Zdhhc2活性抑制劑在調節脂肪生成中的用途的制作方法

專利名稱：Zdhhc2活性抑制劑在調節脂肪生成中的用途的制作方法
Zdhhc2活性抑制劑在調節脂肪生成中的用途本發明涉及Zdhhc2，一種參與脂肪生成調節的新靶標，并且涉及鑒定該靶標活性調節劑的篩選試驗。另外，本發明涉及Zdhhc2活性調節劑以及它們在調節脂肪生成并因而治療肥胖癥和相關障礙中的用途，尤其是在藥物組合物中的用途。肥胖癥是包括高血壓、冠狀動脈病、高脂血癥、胰島素抵抗和2型糖尿病在內的多種疾病的主要危險因子。因為肥胖癥流行的重要性，所以大量研究都集中在脂肪細胞生物學方面，包括產生新脂肪細胞的發育途徑。脂肪生成是未分化的間充質前體細胞變為成熟脂肪細胞的過程。最近十年內在闡明脂肪細胞分化的分子機制方面已取得很大進展，該機制包括來自諸如CCAAT/增強子結合蛋白(C/ΕΒΡα、α和γ)和核激素受體過氧化物酶體增殖物激活受體Y (PPARy) (Rosen, Ε. D.等，2002)的若干家族的轉錄因子的連續激活。 PPARy被描述為脂肪生成的“主要調節劑”，因為已經證明它是體外和體內脂肪生成的充要條件。近來，已經描述了參與脂肪生成的新轉錄因子，例如KLF家族(KLF2、5和KLF15) (Baner jee, S. S.等，2003 ；Gray, S. Μ.等，2002)、Ebf 家族(Jimenez,Μ. Α.等，2007)和 Krox 20 (Chen, Ζ.等，200 ，表明發生在脂肪生成期間的轉錄級聯遠比先前所想的要復雜的多。 此外，也已描述了信號轉導分子和/或受體，例如分泌蛋白的Wnt家族(Kang S.等，2007)、 音猬蛋白(sonic hedgehog protein)和Notch受體，參與導致脂肪細胞形成的分子事件。近年來，一個新概念涉及在發育中的脂肪墊(fat pad)中導致脂肪細胞發育成為胞外基質(ECM)重塑的分子事件。的確，發育中的間葉細胞經歷了細胞形態學的巨大改變，從柱狀(stelate-shaped)變為球形。細胞形態學上的這些變化與細胞骨架的水平和類型、胞外基質和相關組分例如肌動蛋白、纖連蛋白和膠原蛋白(Gregoire F. M.等，1998 ； Hausman,GJ.等，1996)的巨大變化是平行的。有趣的是，脂肪組織含有豐富ECM，其組成在各種生命中不同，脂肪量各異(Chun，T.等，2006 ；Gagnon, Α. M.，J.等 1998 ；Mehlhom, Α. T.， P 等，2006 ；Nakajima, I. S.等，2002)。ECM不僅影響支撐細胞的結構系統的完整性，而且在分化過程中還通過細胞-表面受體之間、細胞-細胞之間和細胞-基質之間的相互關系而影響發生在細胞內的分子和信號轉導事件。因此，胞外和胞內事件共同調節脂肪生成。在脂肪組織中脂肪的儲存是有限的，超出該限量就會導致脂質在其它組織(尤其是肌肉、肝臟和內分泌胰臟)中蓄積，并由脂肪細胞分泌各種脂肪因子(adipokine)。脂肪組織由位于不同解剖部位的若干沉積物組成，其可來自不同前體并具有不同的生理功能和病理生理作用。與皮下脂肪沉積相反，內臟脂肪沉積或許更能促進代謝綜合征相關缺陷。已經知道在所有器官中大麻素1受體在葡萄糖代謝和2型糖尿病中起到關鍵作用，所述器官即脂肪組織、胃腸道、肝臟、骨骼肌和胰臟。已經證明，利莫那班，第一種用于臨床的選擇性大麻素受體I(CBlR)拮抗劑，能降低食物攝取和體重，因而能改善葡萄糖代謝調節。然而，仍然需要新的治療靶標用于治療肥胖癥。鋅指，DHHC型含有2 蛋白(DHHC-type containing 2 proteins，Zdhhc2)具有棕櫚酰轉移酶活性，并將棕櫚酸部分添加到膜受體、整聯蛋白、caveolin和Wnt蛋白上(Oyama，Τ.等，2000 ；Fukumura，D.等，2003)。如上所述，Wnt蛋白質參與脂肪生成。本發明人目前已經發現Zdhhc2在脂肪細胞分化中起到關鍵性作用。他們提出該酶通過修飾信號轉導分子或胞外基質蛋白例如整聯蛋白而參與脂肪細胞發育。近來已經提出，胞外基質的可塑性不僅在組織完整性方面，而且在脂肪細胞發育方面都起到重要作用。因此，Zdhhc2可能對胞外基質組分有更大影響并且可能在脂肪組織三維發育中起作用。此外，該蛋白質位于所有細胞膜上并可作為新型藥物開發的潛在靶標。因此認為Zdhhc2是用于調節脂肪生成和治療肥胖癥及相關障礙的新的相關靶標。Zdhhc2的抑制也可用于降低脂肪生成，用于減少皮下和內臟脂肪蓄積。發明詳述本發明涉及在脂肪細胞中調節脂肪生成和代謝功能的方法。本發明在于Zdhhc2活性抑制劑在調節脂肪生成中的用途，尤其是在治療肥胖癥及相關障礙中的用途。本發明也涉及含有所述脂肪生成及相關障礙的調節劑的藥物組合物和所述調節劑的篩選試驗。通過轉錄組學(transcriptomic)方法，本發明人在飼喂高脂膳食的C57BI/6小鼠群組中鑒定了其表達與體重增加相關的基因。然后，他們進行了第二次分析，以評價高脂膳食飼喂的小鼠經利莫那班治療所誘導的基因表達的改變。保留了以前在脂肪細胞生物學中從未描述的、并且可能參與重要的生物學過程(例如信號傳導、胞外基質蛋白修飾和基因轉錄)的基因。這些基因對脂肪生成是重要的，尤其是因為它們可能涉及利莫那班降低小鼠脂肪量的機制。在這種情況下，認為Zdhhc2參與脂肪細胞代謝，尤其是作為與脂肪組織的三維發育相關的胞外基質組分調節的主要參與者。更通常地，該基因看來在脂肪生成和肥胖癥的脂肪組織發育控制中起作用。本發明在于Zdhhc2活性調節劑的鑒定。這類調節劑可以是能調節Zdhhc2活性的任何化合物或分子，尤其是小分子、脂質和siRNA。Zdhhc2活性調節劑可通過檢測藥劑調節Zdhhc2活性的能力而得以鑒定。Zdhhc2 抑制劑是能夠部分地或完全地降低或抑制Zdhhc2活性的任何化合物。Zdhhc2抑制劑包括但不限于在胞內隔室中能干擾Zdhhc2與其天然配偶體間相互作用的藥劑以及能在轉錄和翻譯水平上降低Zdhhc2表達的藥劑。⑶9和⑶151是與Zdhhc2專一而直接相互作用的兩種膜蛋白。這些蛋白當被 Zdhhc2棕櫚酰化后能與整聯蛋白結合并允許細胞-細胞連接，參見Resh，MD等Q006)和 Sharma C，等Q008)。因此，可在因Zdhhc2活性的基于帶標記的棕櫚酸殘基的⑶9或⑶151 存在的篩選中檢測Zdhhc2活性調節劑。舉例而言，在一個具體的實施方案中，篩選試驗可進行如下制備來自表達CD9或 ⑶151的重組細胞的膜部分。將該部分與含Zdhhc2活性的樣品(來自患者、來自動物或來自重組細胞的任何來源都適合作為脂肪組織的提取物)以及帶標記的棕櫚酸鹽(作為咕棕櫚酸鹽)和候選化合物一起溫育。然后通過定量測定靶蛋白上存在的帶標記的棕櫚酸鹽， 測定Zdhhc2的棕櫚酰化活性。對于該步驟，用特異性抗體將靶蛋白(⑶9、⑶151或Zdhhc2 的任何特異性靶標)免疫沉淀。定量測定在保留部分中檢測的％發射。結果，所測信號量與樣品中存在的Zdhhc2活性成比例。因此，當檢測到Zdhhc2活性比不含候選化合物的對照樣品降低時，就可鑒定抑制劑化合物。
在另一個實施方案中，通過RNA干擾，使用小干擾RNA(SiRNA)或小發夾 RNA(shRNA)調節Zdhhc2表達。因此，一方面，本發明涉及能介導針對Zdhhc2基因表達的RNA干擾(RNAi)的雙鏈核酸分子，包括小核酸分子，例如小干擾核酸(siNA)、小干擾 RNA(siRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、小RNA(miRNA)和短發夾RNA(shRNA)分子，包括這類小核酸分子的混合物和這類小核酸分子的合適制劑。RNAi介導的基因沉默現象最初是在秀麗新小桿線蟲(Caenorhabditis elegans) 系統中描述的，其中報道了長雙鏈RNA分子的顯微注射。RNA介導的基因失活機制看來在迄今為止所研究的各種生物中有稍許差異。然而，在所有系統中，RNA介導的基因沉默是基于由內切核酸酶Argonauts誘導的靶mRNA的轉錄后降解，所述酶是所謂的RISC復合物的一部分。降解的序列特異性是由裝載在RISC復合物上的特定反義RNA鏈的核苷酸序列決定的。將SiRNA化合物引入細胞導致細胞靶mRNA水平降低，并因此導致相應多肽水平以及相應酶活性水平同時降低。如本文所述，對Zdhhc2具有特異性的SiRNA可用作Zdhhc2活性調節劑，以降低 Zdhhc2mRNA的翻譯。更具體地講，對Zdhhc2具有特異性的siRNA可用于減少脂肪生成并因此而治療肥胖癥及相關疾病。在一個實施方案中，本發明的特征在于雙鏈核酸分子，例如siRNA分子，其雙鏈中的一條包含與靶Zdhhc2核酸分子中的預定Zdhhc2核苷酸序列或其部分具有互補性的核苷酸序列。可使用經修飾或未經修飾的RNA分子。修飾的實例是摻入三環-DNA，以允許改善寡核苷酸的血清穩定性。在一個實施方案中，預定的Zdhhc2核苷酸序列是本文所述的Zdhhc2核苷酸靶序列(SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 3)。因為跨越不同生物或不同受試者的基因組具有序列變異性的可能性，所以對于廣泛治療應用的siRNA分子的選擇可能包括基因的保守區。因此在一個實施方案中，本發明涉及靶向基因組保守區或跨越不同靶的保守區的siRNA分子。經設計用于靶向不同靶的保守區的siRNA分子使得對在不同患者群體中有效抑制Zdhhc2基因表達成為可能。在一個實施方案中，本發明特征在于下調靶Zdhhc2基因表達或弓I導靶RNA切割的雙鏈短干擾核酸分子，其中所述siRNA分子包含約15至約28堿基對，優選19堿基對。本發明的siRNA或RNAi抑制劑可以是經化學合成的、由載體表達的或經酶促合成的。在一個具體的實施方案中，對Zdhhc2具有特異性的siRNA是具有序列SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 6的shRNA。在一個優選的實施方案中，對Zdhhc2具有特異性的siRNA 是具有序列SEQ ID N0. 5的shRNA。本發明siRNA的使用導致相應野生型細胞的mRNA水平減少5% -20%，優選地減少5% -15%，更優選減少5% -10%。野生型細胞是在將編碼 siRNA化合物的核酸引入之前的細胞，其中靶向的mRNA未被siRNA化合物降解。可通過任何合適途徑給予Zdhhc2活性抑制劑，或局部或系統給予，取決于分子特性和預期效果。就雙鏈分子而言，可將siRNA局部直接給予靶組織，或者就shRNA而言，可將siRNA通過載體給予，按照本領域所用的方案。 在一個實施方案中，使用shRNA分子來獲取RNAi。SiRNA構建體編碼莖-環RNA。在引入細胞之后，該莖-環RNA被加工為雙鏈RNA化合物，其序列對應于原始RNA分子的莖。可以按照本領域已知的任何方法(包括體外和體內方法)制備這樣的雙鏈RNA，所述方法例如但不限于以下文獻所述的方法Sahber等(1987)，Miattacharyya等，(1990)或US 5，795，715。對于體內給予，可將shRNA引入質粒中。質粒來源的shRNA具有提供與報道基因或選擇標記組合，并通過病毒或非病毒載體遞送的選擇的優勢。將shRNA引入載體、再引入細胞，確保shRNA連續表達。載體通常傳給子細胞，允許將基因沉默遺傳下去。本發明也提供包含用于表達本發明shRNA的多核苷酸的載體。這些載體是可以通過不同合適途徑給予的例如AAV載體、逆轉錄病毒載體(尤其是慢病毒載體)、腺病毒載體，所述途徑包括靜脈內途徑、肌內途徑、皮下組織直接注射或按照常規實踐選擇的其它靶向組織直接注射。SiRNA的給予途徑各不相同，包括局部遞送、直接遞送乃至全身靜脈內給予。局部遞送的優勢是功效所需siRNA劑量非常低，因為將分子注射到靶組織內或附近。局部給予也允許集中遞送siRNA。對于這樣的直接遞送，可使用裸siRNA。“裸siRNA”是指遞送 siRNA(未經修飾或經修飾)的鹽水或其它簡單賦形劑例如5%右旋糖。這類分子的配制和給予的方便性使其成為具有吸引力的治療方法。也可將裸DNA制備到脂質尤其是脂質體中。siRNA的系統應用通常具有較低侵入性，而且更重要的是，不限于足以從外部進入的組織。對于系統遞送，可將siRNA與膽固醇綴合物、脂質體或基于聚合物的納米粒一起配制。脂質體是傳統使用的，以提供增強的藥物動力學性能和/或降低的毒性概況。它們允許大量而重復的成功體內遞送。當前，基于脂質的siRNA系統遞送(尤其是遞送到干細胞的)制劑的應用，看來代表了用于開發RNAi治療藥的一個最有希望的近期機會。含聚合物例如動態聚合綴合物(例如與N-乙酰基葡糖胺偶聯(用于肝細胞靶向)的聚合綴合物)和基于環糊精的納米粒的制劑允許靶向遞送和核內體逃逸機制兩者。其它聚合物例如 atelocollagen和脫乙酰殼多糖允許對皮下腫瘤異種移植物以及骨轉移具有療效。也可將SiRNA與經設計有助于靶向遞送的分子實體直接綴合。假定siRNA雙鏈體的特性，無活性或有義鏈的存在是綴合的理想位點。綴合物的實例是親脂性綴合物，例如膽固醇，或基于適體的綴合物。陽離子型肽和蛋白質也用于與siRNA雙鏈體的帶負電荷的磷酸主鏈構成復合物。這些不同的遞送方式可用于將Zdhhc2 siRNA靶向到相關組織(尤其是脂肪組織)。對于這樣的靶向，可將siRNA和與前脂肪細胞和脂肪細胞相互作用的不同分子綴合在一起，所述分子例如與脂質轉送蛋白、受體、胰島素受體或本領域已知的任何分子相互作用的配體。本發明的另一目的是藥物組合物，其包含作為有效成分的本發明Zdhhc2調節劑。 這些藥物組合物包含有效量的至少一種本發明的調節劑，以及至少一種藥學上可接受的賦形劑。根據藥物形式和所需給藥途徑，在本領域技術人員已知的常用賦形劑中選擇所述賦形劑。本發明也在于用于調節脂肪生成的方法。這樣的方法可用于治療肥胖癥或相關疾病。也可使用這種方法，從而為了美容目的而降低脂肪蓄積。
Zdhhc2活性調節劑可用于調節脂肪生成的治療藥，尤其是治療和預防肥胖癥相關障礙，特別是2型糖尿病、高脂血癥、高血壓、胰島素抵抗、心血管障礙和更常見的代謝綜合征。按照其另一方面，本發明涉及用于治療上述病理學的方法，所述方法包括在體內給予患者有效量的本發明Zdhhc2調節劑。合適的單位劑型包括口服形式，例如片劑、軟質或硬質明膠膠囊劑、粉劑、顆粒劑和口服溶液劑或混懸劑，舌下、口腔、氣管內、眼內、鼻內形式，通過吸入、局部、透皮、皮下、 肌內或靜脈內形式，直腸形式和植入物。對于局部應用，本發明的化合物可作為乳膠劑、凝膠劑、軟膏劑或洗劑來使用。按照常規實踐，適合各患者的劑量是由醫師按照給藥途徑、患者體重和反應來決定。Zdhhc2抑制劑也可用于美容應用，以降低難看的脂肪蓄積。對于美容應用，可將Zdhhc2抑制劑摻入到合適制劑中，用于局部用途。Zdhhc2抑制劑可以是小分子或siRNA，如前所述。參考以下實施例來描述本發明，所述實施例僅僅是說明性的，并不旨在限制本發明。附圖簡述

圖1 關鍵性脂肪組織調節基因的選擇。維恩圖解顯示基于以下標準的基因選擇。 A)通過高脂飼喂，在皮下(SCAT或Sq)和內臟(VAT)中類似調節。選擇151個基因(對于 SCAT有48個，對于VAT有88個)。B)在這151個基因中，選擇受到利莫那班治療而調節的基因(對于SCAT有14個，對于VAT有M個)。這導致通過高脂飼喂和利莫那班，選出同時在兩類組織中都得以調節的34個基因。在這些基因中，16個的表達水平與L、M和H組的體重相關(肥胖癥相關的)，而在各亞組中18個被HFD調節至相同水平(非肥胖癥相關的)。圖2 在不同組織和細胞類型中Zdhhc2的表達。A)通過RT-PCR分析Zdhhc2表達，顯示以下各小鼠組織中的mRNA表達脾、肌肉(腓腸肌)、心、肺、腎、肝、褐色脂肪組織 (BAT)、皮下脂肪組織(SCAT)和內臟(VAT)脂肪組織；結果經參考肝臟基礎表達而標準化。 B至E 經RT-PCR測定的Zdhhc2的mRNA水平。B)在野生型和0b/0b小鼠(n = 5) *的SCAT 和VAT中，ρ < 0. 05，數據表示為平均值士sd并表示為相對于設置在1的對照SCAT的增加倍數。C)在小鼠的SVF和分離脂肪細胞中(每次提取η = 5只小鼠合并，實驗重復3次，顯示代表性實驗)。數據表示為相對于SCAT SVF表達的增加倍數。D)在人體全組織SCAT和 VAT、分離的脂肪細胞、分離的前脂肪細胞和體外分化的脂肪細胞中。數據表示為相對于任意設置在1的全組織SCAT表達的水平。E)在3T3-L1細胞中，在DMI治療前2天和在DMI 治療后7天。N= 3組細胞。數據表示為相對于第0天表達的水平。圖3 由shRNA導致的Zdhhc2表達和活性的敲減。A) 3T3-L1細胞用含有針對螢光素酶的shRNA(shLuc)或Zdhhc2 (shZdhhd)的逆轉錄病毒轉導。在分化前通過RT-PCR測定 mRNA水平。B)在第9天分化的3T3-L1的油紅0圖像。C)在第9天在與B)同樣的細胞中經RT-PCR測定aP2 (分化標記)mRNA表達。結果表示為平均值士 scfP < 0. 05廣P < 0. 01。 η = 3。
材料與方法動物治療給易患肥胖癥的C57BL/6J小鼠( 飼喂高脂膳食(HFD)達6個月。HFD 6個月之后，小鼠表現出分散的體重并具有不同程度的葡萄糖不耐受(經葡萄糖耐量試驗測定)。將 HFD小鼠分為3組，其都表現出相同的葡萄糖不耐受水平，但具有低(L)、中(M)或高(H)體重，然后用溶媒或利莫那班(10mg/kg/天)治療它們，同時用正常飼料(normal choff, NC) 飼喂小鼠達1個月，并將其體重標準化。治療也標準化葡萄糖耐量，如前所述05)。RNA制備、標記和在cDNA微陣列上雜交。使用peqGOLD TrifaStTM(peqlab)和氯仿-異戊醇Q4 1)提取，從內臟和皮下脂肪組織中提取來自每組5只不同小鼠的RNA。RNA用異丙醇沉淀并通過RNeasy柱 ^jiagen)純化。在用Bioanalyzer 2100 (Agilent)擴增前后檢查RNA質量。RNA經逆轉錄，然后用MessageAmp 試劑盒(Ambion)擴增RNA。類似地擴增Mouse Universal Reference(Clontecti)，并按照已公開的方案(de Fourmestraux 等，J. Biol. Chem. 2004279 50743-53)，通過間接技術將脂肪組織和參考RNA用Cy5和Cy3標記。將標記的RNA雜交到含有17664cDNA的微陣列(由洛桑大學DNA陣列部門(DNA Array Facility of the University of Lausanne)制備)上。按照先前已公開的方法(deFourmestraux等，J. Biol. Chem. 2004279 =50743-53)進行掃描、成像和質量控制分析。數據表示為1呢2強度比(Cy5/ Cy3)，用印刷頭(print tip)局部加權線性回歸(Lowess)方法標準化并根據點質量(spot quality)禾口不完全注釋(incomplete annotation)過濾。所有分析者β用 Comprehensive R Archive Network(cran. us. r-project. org/)提供的用于統計學計算的R軟件進行。細胞培養3T3-L1 細胞在含有 10% FBS (Gibco)的 DMEM(Gibco)上，在 5% CO2 中培養。經逆轉錄病毒感染(見下文)之后，讓細胞在含有10 % FBS的DMEM中，在100-mm或者60_mm碟中生長到匯合。一旦達到匯合，將細胞暴露給含有以下成分的分化培養基地塞米松(ΙμΜ)、 胰島素(5yg/ml)和異丁基甲基黃嘌呤(0.5yM)(DMI)。2天后，將細胞維持在含胰島素 (5ug/ml)的培養基中，直到第7天準備收獲。油紅0染色分化7-10天后，細胞在PBS中洗滌一次并用甲醛(Formalde-fresh ；Fisher)固定 15分鐘。將0. 5g油紅0溶于IOOml異丙醇中，制備染色液；將60ml該溶液與40ml蒸餾水混合。在室溫下經過1小時后，過濾染色液并將其加入到碟中持續4小時。再除去染色液， 細胞用蒸餾水洗滌2次。shRNA 構建體用RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen(Clontech)構建 shRNA。通過查詢 Whitehead siRNA 算法(http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)以及 Clontech 的 siRNA 設計師軟件(http://bioinfo. clontech. com/rnaidesigner/)，設計 Zdhhc2 的靴序列；使用EcoRI和BamHl限制位點，將這兩種算法代表的至少2個序列亞克隆到pSIREN載體(Clontech) 0選擇下列Zdhhc2靶序列，SEQ ID N0. 5和6作為陰性對照，我們使用針對螢光素酶的下列siRNA序列=SEQ ID N0. 7。shRNA構建體的轉染
在使用(14)所述的磷酸鈣方法用含有Zdhhc2 cDNA的表達載體和RNAi-Ready pSIREN-RetroQ hGreen載體(表達針對熒光素酶的shRNA (對照shLUC)或針對Zdhhc2的 shRNA (shZdhhc2))共轉染的^3THEK細胞中測定shRNA的特異性。轉染后M小時，對細胞 RNA提取物進行RT-PCR分析。逆轉錄病毒構建體的產生和逆轉錄病毒感染在RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen(pSIREN Clontech)中構建逆轉錄病毒。 使用J0rdan，M.等Q004)所述的磷酸鈣方法，將病毒構建體連同編碼gag-pol和VSV-G蛋白的構建體一起轉染到四3冊1(包裝細胞中。在3μπι Trichostatin A(Sigma)存在下，在48 小時后收獲上清液，然后立即使用或者快速冷凍并貯存于_80°C備用。在polybrene G μ g/ ml)存在下將病毒上清液加入到細胞中持續6小時并用新鮮培養基稀釋2倍再持續15小時。從脂肪組織中分離脂肪細胞和基底血管部分(SVF)通過(X)2吸入，對8周齡雄性C57BL/6J小鼠(n = 6-8)實施安樂死并收集附睪 (內臟)脂肪組織和皮下脂肪組織，然后放入含lOmg/mL低脂肪酸的BSA(Sigma-AldriCh， St. Louis, Ml)的DMEM培養基中。將組織切成碎片，再在37°C，在0. 12單位/mL膠原酶 I型(Sigma)中，在搖動的水浴(80Hz)中消化1小時。然后樣品通過無菌250 μ m尼龍網 (Scrynel NY250HC，Milian)過濾，以除去未消化片段。所得懸浮液在1100RPM離心10分鐘， 從脂肪細胞中分離出SVF。取出脂肪細胞并用DMEM緩沖液洗滌。再將它們懸浮在peqGOLD Trii^ast試劑(Axonlab)中并按照制造商使用說明分離RNA。將SVF部分在紅細胞裂解緩沖液(0. 154mM NH4ClUOmM KHCO3>O, ImM EDTA)中溫育2分鐘。再將細胞在1100RPM離心 10分鐘并重懸于500 μ 1 peqGOLD TriFast試劑(Axonlab)中，進行RNA分離。RNA提取和實時PCR按照制造商使用說明(Axonlab)，使用peqGOLD TriFast試劑，從培養細胞中分離總RNA。使用隨機引物和Superscript II (Invitrogen)，自0. 5 μ g總RNA合成第一條鏈 cDNAo 使用 Power SYBR Green Mix (Applied Biosystem)進行實時 PCR。下列引物用于小鼠基因mZdhhc2-F(SEQ ID NO. 8)和mZdhhc2_R(SEQ ID NO. 9)，用于Zdhhc2 ；Ap2_F(SEQ ID NO. 16) ；Ap2-R(SEQ ID NO. 17)，用于 m 親環蛋白 A-F(SEQ ID NO. 12) ；m 親環蛋白 A-R(SEQ ID NO. 13)、m 親環蛋白 A-F (SEQ ID NO. 12) ；m 親環蛋白 A-R(SEQ ID NO. 13)。下列引物用于人基因:hZdhhc2-F SEQ ID NO. 10 ;hZdhhc2_R SEQ ID NO. Ilh 親環蛋白 A-F SEQ ID NO. 14 ；h 親環蛋白 A-R SEQ ID NO. 15。RNA 印跡按照制造商使用說明(Axonlab)，使用peqGOLD TriFast試劑從不同小鼠組織中分離總RNA。將總RNA(8 μ g)在1. 2%瓊脂糖/甲醛凝膠上分離并向尼龍膜上轉移過夜。 為了控制RNA載量，膜先用亞甲藍染色，隨后再雜交。為了檢測Zdhh2信號，使用來自全長 cDNA小鼠質粒(Open Biosystem)的探針。探針通過用[α-32P] dCTP (Amersham)隨機引發 (random priming)標記。按照制造商使用說明(Mratagene)，使用Quiddiib方法進行雜交和洗滌。在_80°C將印跡暴露給HyperfiIm ECL(Amersham)達1天或幾天，取決于信號強度。結果
實施例1 微陣列結果對微陣列據進行生物信息學分析，以鑒定滿足以下三個標準的基因(i)受到高脂喂養的調節，( )通過高脂飼喂，同時在內臟脂肪(VAT)和皮下脂肪(SCAT)中的表達類似被調節，和(iii)通過利莫那班治療對其表達的類似標準化(圖1)。所用的cDNA微陣列上存在的大約17000基因靶標中，有34個基因滿足這些標準，列于下表1。引人注目的是，這些基因中有 10 個(Cavl、Fgfl、Fndc3b、Kif5b、Mest、Npr3、Pik3ca、Sparc、VIdIr 和 Wwtri)先前已知是脂肪組織發育和功能的重要調節劑。這些基因中的某些的表達水平與體重增加相關(見表1中的灰色部分)，表明在肥胖癥期間在脂肪組織增生和/或肥大中起到潛在作用。這些結果證實用于鑒定肥胖癥治療性治療的可能新靶標的方法。最重要的是，表1所提及的基因中的許多，在脂肪組織發育或生物學方面從未研究過。這些基因屬于以下功能分類胞外基質/細胞相互作用、細胞骨架、胞內信號轉導、酶和轉錄因子/輔因子。它們可能參與組織重塑，以及尤其是脂肪細胞發育。這些基因之一， Zdhhc2基因，及其在脂肪細胞生物學中的作用，在本文中給出并構成本發明的一方面。Zdhhc2具有棕櫚酰轉移酶活性，并將棕櫚酸部分添加到膜受體、整聯蛋白、 caveolin和Wnt蛋白上03，6)。Wnt蛋白質參與脂肪生成。因此，該酶可能通過修飾信號轉導分子或胞外基質蛋白例如整聯蛋白而參與脂肪細胞發育。近來已經提出，胞外基質的可塑性不僅在組織完整性方面，而且在脂肪組織發育方面都起到重要作用00，7，19)。因此根據這一新觀念，對Zdhhc2的研究有極大興趣。
權利要求
1.Zdhhc2活性抑制劑在調節脂肪生成中的用途。
2.權利要求1的用途，其中所述調節劑用于降低脂肪生成。
3.用于治療肥胖癥及相關障礙的權利要求1或2的用途。
4.用于降低內臟和/或皮下脂肪蓄積的權利要求1或2的用途。
5.前述權利要求中任一項的用途，其中所述抑制劑是小分子。
6.前述權利要求中任一項的用途，其中所述抑制劑是小干擾RNA。
7.權利要求6的用途，其中所述siRNA是具有對應于SEQID NO. 5或SEQ ID NO. 6的序列的shRNA。
8.作為對Zdhhc2轉錄抑制具有特異性的siRNA的核酸。
9.具有序列SEQID NO. 5或SEQ ID NO. 6的核酸。
10.能調節Zdhhc2酶活性的化合物的鑒定方法，其中在加入候選化合物后在含有 Zdhhc2活性的樣品中測定棕櫚酰化活性并與對照樣品中存在的棕櫚酰化活性進行比較，并且其中當與對照樣品中所測活性相比棕櫚酰化活性降低時，就鑒定出候選化合物。
11.包含Zdhhc2活性抑制劑和至少一種藥學上可接受的賦形劑的組合物。
12.用于制備抑制脂肪生成的藥物的權利要求11的組合物。
13.用于治療肥胖癥及相關疾病的權利要求12的組合物。
14.用于減少內臟和/或皮下脂肪蓄積的權利要求11的組合物。
15.脂肪生成的調節方法，所述方法為給予有需要的患者Zdhhc2抑制劑，以調節脂肪生成。
全文摘要
本發明涉及Zdhhc2，一種參與脂肪生成調節的新靶標。使用siRNA方法，本發明人證明在脂肪組織中Zdhhc2活性降低導致脂肪生成降低。因此，本發明涉及Zdhhc2活性調節劑以及鑒定該靶標活性調節劑的篩選試驗，并涉及它們在調節脂肪生成并因而治療肥胖癥和相關障礙中的用途，尤其是在藥物組合物中的用途。
文檔編號C12N15/11GK102459594SQ201080028433
公開日2012年5月16日 申請日期2010年5月19日 優先權日2009年5月20日
發明者B·托倫斯, C·波辛, D·哈爾, M·吉梅內茨 申請人:賽諾菲