療效。除質子泵抑制劑外，CYP2C19還參與多種藥物的代謝。例如新型抗抑郁藥 西酞普蘭(Citalopram，CIT)主要在肝臟中經N位去甲基化，轉化成去甲西酞普蘭 (desmethylcitalopram, DCIT)和去二甲西酞普蘭(didesmethylcitalopram, DDCIT)。 CYP2C 19、CYP3A4和CYP2D6三種酶參與N位去甲基化反應，CYP2C19是催化CIT體內N位 去甲基代謝的主要酶，對西酞普蘭代謝起決定作用。鎮靜催眠抗驚厥地西泮主要有兩條代 謝途徑N-位去甲基化生成去甲地西泮和G3位羥化生成羥地西泮。CYP2C19和CYP3A參與 N-位去甲基化代謝，CYP2C19與底物親和力高，在治療劑量下起主要作用。研究發現Ml/Ml 純合基因型患者對地西泮代謝速度顯著低于M1/W1雜合和W1/W1純合基因型患者。治療抑郁癥以及強迫觀念行為的首選藥物氟西汀，通過選擇性抑制中樞神經系統 5-羥色胺重攝取而發揮藥理作用。CYP2CI9參與氟西汀N-去甲基和0-脫烷基兩條主要代 謝途徑，CYP2C 19活性差異導致個體間氟西汀和去氧氟四汀血藥濃度差異，CYP2C19對氟 西汀的去甲基代謝呈基因-劑量依賴性。因此專家建議在臨床應用氟四汀時，應根據個體 CYP2CI9的基因型調整給藥劑量。CYP2C19功能狀態對于聯合用藥也十分重要。例如抗癲癇藥苯妥英(PHT)與丙戊 酸(VPA)均經CYP2C19代謝，大部分PM表型患者給予較小劑量的VPA，即可達到有效血藥 濃度并控制癥狀。既可減少藥品資源浪費，又可降低藥品不良反應風險。由于PM表型患 者對藥物敏感，即便增加很小的劑量，都可能引起血藥濃度的較大變化，甚至會導致藥物中 毒。因此，PM型患者在服用VPA時，應從比低于常規劑量的更小劑量開始，同時密切觀察癥 狀及血藥濃度變化。VPA和PHT間存在競爭性抑制，由于VPA與CYP2C19的親和力高于PHT， 可取代PHT的蛋白結合位點，而首先經CYP2C19酶代謝，同時抑制了 PHT的代謝而增加游 離PHT水平。而PHT又是肝臟酶表達的誘導劑，可刺激CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5及 CYP2C19等多種酶合成，增高酶水平促進VPA的代謝，進一步降低VPA血藥濃度。PM表型患 者對PHT的酶活性誘導作用不敏感，穩態后VPA血藥濃度與單用VPA的血藥濃度接近。聯 合用藥時PM表型患者VPA血藥濃度變化較為理想，不易產生因VPA血藥濃度過高而引起的 藥物毒副作用。而EM型患者受PHT酶活性誘導作用較強，穩態后血藥濃度約為單用VPA正 常代謝者的3/5，使得VPA與PHT聯合用藥時，EM者的血藥濃度顯著低于PM者，達不到有效 血藥濃度。相反服用同等劑量VPA時，PM表型患者血藥濃度卻異常增高，易出現藥物副作 用。因而PM表型患者應減少VPA的劑量，避免毒副作用發生。CYP2C19基因除參與代謝藥物外，也參與多種致癌物清除代謝或前致癌物活化代 謝等生物轉化過程激活。因而CYP2C19基因多態性也與癌癥發生風險相關。例如CYP2C19 基因多態性與膀胱癌、乳腺癌、急性白血病、肺癌、前列腺癌、胃癌、結腸癌、肝硬化及肝癌等 腫瘤風險相關。在人群中進行人細胞色素P450CYP2C19基因突變檢測，進行CYP2C19基因分型，提高對某些腫瘤易感性的預測水平，有助于腫瘤的預防。
發明內容
本發明的發明目的是提供一種檢測人細胞色素P450CYP2C19基因突變的方法，包 含以下步驟用引物對樣品基因組進行擴增，所述引物包含檢測Ml突變的上下游引物，其核 苷酸分別如SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2所示；以及檢測M2突變的上下游引物，其核苷酸分 別如 SEQ ID No. 5、SEQ IDNo. 6 所示；設立質控參照，取擴增產物用核苷酸如SEQ ID No. 9、SEQ IDNo. 10所示的測序引 物進行測序。本發明所述人細胞色素P450CYP2C 19基因突變方法檢測CYP2C19的Ml和M2突 變野生型及變異性等位基因的外顯子及突變位點序列分別為Ml突變外顯子5第681位堿基G — AWl等位基因序列(Exon5)atatgcaataattttcccactatcattgattatttccc |g] ggaacccataacaaattacttaaaaacc ttgcttttatggaaagtgatattttggagaaagtaaaagaacaccaagaatcgatggacatcaacaaccctcgggac tttattgattgcttcctgatcaaaatggagaagMl等位基因序列(Exon5)atatgcaataattttcccactatcattgattatttccc |a] ggaacccataacaaattacttaaaaacc ttgcttttatggaaagtgatattttggagaaagtaaaagaacaccaagaatcgatggacatcaacaaccctcgggac tttattgattgcttcctgatcaaaatggagaagM2突變外顯子4第636位堿基G — AW2等位基因序列(Exon4)cttcaccctgtgatcccactttcatcctgggctgtgctccctgcaatgtgatctgctccattattttc cagaaacgtttcgattataaagatcagcaatttcttaacttgatggaaaaattgaatgaaaacatcaggattgtaa
gcaccccctg |g] atccagM2等位基因序列(Exon4)Cttcaccctgtgatcccactttcatcctgggctgtgctccctgcaatgtgatctgctccattattttc cagaaacgtttcgattataaagatcagcaatttcttaacttgatggaaaaattgaatgaaaacatcaggattgtaa
gcaccccctg |a]； atccag所述檢測Ml、M2突變的上下游引物指擴增Ml和M2突變所在區域的上游和下游 引物。所述測序引物為識別PCR產物并通過DNA測序反應檢測Ml和M2突變的通用測序引 物。所述檢測Ml、M2突變的上下游引物，與其他人所有的序列不同，為了方便測序，在 所述引物的末端添加了便于測序反應的特殊序列，簡化了后續的測序反應，增加了通用性 和標準化，且經實驗驗證其特異性強。作為優選，所述質控參照包含W1/W1純合基因型質控參照、Ml/Ml純合基因型質控 參照、W1/M1雜合基因型質控參照、M2/M2純合基因型質控參照、W2/W2純合基因型質控參照、W2/M2雜合基因型質控參照。作為優選，所述質控參照為分別重組了核苷酸如SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 8所示序列的重組質粒的一種，分別作為W1/W1純合基因型質控參 照、Ml/Ml純合基因型質控參照、W2/W2純合基因型質控參照、M2/M2純合基因型質控參照。更優選地，所述質控參照為分別重組了核苷酸如SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4的重 組質粒的混合物、分別重組了核苷酸如SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 8所示序列的重組質粒 的混合物，分別作為W1/M1雜合基因型質控參照、W2/M2雜合基因型質控參照。本發明還提供一種人細胞色素P450CYP2C19基因突變的試劑盒，包含PCR擴增試 劑、PCR產物純化試劑、DNA測序反應試劑、質控參照品和測序產物純化試劑，其特征在于， PCR擴增引物為檢測Ml突變引物和檢測M2突變引物，所述檢測Ml突變引物核苷酸分別如 SEQ ID No. USEQ ID No. 2所示，所述檢測M2突變引物核苷酸分別如SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6所示；測序引物核苷酸如SEQ IDNo. 9、SEQ ID No. 10所示。作為優選，所述質控參照品包含W1/W1純合基因型質控參照、Ml/Ml純合基因型質 控參照、W1/M1雜合基因型質控參照、M2/M2純合基因型質控參照、W2/W2純合基因型質控參 照、W2/M2雜合基因型質控參照。作為優選，所述質控參照為分別重組了核苷酸如SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4的重 組質粒的混合物、分別重組了核苷酸如SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 8所示序列的重組質粒 的混合物或任一種重組質粒。在本發明的具體實施例中，所述PCR擴增試劑含pH8. 3-8. 8的Tri s. Cl、DCl、 MgCl2、二硫蘇糖醇、Triton X_100、dNTP 混合液(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)、正向和反向引物 對、Taq DNA聚合酶、DMSO和甘油。在本發明的具體實施例中，所述PCR純化試劑包括蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶。在本發明的具體實施例中，所述DNA測序反應試劑包含BigDye染料、ddNTP和 dNTP混合液、測序酶、測序引物。CYP2C19為肝臟重要的I相代謝酶，催化氧化還原、羥化、等多種代謝反應，幾十 種臨床常用藥物經CYP2C19代謝，Ml和M2基因突變決定中國人群幾乎全部的弱代謝表型。 CYP2C19酶活性影響多種藥物的代謝，檢測Ml和M2突變型可判斷酶活性并預測相關藥物的 體內代謝及毒副反應。通過檢測重要的代謝酶CYP2C19基因型，推斷酶活性和藥物代謝狀 況，從而指導多種藥物的個體化應用。
圖1為本發明Ml突變PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；
1-5 待測標本；+ 陽性對照；-陰性對照；圖2為實施例3的Ml/Ml純合基因型測序峰圖部分截圖。
具體實施例方式本發明公開了一種檢測人體細胞色素氧化酶P4502C19基因突變的方法及試劑 盒，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有 類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法、產品及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發 明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應 用本發明技術。為了使本領域的技術人員更好地理解本發明的技術方案，下面結合具體實施例對 本發明作進一步的詳細說明。實施例1 本發明所述檢測人細胞色素P450CYP2C19基因突變試劑盒本發明所述CYP2C19基因分型試劑盒包括PCR擴增反應、擴增產物純化、測序反應 和測序產物純合及上樣四個單元。PCR擴增反應單元檢測Ml和M2的PCR擴增單元均含一管反應試劑和一管陽性參照品。1、PCR反應試劑由特異性引物對、PCR緩沖液、dNTP混合液和Taq DNA聚合酶等按照優化的反應濃 度配制而成。1)特異性引物正反向引物各50-100nmol/L。采用01igo6軟件設計擴增含Ml或M2突變位點基因片段的特異性PCR引物，序列 分別為檢測Ml突變正向引物(Ml-F)為5，-TGTAAAACGACGGCCAGTAAAGCAGGTATAAGTCTAGGA-3，，(核苷酸序列如 SEQ ID No. 1所示)檢測Ml突變反向引物(Ml-R)為5，-AACAGCTATGACCATGCACAAATACGCAAGCAGTC-3，(核苷酸序列如 SEQ ID No. 2 所 示)PCR 產物為 46Ibp:AAAGCAGGTATAAGTCTAGGAAATGATTATCATCTTTGATTCTCTTGTCAGAATTTTCTTTCTCAAATC TTGTATAATCAGAGAATTACTACACATGTACAATAAAAATTTCCCCATCAAGATATACAATATATTTTATTTATATT TATAGTTTTAAATTACAACCAGAGCTTGGCATATTGTATCTATACCTTTATTAAATGCTTTTAATTTAATAAATTAT TGTTTTCTCTTAGATATGCAATAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCC[G/A]GGAACCCATAACAAATTACTT AAAAACCTTGCTTTTATGGAAAGTGATATTTTGGAGAAAGTAAAAGAACACCAAGAATCGATGGACATCAACAACCC TCGGGACTTTATTGATTGCTTCCTGATCAAAATGGAGAAGGTAAAATGTTAACAAAAGCTTAGTTATGTGACTGCTT GCGTATTTGTG(CYP2C19基因野生型、Ml突變型PCR產物核苷酸序列分別如SEQ ID No. 3,SEQ ID No. 4 所示)檢測M2突變正向引物(M2-F)為5，-TGTAAAACGACGGCCAGTAGGGAATTCATAGGTAAGATA-3，(核苷酸序列如 SEQ ID No. 5 所示) 檢測M2突變反向引物(M2-R)為5，-AACAGCTATGACCATGGAAGCCTGATCTATATTGG-3，(核苷酸序列如 SEQ ID No. 6 所 示)設計PCR產物為48^p AGGGAATTCATAGGTAAGATATTACTTAAAATTTCTAAACTATTATTATCTGTTAACAAATATGAAGTGTTTTATATCTAATGTTTACTCATATTTTAAAATTGTTTCCAATCATTTAGCTTCACCCTGTGATCCCACTTTCATCC TGGGCTGTGCTCCCTGCAATGTGATCTGCTCCATTATTTTCCAGAAACGTTTCGATTATAAAGATCAGCAATTTCTT AACTTGATGGAAAAATTGAATGAAAACATCAGGATTGTAAGCACCCCCTG[G/A]ATCCAGGTAAGGCCAAGTTTTT TGCTTCCTGAGAAACCACTTACAGTCTTTTTTTCTGGGAAATCCAAAATTCTATATTGACCAAGCCCTGAAGTACAT TTTTGAATACTACAGTCTTGCCTAGACAGCCATGGGGTGAATATCTGGAAAAGATGGCAAAGTTCTTTATTTTATGC ACAGGAAATGAATATCCCAATATAGATCAGGCTTC (CYP2C 19 基因野生型、M2 突變型 PCR產物核苷酸 序列分別如SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 8所示)2) PCR 緩沖液10-50mmol/L Tris.Cl (ρΗ8· 3—8. 8)、50mmol/L NaCl、2-5mmol/LMgC12、5mmol/ L-二硫蘇糖醇、0. 1-0. 5mmol/L Triton X_100、0. 01 % 明膠、5-10% DMSO、10%甘油等。3) dNTP 混合液4種三磷酸核苷酸dATPPI、dCTP、dGTP、dTTP等比例混合，每種dNTP終濃度為 100-200nmol/L。4) DNA 聚合酶25 μ 1反應體系含0. 5-2. 5單位Taq DNA聚合酶。PCR產物純化單元PCR產物純化單位主要目的是清除PCR產物中殘余的引物和dNTP，這些可能干擾 后續DNA測序反應的特異性和效率。主要包括兩種酶核酸外切酶將引物切割為單個堿基； 蝦堿性磷酸酶降解dNTP。核酸外切酶0. 2units/y 1，蝦堿性磷酸酶0. 05units/μ 1，用酶儲 存液制備成5倍濃度的純化試劑。DNA測序單元含一管DNA測序試劑和6管基因分型質控參照品。1、DNA測序試劑包括通用測序引物、BigDye混合液、測序酶。1)通用測序引物Seq-F :5，-TGTAAAACGACGGCCAGT-3，(核苷酸序列如 SEQID No. 9 所示)Seq-R :5，-AACAGCTATGACCATG-3，(核苷酸序列如 SEQ IDNo. 10 所示)濃度200-nmol/L2)、BigDye 混合液含4熒光標記的雙脫氧三磷酸核苷酸(ddNTP)和4種脫氧三磷酸核苷酸(dNTP) 混合液。3)、測序酶上述試劑加酶穩定劑混合為5倍濃度備用。2、質控參照品質控參照為含有擴增片段的重組質粒。經測序鑒定正確的各等位基因型PCR產物 克隆到PMD載體(購自北京天根公司的克隆載體，名稱pGM-T克隆試劑盒，貨號VT302-02) 中，分別構建突變型質粒PMD/M1和pMD/M2及野生型重組質粒pMD/Wl和pMD/W2，轉化大腸 桿菌后，采用商品化質粒DNA提取試劑盒提取質粒，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定質粒質量，紫外 分光光度計測定質粒DNA濃度，用TE稀釋為2ng/y 1濃度，作為PCR擴增的質控標準品。構建4種質粒說明如下
pMD/ffl 野生型Wl質粒，插入片段核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，外顯子5第 681位堿基為G (681G)pMD/Ml 變異型Ml質粒，插入片段核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示，外顯子5第 681位堿基為A (681A)pMD/W2 野生型W2質粒，插入片段核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示，外顯子4第 636位堿基為G (636G)pMD/M2 變異型M2質粒，插入片段核苷酸序列如SEQ ID No. 8所示，外顯子4第 636位堿基為A (636A)pMD/ffl質粒作為W1/W1純合基因型的標準參照品，濃度為2ng/l·! 1。pMD/Ml質粒作為Ml/Ml純合基因型的標準參照品，濃度為2ng/l·! 1。pMD/ffl與pMD/Ml兩種質粒0. 5 0.5比例混合，作為W1/M1雜合基因型標準參照 品，濃度為 2ng/ μ 1 (含 pMD/ffl 與 pMD/Ml 各 lng/ μ 1)。pMD/W2質粒作為W2/W2純合基因型的標準參照品，濃度為2ng/l·! 1。pMD/M2質粒作為M2/M2純合基因型的標準參照品，濃度為2ng/l·! 1。pMD/W2與pMD/M2兩種質粒0. 5 0.5比例混合，作為W2/M2雜合基因型標準參照 品，濃度為 2ng/ μ 1 (含 pMD/W2 與 pMD/M2 各 lng/ μ 1)。測序產物純化及上樣單元含100%乙醇1瓶、70%乙醇1瓶、HIDI上樣緩沖液1管。上述四個單元的試劑組合為完整試劑盒，另附超純滅菌的去離子水100ml，上述試 劑盒于-20°C保存備用。
實施例2 應用本發明所述方法及試劑盒進行CYP2C19突變檢測儀器設備 PCR擴增儀、ABI 3130遺傳分析儀，超凈工作臺、高速臺式離心機、水浴鍋、電泳儀等。
提取基因組DNA 檸檬酸鈉或枸櫞酸鈉抗凝外周靜脈血100 μ 1，加入2-5倍體積人紅細胞裂解液， 混勻后冰浴10-15分鐘，2000rmp離心5分鐘，棄上清收集淋巴細胞，用全血基因組DNA提取 試劑盒提取基因組DNA。全血基因組DNA提取可采用多種方法如堿裂解法、硅膠法、二氧化 硅吸附法、磁珠吸附法、層析柱法等，目前有多種商品化試劑盒供選擇，推薦采用柱層析試 劑盒。PCR 反應1)從實施例1所述試劑盒中取出PCR反應試劑和去離子水，在室溫下融化，30 μ L 反應體系配置如下 16 μ 1基因組DNA 4μ 1ddH2010 μ 1總體積30 μ L 每批次實驗中設立陽性和陰性對照反應 陽性對照反應用質控參照質粒4 μ 1代替基因組DNA。
PCR反應試劑(特異性引物對2對、PCR緩沖液、dNTP混合液和Taq DNA聚合酶)
陰性對照反應用CMH2O代替基因組DNA。充分混勻，2000rpm離心IOsec，放置到PCR儀進行反應。2) PCR反應參數設置95°C 5min (預變性)95 "C30sec
權利要求
1.一種檢測人細胞色素P450 CYP2C19基因突變的方法，包含以下步驟用引物對樣品基因組進行擴增，所述引物包含檢測Ml突變的上下游引物，其核苷酸 分別如SEQ ID No. USEQ ID No. 2所示；以及檢測M2突變的上下游引物，其核苷酸分別如 SEQ ID No. 5、SEQ IDNo. 6 所示；設立質控參照，取擴增產物用核苷酸如SEQ ID No. 9、SEQ IDNo. 10所示的測序引物進 行測序。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述質控參照包含W1/W1純合基因型質 控參照、Ml/Ml純合基因型質控參照、W1/M1雜合基因型質控參照、M2/M2純合基因型質控參 照、W2/W2純合基因型質控參照、W2/M2雜合基因型質控參照。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述質控參照為分別重組了核苷酸如SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 7 或 SEQ IDNo. 8 所示序列的重組質粒的一種。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述質控參照為分別重組了核苷酸如SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4的重組質粒的混合物、分別重組了核苷酸如SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 8所示序列的重組質粒的混合物。
5.一種檢測人細胞色素P450CYP2C19基因突變的試劑盒，包含PCR擴增試劑、PCR產物 純化試劑、DNA測序反應試劑、質控參照品和測序產物純化試劑，其特征在于，PCR擴增引物 為檢測Ml突變引物和檢測M2突變引物，所述檢測Ml突變引物核苷酸分別如SEQID No. 1、 SEQ ID No. 2所示，所述檢測M2突變引物核苷酸分別如SEQID No. 5、SEQ ID No. 6所示；測 序引物核苷酸如SEQ ID No. 9、SEQ IDNo. 10所示。
6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述質控參照品包含W1/W1純合基因型 質控參照、Ml/Ml純合基因型質控參照、W1/M1雜合基因型質控參照、M2/M2純合基因型質控 參照、W2/W2純合基因型質控參照、W2/M2雜合基因型質控參照。
7.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述質控參照為分別重組了核苷酸如 SEQ ID No. 3,SEQ ID No. 4的重組質粒的混合物或分別重組了核苷酸如SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 8所示序列的重組質粒的混合物或任一種重組質粒。
8.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR擴增試劑含pH8.3-8. 8的 Tris. Cl、DCl、MgC12、二硫蘇糖醇、Triton X_100、dNTP混合液、正向和反向引物對、Taq DNA 聚合酶、DMSO和甘油。
9.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR純化試劑包括蝦堿性磷酸酶和 核酸外切酶。
10.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述DNA測序反應試劑包含BigDye染 料、ddNTP和dNTP混合液、測序酶、測序引物。
全文摘要
本發明涉及分子生物學領域，公開了一種檢測人細胞色素P450 CYP2C19基因突變的方法，包含用引物對樣品基因組進行擴增，所述引物包含檢測M1突變的上下游引物，其核苷酸分別如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示；檢測M2突變的上下游引物，其核苷酸分別如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示；設立質控參照，取擴增產物用核苷酸如SEQ ID No.9、SEQ ID No.10所示的測序引物進行測序。本發明還提供檢測人細胞色素P450 CYP2C19基因突變的試劑盒。依據本發明所述方法的檢測結果，進行臨床用藥方案指導和調整，為臨床個體化用藥提供依據，可提高療效，降低毒副作用風險。
文檔編號C12Q1/68GK102140510SQ20101060921
公開日2011年8月3日 申請日期2010年12月27日 優先權日2010年12月27日
發明者白玉杰 申請人:北京迪諾基因科技有限公司