新的幽門螺桿菌菌株及其用途的制作方法

專利名稱：：新的幽門螺桿菌菌株及其用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及對于遞送生物活性劑有用的幽門螺桿菌的菌株。
背景技術：
：活的細菌，例如益生菌或活的減毒病原體，代表了遞送一系列生·物活性劑，如疫苗抗原、生物活性分子或甚至DNA的引人注目的運載體(vehicle)。細菌遞送運載體的固有優勢包括口服施用，以及化合物在一段延遲的時間內的持續釋放消除了重復服藥的必要。目前商業上可獲得的疫苗和藥物主要是胃腸外施用、需要多次服用并依賴于醫務人員和冷鏈的。由于活細菌運載體可以口服遞送，可能只需要單一服用并能遞送大分子，例如，多個抗原，它們為常規的預防和治療劑提供了備選方案。此外，細菌運載體非常適合大規模生產和配制，并且凍干時穩定。這些屬性使這種遞送形式很有吸引力，并可能導致各種疫苗和藥物的合規性提高，分配更佳和成本降低。已經推薦了幾種基于多種細菌，包括志賀氏菌屬菌種(Shigellaspp.)(美國專利No.7，235，234)、沙門氏菌屬菌種(Salmonellaspp.)(美國專利申請No.20090022691)和乳桿菌屬菌種(Lactobacillusspp.)(美國專利申請No.20090074734)的細菌遞送系統，但在這些系統中仍存在一些固有問題。一般而言，為了用作遞送運載體，要操作細菌以產生具有所要求特性的菌株。重要的是，應確保細菌的安全性概況(profile)。傳統的用作遞送運載體的細菌已經減毒為低病原性或非致病性；然而，由于致病基因可以重新獲得并導致細菌回復為具有致病能力的有毒形式，很難保證這些細菌的安全。此外，操縱細菌菌株使其可進行轉化或定殖(colonize)于動物模型，可導致間接的(secondary)不良特性的產生，或最低限度妨礙實驗和細菌遞送運載體轉入臨床的延遲。例如，為使實驗可以在動物模型，如小鼠中進行，對于菌株的操作可導致此株系不定殖于目標宿主，通常為人。因此，應該盡可能地避免為產生具有所需特點的菌株而操縱細菌。本發明的發明人先前已經建議在細菌遞送系統中使用幽門螺桿菌(美國專利申請號20070134264)，其解決了上述鑒定的許多問題；然而，盡管美國專利申請號2007013464提供了豐富的關于使用幽門螺桿菌作為細菌遞送運載體的信息，開發具有特定性質的特定細菌菌株將是有用的。
發明內容在第一個方面，本發明提供幽門螺桿菌的分離的菌株，其具有以下特征(a)低致病性；(b)天然轉化能力；和(C)無需宿主適應而定殖于小鼠胃粘膜的能力。幽門螺桿菌具有獨特的特點，使其適合用作生物活性劑的活細菌遞送運載體。本發明的幽門螺桿菌菌株分離自無癥狀并顯示最小的病理學的個體，使菌株安全用于人。此夕卜，本發明的菌株是天然可轉化的并且能夠定殖于幽門螺桿菌-小鼠模型而無需事先適應。這促進了臨床前試驗并意味著最小程度地操縱菌株，允許準確、直接地翻譯對人的結果。因此，本發明的幽門螺桿菌菌株高度適于用作活細菌遞送運載體。在一些實施例中，本發明的幽門螺桿菌能夠在哺乳動物受試者中形成慢性感染。在一些實施例中，本發明的幽門螺桿菌菌株不表達一種或多種功能性致病因子，例如vacAsi或cagA。在第二個方面，本發明提供幽門螺桿菌的分離的菌株，其或者是(i)vacAsi或cagA陰性；或者是(ii)vacAs2和cagA陽性；并且其中所述的幽門螺桿菌菌株具有(a)低致病性，(b)天然轉化能力'及(c)無需宿主適應而定殖于小鼠胃粘膜的能力。在一些實施例中，本發明提供幽門螺桿菌菌株，其具有選自下組的菌株的特性以登錄號V09/009101保藏于國家計量研究院(NationalMeasurementInstitute)的0ND737；以登錄號V09/009102保藏于國家計量研究院的0ND738；以登錄號V09/009103保藏于國家計量研究院的0ND739；以登錄號V10/014059保藏于國家計量研究院的0ND248；以登錄號V10/014060保藏于國家計量研究院的0ND256;和以登錄號V09/009104保藏于國家計量研究院的0ND740，或其具有如上述定義的能力的突變體或衍生株。在第三個方面，本發明提供幽門螺桿菌菌株0ND737，以登錄號V09/009101保藏于國家計量研究院。在第四個方面，本發明提供幽門螺桿菌菌株0ND738，以登錄號V09/009102保藏于國家計量研究院。在第五個方面，本發明提供幽門螺桿菌菌株0ND739，以登錄號V09/009103保藏于國家計量研究院。在第六個方面，本發明涉及幽門螺桿菌菌株0ND740，以登錄號V09/009104保藏于國家計量研究院。在第七個方面，本發明涉及幽門螺桿菌菌株0ND248，以登錄號V10/014059保藏于國家計量研究院。在第八個方面，本發明涉及幽門螺桿菌菌株0ND256，以登錄號V10/014060保藏于國家計量研究院。可轉化分離的幽門螺桿菌菌株以產生表達感興趣的基因的重組菌株。在一些實施例中，感興趣的基因由核酸編碼，其優選是以分離的形式獲得的。本領域技術人員應知道，本發明的分離的核酸分子可以是cDNA、基因組DNA、RNA、或其雜合分子。優選地，分離的核酸是cDNA。優選地，分離的核酸整合入重組菌株的基因組中。分離的核酸可編碼與幽門螺桿菌同源或異源的多肽。在某些方面，分離的核酸編碼生物活性劑如抗原、有機分子、藥理劑例如治療劑或預防劑，如基因產物或基因序列(分離的核酸)。幽門螺桿菌感染的天然特征，如特異性、非保護的循環抗體和終身持久性的存在，意味著幽門螺桿菌在遞送疫苗抗原中特別有用。因此，在一些實施例中，本發明提供通過施用表達感興趣的抗原的幽門螺桿菌的重組菌株，在個體中誘導抗體應答的方法。在第九個方面，本發明提供鑒定適于體內遞送生物活性劑的幽門螺桿菌菌株的方法，包括(a)從無幽門螺桿菌感染癥狀的個體分離幽門螺桿菌菌株；(b)確定所述菌株是否具有天然轉化能力'及(C)確定所述菌株是否具有無需宿主適應而定殖于小鼠胃粘膜的能力，其中具有天然轉化能力和無需宿主適應而定殖于小鼠胃粘膜的能力的菌株適于體內遞送生物活性劑。在第十一個方面，本發明提供一個優化的螺桿菌屬感染的動物模型，其中所述動物以富含酪蛋白的食物和/或酸化水飼養，以使相對于沒有以富含酪蛋白的食物和/或酸化水飼養的動物，其幽門螺桿菌的定殖是增強的。在一些實施例中，所述動物以富含酪蛋白的食物和酸性水飼養，其中水是約pH2。在一些實施例中，所述動物是小鼠。在第十二個方面，本發明提供隨機擴增的多態DNA聚合酶鏈式反應用于鑒定螺桿菌屬菌種的用途。在一些實施例中，使用具有SEQIDNO:I所示序列的正向引物和具有SEQIDNO2所示序列的反向引物通過聚合酶鏈式反應擴增螺桿菌屬DNA。附圖簡述圖I:測試幽門螺桿菌臨床分離株的天然轉化。基于其抗生素抗性表型，將來自Karolinska(K)研究所的14株和來自SCGH(H)的28株鑒定為可用DNA轉化的。通過選擇平板上獲得的轉化菌落數指不可轉化的菌株+低(<20),++(20-50),+++(>50),++++(>100)。圖2:測試可轉化的幽門螺桿菌菌株在DBA/2小鼠模型的胃部定殖。小鼠(n=3)感染IxlO9CFU/ml的細菌。4周后培養來自小鼠胃組織的細菌并進行定量。根據獲得的菌落數對定殖水平進行分級+低(<20)，++(20-50)，+++(>50)，++++(>100)。圖3:測試可轉化的幽門螺桿菌菌株在DBA/2小鼠模型的胃部定殖。小鼠(n=10-12)感染IxlO9CFU/ml的細菌。4周后培養來自小鼠胃組織的細菌并進行定量。通過每組中感染幽門螺桿菌的小鼠數目確定定殖頻率。結果表示為個體和每組平均％定殖。圖4:測試幽門螺桿菌菌株在DBA/2小鼠模型中的長期胃部定殖。小鼠(n=4-6)感染IxlO9CFU/ml的細菌。6個月后培養來自小鼠胃組織的細菌并進行定量。通過每組中感染幽門螺桿菌的小鼠數目確定定殖頻率。結果表示為個體和每組平均％定殖。圖5:使用定殖和非定殖的幽門螺桿菌菌株感染DBA/2小鼠并測量幽門螺桿菌特異性免疫反應。小鼠(n=5)感染IxlO9CFU/ml的細菌。三個月后收集血清并通過ELISA測量IgG特異性抗體。結果表示為405nm的0D。圖6:使用定殖的幽門螺桿菌菌株感染DBA/2小鼠并測量幽門螺桿菌特異性免疫反應。小鼠(n=5)感染IxlO9CFU/ml的細菌。在感染后1、2、3和5個月收集血清并通過ELISA測量IgG特異性抗體。結果表示為405nm的0D。圖7:測試幽門螺桿菌菌株在C57BL/6小鼠模型中2周后的胃部定殖。小鼠(n=3)感染IxlO9CFU/ml的細菌。培養來自小鼠胃組織的細菌并進行定量。通過每組中感染幽門螺桿菌的小鼠數目確定定殖頻率。結果表示為個體和每組平均％定殖。圖8:測試幽門螺桿菌菌株在各小鼠株系中在經口感染后4周的胃部定殖。小鼠(n=10)感染IxlO9CFU/ml的細菌。培養來自小鼠胃組織的細菌并進行定量。通過每組中感染幽門螺桿菌的小鼠數目確定定殖頻率。圖9:幽門螺桿菌菌株基因型與臨床病理學。圖10:使用來自經口感染幽門螺桿菌菌株3個月后的DBA/2小鼠的匯集的血清的免疫印跡。小鼠(n=5)感染IxlO9CFU/ml的細菌。收集血清并匯集用于針對細菌全細胞裂解液(w)和外部(O)和內部⑴膜蛋白進行免疫印跡分析。圖11:使用引物1254或1281擴增的幽門螺桿菌菌株的RAPDPCR0泳道M或Ml:Ikb的DNA階梯標記物(ladder)，泳道N:各引物的陰性對照，泳道OND:分別是單一的幽門螺桿菌菌株，泳道M2，IOObp的DNA階梯標記物。命名參考見表10。本發明優選實施方案的說明在詳細描述本發明之前，可以理解的是本發明不限于特別例示的方法而當然可以有所變化。也是可以理解的是，本文所使用的術語只是出于描述本發明的特定實施方案的目的，而不意欲限制，其只受限于所附的權利要求。本文引用的所有的出版物、專利和專利申請，無論前文或下文，通過提述以其整體并入本文。然而，引用本文中提及的出版物目的在于描述和披露出版物中報道的、可能與本發明相關而使用的試驗方案、試劑和載體。此處任何信息均不應理解為承認本發明無權早于憑借先前發明的這些公開內容。此外，本發明的實施，除非另有指示，在本領域的技能內采用傳統的微生物學、免疫學和分子生物技術和藥理學。這些技術對于技術人員是熟知的，并在文獻中已充分解釋。參見，例如Prescott等，“Microbiology”(1999)第4版，WCBMcGraw-Hi11;Sambrook等，“MolecularCloningALaboratoryManual”(1989)(2001),第2和3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,和Roitt等，“Immunology”(1998)，第5版，Mosby。必須指出的是，本文中以及所附權利要求中使用的，單數形式的“a”、“an”和“the”包括復數涵義，除非上下文清楚地另有規定。因此，例如，提及“核酸”包括多種這樣的核酸，而提及“分離的菌株”是指一個或多個菌株，等等。除非另有定義，否則，本文使用的所有技術和科學術語與本發明所屬
技術領域：
普通熟練技術人員的通常理解具有相同的涵義。雖然類似或等同于本文描述的任何材料和方法可以用來實施或測試本發明，現在描述優選的材料和方法。在隨后的權利要求和本發明前面的描述中，除由于表達語言或必然含意而上下文另有要求外，詞語“包括”或變型，如“包含”或“含有”，以廣義范圍的含義使用，即指定存在所述特征，但不排除存在或添加本發明的多個實施方案中的其他特征。本文所述的術語“基本上由...組成”用來定義組合物和方法時，是指排除對組合具有任何實質意義的其他元素。因此，如本文定義的基本上由元素組成的組合物不排除來自分離和純化方法的痕量污染物和藥學上可接受的載體，如磷酸鹽緩沖鹽水、防腐劑等。“由...組成”是指排除多于痕量元素的其他成分和用于施用本發明的組合物的基本方法步驟。由這些轉變術語的每一個所限定的實施例在本發明的范圍內。本發明涉及作為活細菌遞送運載體有用的幽門螺桿菌菌株。這些菌株的一個關鍵特征是其低致病性。術語“低致病性”是指幽門螺桿菌菌株能夠建立無癥狀的感染，即不會導致消化性潰瘍或胃癌并導致胃粘膜最小的病理，即很少或根本不存在胃上皮的萎縮、淋巴細胞浸潤或粒細胞浸潤。在一些實施方案中，本發明的幽門螺桿菌菌株不表達一種或多種功能性致病因子。由致病基因編碼的致病因子通過損壞上皮細胞破壞粘膜屏障并造成明顯的疾病，包括消化性潰瘍和胃癌。例如，致病基因vacASi編碼空泡毒素，而致病基因cagA編碼通過IV型分泌注入宿主細胞的毒素。在一個特定的實施方案中，本發明的菌株缺乏vacASi或cagA，即不表達功能性vacASi或cagA。不希望受限于任何特定的假說，已表明這兩種致病因子均是致病性所需的。雖然細菌遞送運載體具有低致病性是重要的，它們形成慢性感染也是所希望的。術語“慢性感染”是指進行6個月以上的感染。因此，在一些實施方案中，本發明的幽門螺桿菌菌株可具有在哺乳動物受試者中形成慢性感染的能力。本文所用的術語“哺乳動物受試者”是指人、靈長類動物、馬科、犬科或貓科動物。本發明的幽門螺桿菌菌株還具有天然轉化的能力。術語“天然轉化”和其語法上等同的詞，是指在實驗室條件下(不使用通常天然不發生的條件，例如電穿孔)攝取、基因組并入和表達外源DNA、而產生的細胞的遺傳改變。這種特性促進感興趣的編碼生物活性劑的基因并入細菌的基因組和“重組菌株”的產生。本發明的幽門螺桿菌菌株還具有無需事先宿主適應而感染和定殖于小鼠的能力。取自人的細菌不一定感染不同的物種，如小鼠。因此，在小鼠模型中的實驗可以開始前往往需要宿主適應。小鼠宿主適應一般涉及從小鼠到小鼠的細胞傳代以產生宿主適應的變體。而且，一旦在小鼠中實驗結束(conclude)，則菌株可不能感染和定殖于人，導致需要進一步操作。因此，使用能夠感染小鼠而無需宿主適應的分離自人的幽門螺桿菌菌株限制了對幽門螺桿菌菌株的操作，并允許菌株對人直接的翻譯。如上所述，本發明的發明人已經鑒定具有細菌遞送運載體所需特性的幽門螺桿菌的臨床分離株的非專有的實例。鑒定的幽門螺桿菌菌株按照布達佩斯條約的條款，于2009年4月22日(0ND737，0ND738,0ND739和0ND740)和2010年5月28日(0ND248和0ND256)保藏于國家計量研究院(NMI)，l/153BertieStreet,PortMelbourne,Victoria,澳大利亞。幽門螺桿菌菌株已指定以下登錄號V09/009101(0ND737)；V09/009102(0ND738)；V09/009103(0ND739)；V09/009104(0ND740)；V10/014059(0ND248)和V10/014060(0ND256)。本發明還涵蓋幽門螺桿菌菌株0ND737、0ND738、0ND739、0ND740、0ND248和0ND256的突變體或衍生株。本文所述的術語“突變體”或“衍生株”，是指基因組DNA與幽門螺桿菌菌株0ND737、0ND738、0ND739、0ND740、0ND248和0ND256及如本文所述具有所述菌株的相應特征的菌株具有至少約80%，優選至少約90%，和最優選至少約95%相同的細菌。本發明的幽門螺桿菌菌株可用于遞送生物活性劑。活細菌遞送運載體通過表達編碼生物活性劑的基因遞送生物活性劑。一般來說，感興趣的基因由核酸編碼，其優選是以分離的形式獲得。本領域熟練技術人員應知道，本發明分離的核酸分子可以是cDNA、基因組DNA、RNA,或其雜合分子。優選地，分離的核酸是cDNA。如本文所用的術語“分離的核酸”，是指一種核酸，其結構不同于任何天然存在的核酸或天然存在的基因組核酸的跨越多于三個分隔的基因的任何片段。因此，該術語含蓋，例如，(a)DNA分子，其具有天然存在的基因組DNA分子的部分序列，但其兩側并不均是位于、其天然存在的生物體的基因組中該分子的那部分側翼的編碼序列；(b)核酸，其以這樣的方式整合入載體或原核或真核生物的基因組DNA中使所得分子不同于任何天然存在的載體或基因組DNA;(c)分隔的分子，如cDNA、基因組片段、聚合酶鏈式反應(PCR)產生的片段、或限制酶切片段；和(d)重組核苷酸序列，其是雜合基因(即編碼融合蛋白的基因)的部分。分離核酸的方法是本領域技術人員所熟知的。分離的核酸可以是同源或異源的，然而，一般地分離的核酸是異源的，即在自然界中或弓I入細菌或其祖先之前，不是由幽門螺桿菌表達的。在一些實施方案中，分離的核酸編碼生物活性劑。技術人員應知道，本發明的方法可用于遞送各種生物活性劑。合適的制劑的實例包括那些能夠在局部或全身有功能的，例如能夠發揮內分泌活性影響局部或全身的代謝的活性劑，和/或能夠調節屬于免疫/造血系統的細胞的活性的活性劑，和/或能夠在體內影響各種正常或腫瘤細胞的生存、生長和分化或影響免疫調節或誘導對損傷和感染的急性期炎癥反應的活性劑，和/或能夠增強或誘導由作用于靶細胞受體上的趨化因子介導的對細胞和組織的感染的抗性，或上皮細胞增殖或促進傷口愈合的活性劑，和/或調節體內細胞的物質的表達或產生的活性劑。這種生物活性劑的具體實例包括胰島素、生長激素、促乳素、降鈣素、促黃體激素、甲狀旁腺素、生長抑素、促甲狀腺激素、血管活性腸肽、采用反平行4a螺旋束結構的結構組I細胞因子，例如IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6，IL~1,IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，GM-CSF，M-CSF，SCF，IFN-y，EPO,G-CSF,HF,OSM,CNTF，GH,PRL或IFNa;常常與細胞表面相關的、形成對稱同源三聚體和亞基采取某些病毒外殼蛋白所述的￠-凝膠卷(jellyroll)構象的結構組2的細胞因子，例如腫瘤壞死因子(TNF)家族的細胞因子，如TNFa，TNFP，⑶40，⑶27或FAS配體，IL-I家族的細胞因子，成纖維細胞生長因子家族，血小板衍生的生長因子，轉化生長因子P和神經生長因子；結構組3的細胞因子包括短鏈a/3分子，其產生為大的跨膜前體分子，其中每個都在細胞外區域包含至少一個表皮生長因子(EGF)域，如EGF家族的細胞因子，以它們具有在保守的半胱氨酸殘基周圍集群的氨基酸序列為特征的趨化因子(C-C或C-X-C趨化因子亞組)或胰島素相關的細胞因子；結構組4的細胞因子表現出鑲嵌結構，如由不同的結構域，如EGF、免疫球蛋白樣和kringle域組成的神經調節蛋白heregulin或neuregulin。此外，生物活性劑可以是如上定義的生物活性劑的受體或拮抗劑。因此，本發明提供表達生物活性劑的重組幽門螺桿菌菌株，其用于醫藥用途，例如用于人體或動物體的治療方法，而且特別是預防(“疫苗”)。幽門螺桿菌感染的天然特征，如特異性、非保護的循環抗體和終身持續性的存在，意味著幽門螺桿菌在遞送疫苗抗原和在個體中誘導抗體反應中特別有用。因此，在特定的實施方案中，本發明提供表達抗原的幽門螺桿菌重組菌株和通過對個體施用該細菌在個體中誘導抗體反應的方法。“抗體反應”是指針對重組細菌表達的感興趣的抗原的特異性抗體的誘導。編碼生物活性劑的分離的核酸可以通過本領域已知的任何方法整合入幽門螺桿菌菌株的基因組。例如，表達載體和/或載體質粒可用于將以分離的核酸形式存在的感興趣的基因插入到細菌染色體中。在優選的實施方案中，分離的核酸將通過天然轉化和同源重組并入細菌染色體。例如，將5-15illTE緩沖液中0.3-2iig的包含抗生素標記或突變的rpsL等位基因(Dailidiene等，(2006)^ContraselectablestreptomycinsusceptibilitydeterminantforgeneticmanipulationandanalysisofHelicobacterpylori，，,ApplEnvironMicrobiol，72，5908-5914)的DNA片段加入幽門螺桿菌培養液中并混合。然后將細菌在氣室中溫育24小時。收集DNA處理的細胞并鋪于補充卡那霉素(IOiig/ml)、氯霉素(IOiig/ml)、鏈霉素(10iig/ml)和紅霉素(10iig/ml)的選擇性血瓊脂板上并溫育。細菌的生長指示轉化是成功的。本發明還提供鑒定幽門螺桿菌菌株適于用作細菌遞送運載體的方法。所述方法的第一步包括從對幽門螺桿菌感染無癥狀的個體分離幽門螺桿菌菌株。優選的所述個體為至少50歲、對幽門螺桿菌感染無癥狀、并顯示沒有或很少的胃上皮萎縮的個體。然后測試分離株以確定該菌株是否具有天然轉化能力和無需宿主適應而定殖于小鼠胃粘膜的能力。指定能夠天然轉化和無需宿主適應而定殖與小鼠胃粘膜的分離的菌株適于用作細菌遞送運載體和在體內遞送生物活性劑。現在將以僅參考以下非限制性的實施例的方式進一步說明本發明。然而應該理解，以下實施例僅供說明，而不應以任何方式將其作為上述發明的一般性的限制。實施例I臨床菌株的分離從瑞典Karolinska研究所獲得23株幽門螺桿菌臨床分離株和從SirCharlesGardinerHospital,WesternAustralia獲得50株幽門螺桿菌臨床分離株。臨床分離株從甘油貯存物復蘇并在控氣室中在6-抗生素的選擇性血瓊脂平板上生長(萬古霉素IOiig/ml，甲氧芐啶iig/ml，多粘菌素B2500IU/L，兩性霉素B2.5yg/ml)。生長24小時后從板上拭下細菌和重懸于BHIB(Oxoid)t5從板上直接收集細菌以通過在600nm處測量光密度(OD6tltl)給出每毫升約IXIO9細菌。菌株的基因分型如前所述進行(Tiwari等，(2007)“AsimplemultiplexPCRassayfordiagnosingvirulentHelicobacterpyloriinfectioninhumangastricbiopsyspecimensfromsubjectswithgastriccarcinomaandothergastro-duodenaldiseases”，JApplMicrobiol，103，2353-2360)。對所有臨床分離株的攝取DNA和通過同源重組將其整合入其基因組的能力進行了篩選。幽門螺桿菌臨床分離株從甘油貯存物接種到選擇性瓊脂平板。平板在37°C在包含兩個Campygen套件氣包的氣控室溫育2_4天。傳代培養細菌并重鋪于新鮮平板上。將平板進一步在所述室中在37°C培養18-20小時并將單菌落鋪于補充DENT(Oxoid，SRO147)的新鮮平板上。將平板在CO2培養箱中溫育5個小時。接著，將5-15illTE緩沖液中的0.3-2iig包含抗生素標記或突變的rpsL等位基因(Dailidiene等，(2006)“ContraselectablestreptomycinsusceptibilitydeterminantforgeneticmanipulationandanalysisofHelicobacterpylori”，ApplEnvironMicrobiol,72,5908-5914)的DNA片段加入幽門螺桿菌菌株并混合。將細菌在氣室中再溫育24小時。收集DNA處理的細胞并鋪于補充卡那霉素(10iig/ml)、氯霉素(10iig/ml)、鏈霉素(lOiig/ml)和紅霉素(lOiig/ml)的選擇性血瓊脂板上并溫育。轉化后確定細菌的生長。圖I顯示能夠經受天然轉化并成為抗生素抗性的菌株的頻率。在篩選的73株中，基于其抗生素抗性表型，將大約60%(42/73)(14株來自Karolinska(K)研究所和28株來自SCGH(H))鑒定為可用DNA天然轉化。隨后，在體內在小鼠模型中測試了這些菌株的定殖能力(實施例2)。實施例2幽門螺桿菌DBA/2.T小鼠模型中定殖于胃的臨床分離株的鑒定在DBA/2J小鼠模型中，測試了實施例I(圖I)中鑒定的42株臨床分離株的定殖于胃粘膜的能力。雌性、6-8周齡的DBA/2J小鼠購自澳大利亞動物資源中心。所有小鼠無幽門螺桿菌并允許其于實驗開始前有2周的馴化期。無限制地為動物提供酸化水和標準的(基于魚粉的)嚙齒動物飲食，除非另有規定。在一些實驗中，為動物喂食素食(無魚粉)或半合成的、富含酪蛋白的蛋白質飲食和中性(非酸性)飲用水。飲食來自SpecialtyFeeds,WesternAustralia。所有的實驗工作根據許可RA3/100/676由西澳大利亞動物倫理委員會批準。小鼠(n=3)感染BHIB中的IxlO9CFU/ml的細菌。為確定定殖水平，感染后4或24周從動物收獲胃組織。沿大彎(greatercurvature)解剖胃通過輕輕地用PBS洗漆去除殘余的食物。將打開的胃放置在500illPBS中并用5mm不銹鋼珠以30的頻率(QiagenTissueLyserII)勻漿30秒。將樣品進一步以10的頻率勻漿2分鐘。將系列稀釋的勻漿液鋪于補充兩性霉素B(8iig/ml)、甲氧芐啶(5iig/ml)和萬古霉素(6yg/ml)、萘啶酸(10ug/ml)、多粘菌素B(10ug/ml)和桿菌肽(200ug/ml)的BHI瓊脂板上。將平板放入含有兩個Campygen套件氣包(Oxoid，CN0025A)的氣控室中并在37°C溫育。鋪板后5_7天確定細菌生長。在鑒定為天然可轉化的42株中，只有15株能夠成功地定殖于DBA/2J幽門螺桿菌小鼠模型中(圖2)。原始來源的初步結果匯總于表I。鑒定了最佳定殖菌株并進一步驗證了體內感染頻率和定殖魯棒性(robustness)。表I可轉化的、定殖的幽門螺桿菌臨床分離株的總結來源__數目__可轉化的__定殖__總計Karolinska23__14/23(60.8%)__4/14(28.5%)SCGH5028/50(56%)11/28(39%)_實施例3感染的魯棒件和頻率為進一步研究實施例2中定殖于小鼠模型的15株菌株的魯棒性，進行了更多的具有更大動物數目的實驗。這允許選擇出作為真正的定殖者的臨床分離株。對以上鑒定為天然可轉化的且能夠定殖于小鼠胃粘膜的每個菌株進行了多輪實驗。簡言之，小鼠(n=10-12)感染IxlO9CFU/ml的細菌。4周后培養來自小鼠胃組織的細菌并進行定量。結果表明，在初步體內篩選中鑒定的5株(K6、K8、K18、H27和H40)是魯棒的定殖者，而其余的10株是小鼠胃粘膜的不良定殖者。由于SCGH臨床分離株顯示不良的和不一致的定殖結果，在第二輪后終止了實驗(圖3)。SCGH菌株與來源自Karolinska研究所的菌株相比，生長也更緩慢。這些差異可歸因于在不同地點的培養和存儲技術中的差異。實施例4在DBA/2.T小鼠模型中的長期定殖通過進行長期的定殖實驗，研究了建立幽門螺桿菌菌株的慢性感染的能力。基于初始(第I輪)定殖數據，測試了最強和最弱定殖的臨床分離株的選擇。將如購買和在實施例2中處理的小鼠(n=4-6)經口感染IXlO9CFU/ml的定殖幽門螺桿菌菌株(K6、K8、K11、K18、H27和H41)和非定殖菌株(K12、K14、K16、K17、H23和H44)。經口感染6個月后，如上述實施例中所述從小鼠胃組織收獲并培養細菌并進行定量。魯棒的定殖株；K6、K8、K18和H27仍然能夠感染約50%的動物(圖4)。如所預期的，用非定殖菌株感染的小鼠沒有定殖，而弱定殖株Kll和H41未能長期定殖于小鼠胃粘膜。這表明不同菌株具有不同的定殖于小鼠胃的能力，并且在此我們已鑒定了能夠做到這些而無需在宿主中適應的至少4株菌株。實施例5定殖的幽門螺桿菌臨床分離株的免疫原性接著，我們確定了在體內小鼠模型中鑒定的定殖幽門螺桿菌菌株的免疫原性并將其與非定殖菌株進行比較。在DBA/2J小鼠模型中，測試了幽門螺桿菌臨床分離株在經口感染后3個月的誘導特異性IgG抗體反應的能力。小鼠(n=5)經口感染IXIO9CFU/ml的定殖幽門螺桿菌菌株(K6、K8、K11、K18、H27和H41)和非定殖株(K12、K14、K16、K17、H23和H44)。感染后3個月，將動物放血，收集血清并ELISA測量幽門螺桿菌特異性IgG抗體。用10iig/ml的幽門螺桿菌X47細胞裂解物涂覆96孔板(NUNCMaxisorb)并在4°C溫育過夜。然后將板在PBS/0.05%Tween-20中洗滌5次并用2%BSA在37°C封閉2個小時。將板洗滌兩次并將血清樣本(1/20稀釋)一式兩份加入孔中。然后將板在室溫(RT)下溫育I小時，隨后洗滌并加入檢測抗體(綴合于堿性磷酸酶的抗-小鼠IgG，1/1000,Sigma)。將板在室溫再溫育I小時然后洗漆。用P-NPP將板顯色(develop)40分鐘然后用2MNaOH終止反應。抗體效價表示為在405nm測量的光密度值。結果顯示，K6和K8,兩個最強的定殖菌株,是免疫原性最強的(圖5)。臨床分離株，1(11、1(18、1127和1141是免疫原性弱得多的。有趣的是，盡管在小鼠模型中感染后4周不能定殖于胃粘膜，但臨床分離株H44在經口感染后三個月顯示強的幽門螺桿菌-特異性IgG反應，表明此菌株可以在實驗進程中的早期瞬時感染所述小鼠。在進一步分析中，在定殖菌株感染的小鼠中測量幽門螺桿菌-特異性IgG抗體多至5個月。結果表明，K6和K8菌株誘導最強、最持久的幽門螺桿菌-特異性抗體反應多至感染后5個月(圖6)。這些數據支持了K6和K8菌株免疫原性最強，而K11、K18、H27和H41免疫原性較弱的觀察。實施例6在幽門螺桿菌C57BL/6小鼠樽型中定殖于胃部的臨床分離株的鑒定為了確保候選的幽門螺桿菌菌株沒有錯過我們在DBA/2小鼠模型中的篩選(實施例2)，我們在C57BL/6小鼠模型中重復了篩選，該小鼠模型對于臨床分離株的感染的寬容性低得多(farlesspermissive)。雌性、6-8周齡的C57BL/6小鼠購自澳大利亞動物資源中心。所有小鼠無幽門螺桿菌并允許其于實驗開始前有2周的馴化期。無限制地為動物提供酸化水和標準的(基于魚粉的)嚙齒動物飲食，除非另有規定。在一些實驗中，為動物喂食素食(無魚粉)或半合成的、富含酪蛋白的蛋白質飲食和中性(非酸性)飲用水。飲食來自SpecialtyFeeds,WesternAustralia。所有的實驗工作根據許可RA3/100/676由西澳大利亞動物倫理委員會批準。對實施例I中鑒定的14株可轉化的幽門螺桿菌菌株以與實施例2中使用的相同的程序測試了定殖。我們鑒定了額外的菌株K4，其在C57BL/6小鼠模型中成功定殖，并且還檢測到另一菌株K12,盡管此菌株的定殖不魯棒的多(farlessrobust)(圖7)。在此模型中，還選出了K8菌株作為弱定殖者。所有其余的幽門螺桿菌臨床分離株不能定殖于C57BL/6小鼠。實施例7幽門螺桿菌小鼠模型的優化由于小鼠模型不是幽門螺桿菌的天然宿主，在此模型中建立感染可能是困難的，為了改進幽門螺桿菌菌株在體內的定殖，我們通過測試對包括食物和水的飲食改變來開始優化該小鼠模型。首先，我們比較不同食物的飲食，包括標準的基于魚粉的飲食、素食(無魚粉)和半合成的富含酪蛋白的蛋白質飲食(93G)。其次，對應中性飲用水(pH6)，我們評估酸性(pH2.5)的影響。測試這些方法以確定使用X47實驗室菌株，在C57BL/6和DBA/2小鼠模型中是否有一些因素能夠提供定殖中的改善。結果顯示，與標準的魚粉飲食相比，在喂食富含酪蛋白的93G飲食(SpecialtyFeeds,WesternAustralia)的小鼠中幽門螺桿菌的定殖得到改進(表2)。素食(無魚粉)飲食不顯示定殖中的任何改進(數據未顯示)。使用半合成、富含酪蛋白的飲食增加了小鼠中幽門螺桿菌的定殖率，因而產生改進的小鼠模型。有趣的是，從標準酸化水(pH2)至中性水(pH6)改變飲用水對小鼠模型有負面影響，其胃部的細菌載量降低(表2)。事實上，使用酸性水對小鼠是更好的。表2在小鼠模型中飲食對幽門螺桿菌定殖的影響權利要求1.一種幽門螺桿菌的分離的菌株，所述菌株具有以下特征(a)低致病性；(b)天然轉化能力；和(C)無需宿主適應而定殖于小鼠胃粘膜的能力。2.依照權利要求I所述的幽門螺桿菌的分離的菌株，其中所述的幽門螺桿菌能夠在哺乳動物受試者中形成慢性感染。3.依照權利要求I或權利要求2所述的幽門螺桿菌的分離的菌株，其中所述的幽門螺桿菌不表達一種或多種功能性致病因子。4.依照權利要求3所述的幽門螺桿菌的分離的菌株，其中所述的致病因子是vacASi或cagA。5.—種幽門螺桿菌的分離的菌株，所述菌株或者是(i)vacAsi或cagA陰性；或者是(ii)vacAs2和cagA陽性；并且其中所述的幽門螺桿菌菌株具有(a)低致病性，(b)天然轉化能力；及(C)無需宿主適應而定殖于小鼠胃粘膜的能力。6.依照權利要求1-3中任一項所述的幽門螺桿菌的分離的菌株，其中所述的幽門螺桿菌選自下組以登錄號V09/009101保藏于國家計量研究院的0ND737;以登錄號V09/009102保藏于國家計量研究院的0ND738;以登錄號V09/009103保藏于國家計量研究院的0ND739;以登錄號V10/014059保藏于國家計量研究院的OND248;以登錄號V10/014060保藏于國家計量研究院的OND256;和以登錄號V09/009104保藏于國家計量研究院的0ND740，或其突變體或衍生株。7.一種分離的幽門螺桿菌菌株OND737，其以登錄號V09/009101保藏于國家計量研究院。8.一種分離的幽門螺桿菌菌株OND738，其以登錄號V09/009102保藏于國家計量研究院。9.一種分離的幽門螺桿菌菌株OND739，其以登錄號V09/009103保藏于國家計量研究院。10.一種分離的幽門螺桿菌菌株0ND740，其以登錄號V09/009104保藏于國家計量研究院。11.一種分離的幽門螺桿菌菌株OND248，其以登錄號V10/014059保藏于國家計量研究院。12.—種分離的幽門螺桿菌菌株OND256，其以登錄號V10/014060保藏于國家計量研究院。13.依照權利要求1-12中任一項所述的分離的幽門螺桿菌菌株，其是用由核酸分子編碼的感興趣的基因轉化的。14.依照權利要求13所述的分離的幽門螺桿菌菌株，其中分離的核酸分子整合到所述幽門螺桿菌菌株的基因組中。15.依照權利要求13或權利要求14所述的分離的幽門螺桿菌菌株，其中所述分離的核酸分子編碼與幽門螺桿菌同源的多肽。16.依照權利要求13或權利要求14所述的分離的幽門螺桿菌菌株，其中所述分離的核酸分子編碼與幽門螺桿菌異源的多肽。17.一種在哺乳動物受試者中誘導抗體反應的方法，所述方法包括施用權利要求1-16中任一項所述的幽門螺桿菌的分離的菌株的步驟。18.—種鑒定適于體內遞送生物活性劑的幽門螺桿菌菌株的方法，包括以下步驟(a)從無幽門螺桿菌感染癥狀的個體分離幽門螺桿菌菌株；(b)確定所述菌株是否具有天然轉化能力；以及(C)確定所述菌株是否具有無需宿主適應而定殖于小鼠胃粘膜的能力，其中具有天然轉化能力和無需宿主適應而定殖于小鼠胃粘膜的能力的菌株適于體內遞送生物活性劑。19.一種優化的螺桿菌屬感染的動物模型，其中所述動物以富含酪蛋白的食物和/或酸化水飼養，使得相對于沒有以富含酪蛋白的食物和/或酸化水飼養的動物，其螺桿菌屬菌種的定殖是增強的。20.依照權利要求19所述的優化的動物模型，其中所述動物以富含酪蛋白的食物和酸化水飼養，其中所述水是約pH2。21.依照權利要求19或權利要求20所述的優化的動物模型，其中所述動物是小鼠。22.隨機擴增多態DNA聚合酶鏈式反應用于鑒定螺桿菌屬菌種的用途。23.依照權利要求22所述的用途，其中螺桿菌屬DNA分離自所述的螺桿菌屬菌種并使用具有SEQIDNO:1所示序列的正向引物和具有SEQIDNO:2所示序列的反向引物通過聚合酶鏈式反應擴增。全文摘要本發明涉及用于遞送生物活性劑的幽門螺桿菌菌株，特別的是，本發明提供幽門螺桿菌的分離的菌株，所述菌株具有(a)低致病性；(b)天然轉化能力；和(c)無需宿主適應而定殖于小鼠胃粘膜的能力。文檔編號C12N1/20GK102753679SQ201080034335公開日2012年10月24日申請日期2010年6月3日優先權日2009年6月3日發明者A.福盧里加,B.馬歇爾,H-O.尼爾森,M.本格扎爾,W.盧申請人:翁德克控股有限公司