專利名稱：益生雙歧桿菌菌株的制作方法
益生雙歧桿菌菌株
引言
本發明涉及雙歧桿菌菌株及其作為益生菌具體是作為免疫調節生物治 療劑的用途。
保護人類胃腸道免受腸道細菌定植的防御機制相當復雜并涉及到免疫
學和非免疫學的領域(l)。先天防御機制包括胃的低pH，膽汁鹽，蠕動，黏 蛋白層以及抗微生物化合物，例如溶菌酶(2)。免疫學機制包括分布于整個 小腸和結腸的特發性淋巴集結，基礎性M細胞，又稱為派伊爾淋巴集結(3)。 腔內抗原在這些位點上的提呈導致了對適當T和B細胞亞型的刺激，從而 建立了細胞因子網絡并將抗體分泌至胃腸道中去(4)。此外，可通過上皮細 胞將抗原提呈至上皮內淋巴細胞以及基礎粘膜固有層免疫細胞(5)。因此， 宿主相當程度地依賴于胃腸道的免疫防御。然而，由于胃腸道粘膜是宿主 與外界環境相互作用的最大表面，發生于其上的具體控制機制必需能夠適 當地對平均壽命期間由胃腸道處理的上百噸食物進行免疫應答的調節。不 僅如此，消化道定植有超過500種的細菌，在結腸中的數量為10U-10力g。 因此，這些控制機制必需能夠從對宿主引起明顯傷害的侵襲性病原體中區 別出非致病性的附著細菌。事實上，通過與新攝入的潛在致病性微生物競 爭，腸道菌群對宿主的防御大有裨益。
存在于人類胃腸道中的細菌能夠引起炎癥。對固有微生物菌群的異常 免疫應答可涉及到某些疾病狀態，例如炎性腸病。與正常菌群相關的抗原 通常會導致免疫耐受，而不能達到這樣的耐受是粘膜發炎的主要機制(6)。 在患有炎性腸病(IBD)的患者中，其耐受被破壞的證據包括針對于所述腸道 菌群的抗體水平升高。
本發明涉及雙歧桿菌菌株，其可通過調制細胞因子水平或通過抗拮以 及排除來自胃腸道的促炎癥微生物從而表現出具有免疫調節的作用。
發明內容
本發明提供了雙歧桿菌菌株AH1205(NCIMB41387)或其突變株或變異株。所述突變株是遺傳修飾的突變株。所述變異株是天然存在的雙歧桿菌 變異株。
所述菌株是益生菌。其是生物學純培養物的形式。
本發明還提供了雙歧桿菌NCIMB41387的分離株。 在本發明的一個實施方案中，雙歧桿菌菌株是活性細胞的形式。或者
雙歧桿菌菌株是以非活性細胞形式存在的
在本發明的一個實施方案中，所述雙歧桿菌菌株是從嬰兒糞便中分離
的，所述雙歧桿菌菌株在口服之后在人中具有明顯的免疫調節性。 本發明還提供了包含本發明所述雙歧桿菌菌株的制劑。 在本發明的一個實施方案中，所述制劑包括其他的益生性物質。 在本發明的一個實施方案中，所述制劑包括有益生元物質。 優選地，所述制劑包括可攝取的載體。所述可攝取的載體可以是藥用
的可接受載體，例如膠囊、片劑或粉末。優選地，所述可攝取的載體可以
是食物制品，例如酸化乳、酸奶、冷凍酸奶、奶粉、濃縮奶、軟干酪、調
料或飲料。
在本發明的一個實施方案中，本發明所述制機還包含有蛋白和/或肽， 特別是富含谷氨酰胺/谷氨酸的蛋白和/或肽、脂類、碳水化合物、維生素、 礦物質和/或痕量元素。
在本發明的一個實施方案中，雙歧桿菌菌株在每克遞送系統中以大于 10^fU的量存在于所述制劑中。優選地，所述制劑包括一種或多種佐劑、細 菌成分、藥物實體或生物學化合物。
在本發明的一個實施方案中，所述制劑可用于免疫和接種方案。
本發明還提供了本發明的雙歧桿菌菌株或制劑，其可用作食物，用作 藥物，用于預防和/或治療不良炎性活性，用于預防和/或治療不良呼吸道炎 性活性(例如哮喘)，用于預防和/或治療不良胃腸道炎性活性(例如炎性腸病 如克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎、腸易激綜合征、慢性腸炎、或感染后結腸 炎)，用于預防和/或治療胃腸道癌癥，用于預防和/或治療系統性疾病例如類 風濕性關節炎，用于預防和域治療由不良炎性活性所引起的自身免疫失調， 用于預防和/或治療由不良炎性活性所引起的癌癥，用于預防癌癥，用于預 防和/或治療由不良炎性活性所引起的腹瀉疾病(例如與艱難梭菌 (Clostridium difficile)相關的腹瀉、與輪狀病毒相關的腹瀉或感染后腹瀉)，用于預防和/或治療由感染性因子例如大腸桿菌所引起的腹瀉疾病。
本發明還提供了用于制備一種抗炎生物治療劑以預防和/或治療不良炎
性活性，或用于制備多種抗炎生物治療劑以預防和/或治療不良炎性活性的
本發明所述雙歧桿菌菌株或制劑。
在本發明的一個實施方案中，本發明所述菌株可通過抗拮以及從胃腸
道中排除促炎癥反應的微生物來發揮作用。
本發明還提供了用于制備抗炎生物治療劑從而降低促炎癥細胞因子水
平的本發明所述雙歧桿菌菌株或制劑。
本發明還提供了用于制備抗炎生物治療劑從而調節IL-10水平的本發
明所述雙歧桿菌菌株。
由于雙歧桿菌菌株具有拮抗致病物種生長的能力，本發明還提供了將 雙歧桿菌菌株作為抗感染益生菌的用途。
發明人還發現特定的雙歧桿菌菌株能夠在體外引起免疫調節的效果。
本發明因此在預防或治療失調免疫應答，例如不良炎癥反應(如哮喘) 時具有極大的潛在治療價值。
雙歧桿菌是共生性微生物。其是從人體胃腸道內的微生物菌群中分離 得到的。由于其導致的炎性活性同樣會破壞宿主細胞及組織的功能，所以 胃腸道內的免疫系統并不會對這類菌群的成員產生明顯的反應。因此，存 在一些機制，憑借著所述的機制免疫系統能夠識別與致病性生物體所不同 的胃腸道菌群中的共生性非致病成員。這確保了對宿主組織的損傷是被限 制的并依然保留了防御性的屏障。
長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)菌株AH1205在2006年5月11日 被保藏于NCIMB，其記錄的保藏號碼為NCIMB41387。
所述長雙歧桿菌可以是遺傳修飾的突變株，或者可以是天然存在的變 異株。
優選地，所述長雙歧桿菌是活性細胞的形式。
或者，所述長雙歧桿菌可以是非活性細胞的形式。
應該理解，本發明的特定雙歧桿菌菌株可以口服攝入的形式以常規的
制劑例如膠囊、微膠囊、片劑、顆粒、粉末、錠劑、丸劑、栓劑、懸液和 糖漿對動物(包括人類)進行給藥。適合的制劑可通過使用常規的有機和無機 添加劑采用常規方法來制備。藥物組合物中的活性成分量可根據所需要的治療效果來進行操作。
所述制劑還可包含細菌成分、藥物實體或生物學化合物。 此外，還可使用任意適合的公知方法，并可包含藥物可接受的載體或 佐劑來制備含有本發明所述菌株的疫苗。
在本說明書中，術語突變株，變異株以及遺傳修飾的突變株包括與親 本菌株相比，其基因型和/或表現型性質都發生改變的雙歧桿菌菌株。天然 存在的長雙歧桿菌變異株包括對所分離到所選定靶向性質的自發改變。對 親本菌株性質的故意改變是通過常規(體外)遺傳操作技術，例如基因破壞，
接合轉移等來實現的。遺傳修飾包括例如通過載體(包括質粒DNA或噬菌 體)向細菌菌株的基因組進行插入而將外源和/或內源DNA序列導入雙歧桿 菌菌株的基因組。
天然或誘導的突變包括至少單個堿基的改變，例如缺失、插入、轉換 或其他DNA修飾，其可導致由所述DNA序列所編碼氨基酸序列的改變。
術語突變株，變異株以及遺傳修飾的突變株還包括這樣的雙歧桿菌菌 株，其經歷了遺傳改變，所述遺傳改變以對于自然界中的所有微生物一致 的速率在基因組中累積，和/或所述遺傳改變通過自發突變和/或基因的獲取 和/或基因的丟失而發生，其不是通過對基因組進行故意(體外)操作實現的， 而是通過當暴露于環境壓力例如抗生素時能夠提供選擇性優勢從而支持細 菌生存的對變異株和/或突變株的自然選擇來實現的。可以通過向基因組中 故意(體外)插入特定基因來產生突變株，其并沒有在根本上改變所述生物體 生物體的生物化學功能，但其產物可用來對細菌的例如抗生素抗性進行鑒 定或篩選。
本領域所屬技術人員應該理解雙歧桿菌的突變株或變異株可通過與親 本菌株的DNA序列同源性分析進行鑒定。與親本菌株具有接近序列一致性 的雙歧桿菌菌株被認為是突變株或變異株。與親本菌株具有96%或更高序 列一致性(同源性)，例如97%或更高，或98%或更高，或99%或更高的雙 歧桿菌菌株被認為是突變株或變異株。可使用在線同源性算法"BLAST"程 序，公開于http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/，來確定序列的同源性。
親本菌株的突變株還包括得自與所述親本菌株的16s-23s基因間間隔子 多核苷酸序列具有至少85%序列同源性，例如至少90%序列同源性，或至 少95%序列同源性的雙歧桿菌菌株。這些突變株還包含在細菌基因組中其他DNA序列的DNA突變。 附圖簡述
圖1為長雙歧桿菌AH1205的BOX PCR(生物分析儀)條形碼圖。使用 Agilent2100軟件確定堿基對大小。
圖2圖示了在8天飼喂階段中長雙歧桿菌AH1205的糞便回收，并證 實了 AH1205能夠在鼠胃腸道中轉移的能力。
圖3為條線圖，顯示長雙歧桿菌AH1205對于人PBMC的IL-10細胞 因子產生的影響。結果表示為平均值+ASE(r^6)。
圖4A和B圖示了益生菌株AH1205(A)和安慰劑(B)對于經卵清蛋白 (OVA)攻擊之后的致敏動物的支氣管肺泡灌洗液中總、細胞數的影響(1^10/ 組，相對于單獨的OVA*=p<0.05)。
圖5A和B圖示了益生菌株AH1205(A)和安慰劑(B)對醋甲膽堿氣道反 應性的影響，其通過在使用OVA或鹽水鼻內攻擊24小時之后卵清蛋白 (OVA)致敏的小鼠中增加的停頓(Penh)的改變來進行評估。每個數據點都代 表平均值士SEM(i^lO/組，相對于單獨的OVA*=p<0.05)。
圖6A至B為來自卵清蛋白(OVA)敏化的小鼠的支氣管肺泡灌洗液 (BAL)中IL-10(A)， INFy(B)， TNF(C)， IL-6(D)和CCL2(e)細胞因子水平的 示意圖。每個柱代表平均值士SEM(1^10，相對于OVA攻擊的鹽水出的對照 *p<0.05)。
圖7圖示了來自AH1205飼喂小鼠的CD4+CD25+細胞明顯降低了響應 CD4T細胞的增殖(n-7)。
圖8為在CD4+群(同樣為CD25+)中，通過流式細胞術評估的派伊爾淋 巴集結細胞的百分數。
圖9A與B所示為在攝取AH1205的無菌小鼠中，表達轉錄因子Foxp3 的CD4/CD25+細胞百分數明顯上調。(A"脾細胞，(B)=MLNC細胞(對脾分 析而言n-4/組，對MLNC分析而言r^2/3)。
圖10為當無菌小鼠攝取了長雙歧桿菌AH1205之后，在CD3/CD28刺 激的MLNC培養物中所分泌的細胞因子IL-6， MCP-1和INF-y水平降低。 結果表示為每組平均值+/-標準差(11=4/組)。
圖11為當無菌小鼠攝取了長雙歧桿菌AH1205之后，在CD3/CD28剌激的脾細胞培養物中所分泌的細胞因子IL-6和INF-cx水平降低。結果表示 為每組平均值+/-標準差(11=4/組)。
圖13所示為與乳桿菌(Lactobacillus)GG相比較，3個月后益生菌株 AH1205的穩定性。
發明詳述
本發明人發現長雙歧桿菌菌株AH1205不僅是酸和膽汁耐受性的并可 在胃腸道中轉移(transit)，還可通過調節細胞因子水平或通過抗拮并排除來 自胃腸道的促炎癥或免疫調節微生物，從而另人吃驚的具有免疫調節作用。
益生菌一般是以活性細胞的形式。然而其還可擴展至非活性細胞，例 如殺死的培養物或含有由益生菌所表達有益因子的組合物。這可包括熱殺 死的微生物或通過暴露于改變的pH或施加壓力而被殺死的微生物。考慮到 非活性細胞產品制劑要更簡單一些，可將這樣的細胞輕松地整合入藥品中 且儲藏要求也比活性細胞要寬松的多。干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT 9018提供了有效使用熱殺死細胞作為治療和/或預防腫瘤生長的方法的一 個示例，參見美國專利第4，347，240號。 尚不清楚是否實施免疫調節作用需要完整的細菌，或者是否本發明的 個體活性成分能夠被單獨的利用。某些細菌菌株的促炎成分已被鑒定出來。 革蘭氏陰性細菌的促炎癥作用是通過脂多糖(LPS)介導的。LPS單獨可誘導 促炎網絡，部分是由于LPS可結合于單核細胞上的CD14受體。由于整個 細胞的作用， 一般都認為益生菌的成分擁有免疫調節活性。直到對這些成 分進行了分離，才能夠期待制藥級別的操作。
IL-10是由T細胞，B細胞，單核細胞和巨噬細胞產生的。這種細胞因 子能夠增強B細胞向抗體分泌細胞的增殖與分化。IL-10具有最主要的抗炎 性活性。其可通過單核細胞上調IL-1RA的表達，并抑制大多數單核細胞的 炎性活性。通過反饋機制IL-10能夠抑制單核細胞產生細胞因子，具有反應 活性氧和氮中間體，II類MHC的表達，寄生蟲殺死，以及IL-10產生(7)。 這種細胞因子還表現出可通過干擾PGE2-cAMP依賴的代謝途徑從而封閉 單核細胞產生腸膠原酶和IV型膠原酶，因此可作為慢性炎癥疾病中可見的 結締組織破壞的一種重要調節物。
宿主對感染的反應可被描述為先天和獲得性細胞和體液免疫反應，旨在限制冒犯性生物體的散布以及重建器官的內環境穩定。然而，為了限制
對宿主組織繼發傷害的攻擊性，可激活一系列調節限制。調節性T細胞 (Tregs)就可實現一個這樣的機制。這些細胞可來自胸腺但也可在外周器官, 包括在消化道粘膜中進行誘導。Treg細胞的故意給藥能夠在較廣范圍的小 鼠模型中抑制炎癥疾病，包括試驗性自身免疫腦脊髓炎，炎性腸病，細菌 誘導的結腸炎，膠原誘導的關節炎，I型糖尿病，氣道嗜酸性炎癥，移植物 -宿主疾病以及器官移植。叉頭轉錄因子Foxp3(叉頭盒P3)可在Treg細胞中 選擇性表達，其是Treg發育及功能所必需的，并足以在常規CD4細胞中誘 導Treg表現型(19)。在Foxp3中的突變可在人和小鼠中引起嚴重的多器官 自身免疫。發明人了描述能夠在體內產生CD25陽性/Foxp3陽性T調節細 胞的雙歧桿菌菌株。
本發明可從以下實施例中獲得更明確的理解。
實施例h對從嬰兒糞便中分離的細菌進行表征。益生性狀的證明。 益生菌的分離
從母乳喂養的3日齡男嬰獲得新鮮糞便并進行連續稀釋，接種于添加 有0.05。/。半胱氨酸和莫匹羅星(mupirocin)的TPY(酪蛋白胰酶水解物，蛋白 胨和酵母汁)和MRS(deMann, Rogosa和Sharpe)培養基中。使用C02產生試 劑盒(Anaerocult A， Merck)將平板保溫于厭氧罐(BBL， Oxoid)中37。C培養 2-5天。將革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性的桿狀形狀或分叉/多態細菌分離物 在復合非選擇性培養基(MRS和TPY)上進行劃線純化。除非另有聲明，將 分離物常規培養于MRS或TPY培養基中，在37。C在厭氧條件下。將假定 的雙歧桿菌保存于40%甘油并儲存于-20°0和-80。C。
在分離到純雙歧桿菌菌株之后，指定其名稱為AH1205，對其微生物學 特征進行評價并總結于下表l。 AH1205是革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性的 多態型細菌，其是果糖-6-磷酸磷酸酮酶陽性的，確證了其為雙歧桿菌。使 用加入單一碳源的基本培養基時，AH1205能夠生長于所檢測的全部碳源 (葡萄糖、乳糖、核糖、阿拉伯糖、半乳糖、棉子糖、果糖、麥芽膏、甘露 糖、麥芽糖、蔗糖)中。
表1長雙歧桿菌AH1205的生化特征
菌株特征長雙歧桿菌AH1205
革蘭氏染色+
過氧化氫酶-
運動性-
F6PPK*+
牛奶凝集+
45°C厭氧培養-
45°C需氧培養-
CHO發酵
葡萄糖+
乳糖+
核糖+
阿拉伯糖+
半乳糖+
果糖+
麥芽膏+
甘露糖+
麥芽糖+
蔗糖+
*是指果糖-6-磷酸磷酸酮酶分析
品種鑒定
進行了 16s基因間間隔子(IGS)序列測定從而鑒定了所分離到的雙歧桿 菌。簡言之，使用lOOpl提取液和25pl組織制備液(Sigma， XNAT2試劑盒) 從AH1205中提取DNA。將樣本于95°C保溫5分鐘，然后加入100^1中和 液(XNAT2試劑盒)。使用Nanodrop分光光度計對基因組DNA溶液進行定 量并儲存于4°C 。 使用基于 SEQ ID NO.l的IGS L: 5，-GCTGGATCACCTCCTTTC-3，(SEQ ID N0.3)'和基于SEQ ID NO.2的 IGS R: 5，-CTGGTGCCAAGGCATCCA-3，(SEQ ID N0.4)的IGS引物進行 PCR。循環條件為94°C 3分鐘(l個循環)，94°C 30秒，53°C 30秒，72°C 30秒(28個循環)。所述PCR反應含有4pl(50ng)DNA， PCR混合物(XNAT2試 劑盒)，0.4|iM IGS L和R引物(MWGBiotech,德國)。PCR反應在Eppendorf 熱循環儀上進行。PCR產物(10(il)與分子量標記(100bp梯度標記，Roche) 一起在2%染有EtBr的瓊脂糖凝膠中電泳，從而確定IGS圖譜。使用Promega Wizard PCR純化試劑盒對雙歧桿菌的PCR產物(單條帶)進行純化。使用針 對于基因間間隔子區域的引物序列(如上所述)對純化的PCR產物進行測序。 隨后將序列數據在NCBI核苷酸數據庫中進行檢索從而根據核苷酸同源性 確定所述菌株。將所得DNA序列數據提交NCBI標準核苷酸-核苷酸同源性 BLAST搜索引擎(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。鑒定出與所述序列 最接近的匹配，然后使用DNASTARMegAlign軟件將所述序列進行比較比 對。在序列表中可見到所得序列(SEQ ID NO.l [IGS正向序列]和SEQ ID NO.2 [IGS反向序列])。檢索NCIMB數據庫可發現AH1205具有獨特的 IGS(SEQIDNO.l [正向序列]和SEQ ID NO.2 [反向序列])序列，其具有與長 雙歧桿菌的最接近的序列同源性。
為了開發AH1205的條碼PCR圖譜，使用了 BOX引物進行PCR(8)。 循環條件為94°C 7分鐘(l個循環)，94。Cl分鐘，65°C 8分鐘(30個循環)， 以及65。C 16分鐘。所述PCR反應含有50ng DNA， PCR混合物(XNAT2試 齊U盒)， 0.3pM BOXA1R 弓| 物
(5，-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3，)(SEQ ID N0.5)(MWG Biotech,德 國)。PCR反應在Eppendorf熱循環儀上進行。使用DNA 7500 LabChip⑧在 Agilent 2100生物分析儀(Agilent，德國)對PCR產物(lpl)與分子量標記 (7500bp梯度標記，Agilent,德國)一起進行操作。使用Agilent生物分析儀 軟件確定條碼圖(PCR產物圖譜、)，并確定峰數量(PCR產物)和大小(圖1)。
抗生素敏感性圖譜
使用"紙片敏感性"分析方法確定長雙歧桿菌的抗生素敏感性圖譜。將生 長于適當肉湯培養基中24-48小時的培養物(100pl)傾倒鋪板于瓊脂培養基 上，并將含有已知濃度抗生素的紙片放置于瓊脂上。在厭氧條件下在37。C 保溫1-2天之后檢測菌株的抗生素敏感性。如果可見到1mm或更大的抑菌 圈則考慮所述菌株是敏感的。獨立的評估每種抗生素的最低抑制濃度 (MIC)。克林霉素、萬古霉素和甲硝唑的MIC分別為0.032、 0.75和>256。腸道轉移
為確定長雙歧桿菌能否在相當于胃中發現的低pH值條件下存活，從新 鮮的過夜培養物中收集細菌細胞，用磷酸緩沖液(pH6,5)洗滌2次并重懸于 (采用1M HC1)將pH調節至2.5的TPY肉湯培養基中。將細胞保溫于37°C 并使用平板計數法在5， 30， 60和120分鐘測定存活情況。AH1205在pH2.5 的條件下可在5分鐘內存活良好，但在30分鐘之后則不能回收到具有活性 的細胞。
從胃排出之后，推定的益生菌將暴露于小腸中的膽汁鹽。為了確定長 雙歧桿菌暴露于膽汁條件下的存活能力，將培養物劃線于添加有0.3%(w/v)、 0.5%、 1%、 2%、 5%、 7.5%或10。/。豬膽汁的TPY瓊脂平板上。在含有高至 0.5%膽汁的平板上都觀察到了長雙歧桿菌的生長。
在鼠模型中，對長雙歧桿菌AH1205在胃腸道中的轉移能力進行了評 估。對每日攝入lxl09AH1205的小鼠以及糞便顆粒進行了飼喂微生物存在 的檢測。對AH1205的檢測是通過分離自發形成的雙歧桿菌利福平抗性變 異株來輔助的-將利福平加入用于評價轉移的TPY平板，確保僅有所飼喂的 利福平抗性雙歧桿菌得以培養。每日收集糞便樣本并確認長雙歧桿菌轉移 通過胃腸道(圖2)。
抗微生物活性
將用于本研究中的指示性致病微生物在以下生長條件下在下述培養基 中進行擴增鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)(37。C，需氧)在添加 有0.6。/。酵母汁(TSAYE， Oxoid)的胰蛋白胨大豆肉湯/瓊脂培養基中，空腸 彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)(37。C，厭氧)和大腸桿菌0157: H7(37。C， 厭氧)在血瓊脂培養基中，艱難梭菌(Clostridium difficile)(37。C，厭氧)在加 強梭菌培養基(RCM， Oxiod)中。所有菌株都接種于新鮮的生長培養基并于 實驗之前進行過夜生長。
使用延遲的方法(9)來檢測抗微生物活性。簡言之，將長雙歧桿菌 AH1205保溫36-48小時。將10倍連續稀釋液涂平板(100^il)于TPY瓊脂培 養基上。在過夜保溫之后，將指示細菌覆蓋于具有完全分開菌落的平板上。 指示菌苔是通過向已接種TPY平板的表面傾倒接種有2。/。(v/v)過夜指示培養物的融化覆蓋物來制備的。所述平板在適合指示細菌(indicatorbacterium) 生長的條件下再次保溫過夜。抑菌圈半徑大于lmm的指示培養物可被考慮 為對所述檢測細菌敏感。長雙歧桿菌AH1205能夠抑制所有檢測的致病性 生物體的生長，所測定的透明圈對鼠沙門氏菌，空腸彎曲桿菌，大腸桿菌 0157: H7和艱難梭菌分別為8.67、 >80、 4.33和11.67 mm。
實施例2: PBMC對長雙歧桿菌反應產生細胞因子
通過密度梯度離心從健康供體分離外周血單核細胞(PBMC)。用益生菌 菌株在37。C對PBMC剌激72小時。在此時，收集培養物上清液，離心， 分裝并保存于-70。C直到使用流式微珠陣列(BDBioSciences)來對IL-10的水 平進行分析。AH1205誘導人PBMC顯著分泌IL-10，提示這一益生菌株能 夠在體內誘導抗炎癥應答(圖3)。
實施例3:在鼠哮喘模型中長雙歧桿菌AH1205能夠減輕呼吸道疾病
本研究調査了是否益生菌長雙歧桿菌AH1205能否抑制過敏性氣道炎 癥的卵清蛋白(OVA)致敏小鼠模型中的過敏反應。簡言之，通過在0天和6 天腹腔注射OVA致敏成年雄性BALBZc小鼠。在12天和14天用OVA進 行鼻內攻擊。在最后一次攻擊(第15天)的24小時之后，測定小鼠的氣道反 應性之后進行BAL程序。OVA/alum致敏的、鹽水攻擊的小鼠用作對照。 整個試驗期間動物都接受益生菌或安慰劑。采用支氣管肺泡(BAL)灌洗液中 的炎癥細胞計數來對氣道炎癥(細胞因子和細胞計數)進行分析。還采用 Buxco整體體積描記圖測定氣道反應性。還從OVA致敏的小鼠中分離脾細 胞，并在存在抗CD-3和抗CD-28抗體的條件下進行保溫，之后通過流式 細胞術測定上清液中的細胞因子水平。
與肉湯飼喂的動物相比，在OVA攻擊之后，長雙歧桿菌AH1205并未 導致從BAL液中回收的細胞數明顯降低(圖4)。測定氣道反應性，且與鹽 水刺激的小鼠相比時，用OVA對致敏小鼠進行的攻擊增加了對醋甲膽堿的 AHR。正如通過變長的停頓的變化所測定的那樣，AH1205并不能調節對于 醋甲膽堿的這種增高的氣道反應性(圖5)。
通過細胞珠陣列測定了 BAL細胞因子水平，并且證明了與OVA對照 相比，飼喂AH1205的動物具有明顯降低的TNF-a水平(圖6C)。IL-10、INF-y、IL-6和CCL2水平沒有明顯的差異(圖6)。
實施例4: Treg效應物模型
本研究調查了在健康小鼠中益生菌攝取對于調節性T細胞數量和活性 的影響。將BALB/c小鼠(IO只/組)飼喂長雙歧桿菌AH1205或安慰劑3周。 在益生菌/安慰劑攝取之后，分離CD4+CD25+ T調節細胞，并通過使用流 式細胞術測定抗CD3/CD28刺激的CFSE-標記的CD4+應答T細胞的增殖來 確定其體外抑制活性。將CD4+應答T細胞與CD4+CD25+ T細胞共保溫作 為對照。在益生菌或安慰劑詞喂小鼠的脾臟中，確定小鼠脾細胞中同樣是 FoxP3陽性的CD4+CD25+細胞(調節性T細胞)的百分數。
將與來自益生菌/安慰劑飼喂小鼠的CD4+CD25+細胞共保溫時增殖的 CD4+細胞的百分數與來自相同處理小鼠的CD4+CD25-細胞共保溫時增殖 的CD4+細胞的百分數進行比較。在每種情況下，與含有單獨的CD4細胞 以及耗盡CD25+細胞的培養物相比，在含有CD4+CD25+細胞的培養物中， T細胞的增殖有所下降(圖7)。
確定了在CD4+類群中同樣是CD25+的細胞百分數(圖8)。與其安慰劑 飼喂的對應物相比，長雙歧桿菌AH1205詞喂組具有明顯更多的CD25+的 CD4+T細胞(即T-調節細胞)。這說明通過詞喂AH1205，在CD4+類群中的 T-調節細胞的百分數明顯增加。
還測定了益生菌或安慰劑飼喂小鼠的全部脾細胞類群中的 CD4+CD25+FoxP3+細胞的數量。與飼喂安慰劑或未飼喂小鼠相比，在益生 菌詞喂的小鼠的脾臟中表達FoxP3的CD4+CD25+T調節細胞數量未發生改 變。
實施例5:無菌模型
購買6周齡的無菌小鼠，并保持在UCC生物服務中心的無菌單位中。 動物攝取益生菌長雙歧桿菌AH1205 9天或保持無菌狀態。通過流式細胞術 分析T調節細胞的誘導，并通過CBA定量細胞因子的水平。
通過在研究過程中測定選擇性瓊脂上的雙歧桿菌計數來分析AH1205 的轉移。即使每天給藥約口109生物體，AH1205也并未以可檢測的數量在 無菌小鼠的消化道中轉移。結果提示雙歧桿菌在消化道內的成活需要其他的微生物或宿主因子。
盡管AH1205并未以可檢測的數量在消化道內轉移，但所述細菌確實 與宿主的免疫系統相互作用。在9天飼喂之后，在AH1205飼喂的無菌動 物腸系膜淋巴結和脾臟中的CD4+CD25+FoxP3+細胞數量都有明顯增加(圖 9)。總CD3/CD4或CD3/CD8計數保持不變。
使用抗CD3/CD28抗體或LPS在體外刺激分離的腸系膜淋巴結細胞 (MLNC)及脾細胞，或保持未刺激的狀態作為陰性對照。對小鼠預飼喂 AH1205時，在CD3/CD28刺激之后，培養物上清液中MLNC的IL-6和INF-y 的分泌都實質上(substantially)降低，而MCP-1水平也明顯抑制(圖10)。在 各組之間的IL-10水平保持類似。預飼喂AH1205時，IL-6和TNF-a的脾 細胞釋放都為實質上但不顯著的降低(圖11)。在未刺激或LPS刺激的培養 物中未注意到明顯的差異，但總的說來發明人從雙歧桿菌AH1205飼喂動 物中觀察到了較低的促炎癥細胞因子產生。
實施例6:穩定性結果
益生菌菌株AH1205的穩定性在30°C條件下在3個月發生了改變(圖
12)。
乳桿菌GG在所述檢測階段的表現不好，在3個月的時間段中有兩個 bg單位的下降，而菌株AH1205在相同檢測階段中存活力下降了高達約1 個log單位。
免疫調節
人類免疫系統在多種人類疾病的病源學和病理學中起重要作用。高免 疫反應和低免疫反應可導致大部分疾病狀態，或是其組成部分。 一種生物 學實體家族，稱為細胞因子，對免疫過程的控制尤其重要。這些微妙細胞 因子網絡的擾動越來越多地與多種疾病的相關。這些疾病包括但不限于， 炎性疾病、免疫缺陷、炎性腸病、腸易激綜合征、癌癥(尤其是那些胃腸和 免疫系統的癌癥)、腹瀉性疾病、抗生素相關的腹瀉、兒科腹瀉、闌尾炎、 自身免疫紊亂、多發性硬化、阿爾茨海默氏病、類風濕性關節炎、乳糜泄 (coeliac disease)、糖尿病、器官移植、細菌感染、病毒感染、真菌感染、牙 周病、泌尿生殖器疾病、性傳播疾病、fflV感染、HIV復制、HIV相關腹瀉、手術相關創傷、手術誘導的轉移性疾病、敗血癥、體重下降、厭食癥、
發燒控制、惡病質(cachexia)、創傷愈合、潰瘍、消化道屏蔽功能、過敏、 哮喘、呼吸疾病、循環疾病、冠心病、貧血、血凝系統疾病、腎病、中樞 神經系統疾病、肝病、局部缺血、營養不良、骨質疏松癥、內分泌紊亂、 表皮疾病、銀屑病和尋常痤瘡。對每一種所檢測益生菌株而言，其對于細 胞因子產生的效果都是特異性的。因此，可根據針對具體疾病類型的專門 性細胞因子失調來選擇具體的益生菌株。可使用單獨的AH1205菌株或其 突變株或變異株或選定的這些菌株來實現對疾病特異性治療的定制。
免疫教育
腸道菌群對于腸道免疫系統的發育和適當功能具有重要的作用。在腸 道菌群缺乏的時候，腸道免疫系統是發育不全的，正如在無菌動物模型中 所證明的那樣，而且某些功能性參數也降低了，例如巨噬細胞吞噬能力和 免疫球蛋白生成(IO)。消化道菌群在刺激性非傷害性免疫反應中的重要性也 變得愈發明顯。在西方世界中過敏發生及嚴重性的增加與衛生保健和公共 衛生的改善以及宿主收到的感染刺激的數量和范圍的降低有關。這種免疫 刺激的缺乏可允許宿主與非致病性，但具有抗原性的因子反應，從而導致 過敏或自身免疫。 一系列非致病性免疫調節細菌的故意攝取可以為宿主提 供必需和適當的教育性剌激從而提供免疫功能的適當發育和控制。
炎癥
炎癥是用來描述在承受物理傷害，感染或正在發生免疫反應的位點上 液體，血漿蛋白和白細胞局部聚集的術語。對炎癥反應的控制可在多個水 平中實施(ll)。控制因素包括細胞因子，激素(例如氫化可的松)，前列腺素， 反應中間體和白細胞三烯。細胞因子是低分子量的具有生物活性的蛋白，
其涉及免疫學和炎癥反應的產生與控制，同時還可調控發育，組織修復和 造血作用。其為白細胞自身以及與其他細胞類型之間提供了交流的渠道。 大多數細胞因子都是多效性的并可表達多種生物學重疊的活性。控制炎癥 反應的是細胞因子級聯反應和網絡，而并非是特定細胞因子對特定細胞類 型的作用(12)。炎癥反應的減弱導致了較低濃度的適當激活信號，而其他的 炎癥介導物則導致了炎癥反應的停止。TNFa是一種關鍵的促炎癥細胞因子，由于其啟動了一些列細胞因子和生物學作用，導致了炎癥狀態。因此，
能夠抑制TNFa的制劑目前均被用于治療炎癥疾病，例如，英利昔單抗 (infliximab)。
促炎癥細胞因子被認為在許多炎癥疾病，包括炎性腸病(IBD)中起到重 要的作用。目前針對于治療IBD的療法都旨在降低這些促炎癥細胞因子， 包括IL-8和TNFct的水平。這樣的療法在治療系統性炎癥疾病例如類風濕 性關節炎時也能夠具有重要的作用。
本發明所述菌株在一系列炎癥疾病的治療中都具有潛在的應用，尤其 是與其他抗炎癥療法，例如非類固醇抗感染藥物(NSAID)或英利昔單抗組合
使用時。
細胞因子與癌癥
跨廣譜腫瘤類型的多功能細胞因子的產生提示在患有癌癥的患者中正 在進行明顯的炎癥反應。目前尚不清楚何種這類應答的保護性效果會對體 內腫瘤細胞的生長于發育有不利作用。然而，這些炎癥反應都能夠不利地 影響到帶有腫瘤的宿主。復雜的細胞因子相互作用都參與在腫瘤與正常組 織中細胞因子產生與細胞增殖的調控(13， 14)。長期以來都認為體重下降(惡 病質)是在癌癥患者中的單一最常見死亡原因，且初始的營養不良也指出不 良的預后。對腫瘤的生長于擴散而言，其必需誘導新生血管的形成并分解 細胞外基質。炎癥反應對以上機制的實施具有重要的作用，因此對宿主的 衰弱以及腫瘤的發展有一定作用。由于嬰兒長雙歧桿菌具有的抗炎癥性質， 這些細菌菌株能夠降低惡性細胞轉化的比率。此外，腸道細菌能夠從膳食 化合物中產生具有遺傳毒性，致癌性以及腫瘤促進活性的物質，而消化道 細菌則能夠活化促致癌物為DNA反應活性制劑(15)。 一般地，與消化道內 的其他類群，例如擬桿菌屬，真細菌屬和梭菌綱的微生物相比，雙歧桿菌 的種類都具有較低的異型生物質代謝酶。因此，消化道內雙歧桿菌屬細菌 數量的增加也能夠有益地調節這些酶的水平。
疫苗/藥物遞送
大多數致病生物體都是通過粘膜表面進入的。可通過特定的傳染性制 劑對這些位點進行有效接種來保護免受侵染。迄今為止，口服疫苗策略都集中于在對活致病性生物體的減毒或純化的膠囊化抗原的使用中(16)。經工 程化能夠從感染性制劑中產生抗原的益生菌，在體內，提供了極具前景的
替代品，因為對人類的攝取而言，這些細菌被認為是安全的(GRAS狀態)。 小鼠的研究證明攝取表達外源抗原的益生菌能夠提高保護性的免疫應 答。可在乳酸桿菌中表達編碼破傷風毒素片段C(TTFC)的基因，并通過口 服途徑免疫小鼠。這樣的系統能夠誘導抗體滴度明顯高至足以保護小鼠免 受致死性毒素的刺激。除抗原提呈外，活細菌載體也能夠在體內產生具有 生物活性的化合物，例如具有免疫刺激作用的細胞因子。在鼻內免疫的小 鼠中，乳酸桿菌分泌的具有生物活性的人IL-2或IL-6和TTFC能夠誘導 10-15倍以上的血清IgG滴度(17)。然而，采用這一特定的細菌菌株，通過 與這些細胞因子的共表達，總IgA水平并未升高。也對其他的細菌菌株， 例如格氏鏈球菌(Streptococcus gordonii)，進行了其作為粘膜疫苗有用性的檢 測。定植于鼠口腔與鞘膜腔的重組格氏鏈球菌可誘導對于該細菌所表達抗 原的粘膜與系統性抗體反應(18)。因此，使用益生菌作為載體進行的口服免 疫不僅可以保護宿主免受感染，還能夠取代病原體正常引起的免疫刺激， 從而有益于宿主的免疫教育。
顯生兀
益生性生物體的引入是通過以適當的載體攝入微生物來實現的。其益 處在于提供了能夠在大腸中促進這些益生菌株生長的介質。 一種或多種寡 糖，多糖或其他益生菌的加入都能夠促進在胃腸道中乳酸細菌的生長。益 生元是指任意非活性的食物成分，其是由被認為是具有陽性價值的內源性 細菌，例如雙歧桿菌，乳酸桿菌在結腸中特異性的發酵而成的。益生元的 類型可包括果糖，木糖，大豆，半乳糖，葡萄糖和甘露糖。益生菌株與一 種或多種益生元化合物的組合給藥可增強體內所述給藥益生菌的生長，從 而導致更有力的健康受益，且被稱為合益作用(synbiotic)。
其他活性成分
應該理解益生菌株可預防性給藥或以其本身或與上述的其他益生菌和/ 或益生元物質一起作為治療方法。此外，所述細菌可作為使用其他活性物 質的預防或治療方案的一部分，例如那些用于治療炎癥或其他病癥特別是免疫相關病癥的方案。這樣的組合可作為單一制劑給藥或在相同或不同時 間且使用相同或不同的給藥途徑作為分離的制劑給藥。
本發明并不局限于本說明書中所述的實施方案，其可在細節中有所改變。參考文獻
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權利要求
1.保藏號為NCIMB41387的長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)菌株AH1205或其突變株或變異株。
2. 權利要求1的雙歧桿菌菌株，其中所述突變株是遺傳修飾的突變株。
3. 權利要求1的雙歧桿菌菌株，其中所述變異株是天然存在的雙歧桿 菌變異株。
4. 權利要求1的雙歧桿菌菌株，其是益生菌。
5. 權利要求1或4的雙歧桿菌菌株，其中所述菌株是生物學純培養物 的形式。
6. 雙歧桿菌NCIMB41387的分離株。
7. 活性細胞形式的權利要求1-6中任一權利要求所述的雙歧桿菌菌株。
8. 非活性細胞形式的權利要求1-6中任一權利要求所述的雙歧桿菌菌株°
9. 權利要求1-8中任一權利要求所述的雙歧桿菌菌株，其中所述雙歧 桿菌是從嬰兒糞便中分離的。
10. 權利要求1-9中任一權利要求所述的雙歧桿菌菌株，其中所述菌株 在口服之后在人中具有明顯的免疫調節性。
11. 包含權利要求1-10中任一權利要求所述雙歧桿菌菌株的制劑。
12. 權利要求ll的制劑，其還含有益生性物質(probioticmaterial)。
13. 權利要求11或12中任一權利要求所述的制劑，其還含有益生元物 質(prebiotic material)。
14. 權利要求11-13中任一權利要求所述的制劑，其還含有可攝取的載體。
15. 權利要求14所述的制劑，其中所述可攝取的載體是藥用的可接受 載體，例如膠囊、片劑或粉末。
16. 權利要求14所述的制劑，其中所述可攝取的載體是食物制品，例 如酸化乳、酸奶、冷凍酸奶、奶粉、濃縮奶、軟干酪、調料或飲料。
17. 權利要求11-16中任一權利要求所述的制劑，其還含有蛋白質和/ 或肽，特別是富含谷氨酰胺/谷氨酸的蛋白質和/或肽、脂質、碳水化合物、 維生素、礦物質和/或痕量元素。
18. 權利要求11-17中任一權利要求所述的制劑，其中雙歧桿菌菌株在 每克所述制劑中以大于106cfb的量存在。
19. 權利要求11-18中任一權利要求所述的制劑，其還含有佐劑。
20. 權利要求11-19中任一權利要求所述的制劑，其還含有細菌成分。
21. 權利要求11-20中任一權利要求所述的制劑，其還含有藥物實體。
22. 權利要求11-21中任一權利要求所述的制劑，其還含有生物學化合物。
23. 權利要求11-22中任一權利要求所述的制劑，其用于免疫和接種方
24. 權利要求1-10中任一權利要求所述的雙歧桿菌菌株或權利要求 11-23中任一權利要求所述的制劑，其用于食物中。
25. 權利要求1-10中任一權利要求所述的雙歧桿菌菌株或權利要求 11-23中任一權利要求所述的制劑，其用作藥物。
26. 權利要求1-10中任一權利要求所述的雙歧桿菌菌株或權利要求 11-23中任一權利要求所述的制劑，其用于預防和/或治療不良炎性活性。
27. 權利要求1-10中任一權利要求所述的雙歧桿菌菌株或權利要求 11-23中任一權利要求所述的制劑，其用于預防和/或治療不良胃腸道炎性活 性，例如炎性腸病如克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎、腸易激綜合征、慢性腸 炎、或感染后結腸炎。
28. 權利要求1-10中任一權利要求所述的雙歧桿菌菌株或權利要求 11-23中任一權利要求所述的制劑，其用于預防和/或治療胃腸道癌癥。
29. 權利要求1-10中任一權利要求所述的雙歧桿菌菌株或權利要求 11-23中任一權利要求所述的制劑，其用于預防和/或治療系統性疾病例如類 風濕性關節炎。
30. 權利要求1-10中任一權利要求所述的雙歧桿菌菌株或權利要求 11-23中任一權利要求所述的制劑，其用于預防和/或治療由不良炎性活性所 引起的自身免疫失調。
31. 權利要求1-10中任一權利要求所述的雙歧桿菌菌株或權利要求 11-23中任一權利要求所述的制劑，其用于預防和/或治療由不良炎性活性所 引起的癌癥。
32. 權利要求1-10中任一權利要求所述的雙歧桿菌菌株或權利要求11-23中任一權利要求所述的制劑，其用于預防癌癥。
33. 權利要求1-10中任一權利要求所述的雙歧桿菌菌株或權利要求 11-23中任一權利要求所述的制劑，其用于預防和/或治療由不良炎性活性所 引起的腹瀉疾病，例如與艱難梭菌(Clostridiumdifficile)相關的腹瀉、與輪狀 病毒相關的腹瀉、或由感染性因子例如大腸桿菌所引起的感染后腹瀉或腹 瀉疾病。
34. 權利要求1-10中任一權利要求所述的雙歧桿菌菌株或權利要求 11-23中任一權利要求所述的制劑，其用于制備用于預防和/或治療不良炎性 活性的抗炎生物治療劑。
35. 權利要求34所述的雙歧桿菌菌株，其用于制備用于調節IL-10水 平的一組生物治療劑。
36. 權利要求1-10中任一權利要求的雙歧桿菌菌株或其具活性衍生片 段或突變株在預防和/或治療炎性疾病、免疫缺陷、炎性腸病、腸易激綜合 征、癌癥(尤其是那些胃腸和免疫系統的癌癥)、腹瀉性疾病、抗生素相關的 腹瀉、兒科腹瀉、闌尾炎、自身免疫紊亂、多發性硬化、阿爾茨海默氏病、 類風濕性關節炎、乳糜泄(coeliac disease)、糖尿病、器官移植、細菌感染、 病毒感染、真菌感染、牙周病、泌尿生殖器疾病、性傳播疾病、HIV感染、 HIV復制、HIV相關腹瀉、手術相關創傷、手術誘導的轉移性疾病、敗血 癥、體重下降、厭食癥、發燒控制(fever control)、惡病質(cachexia)、創傷 愈合、潰瘍、消化道屏蔽功能、過敏、哮喘、呼吸疾病、循環疾病、冠心 病、貧血、血凝系統疾病、腎病、中樞神經系統疾病、肝病、局部缺血、 營養不良、骨質疏松癥、內分泌紊亂、表皮疾病、銀屑病和/或尋常痤搭中 的用途。
37. 權利要求1-10中任一權利要求的雙歧桿菌菌株，其中所述菌株可 通過抗拮以及排除來自胃腸道中的促炎微生物來發揮作用。
38. 權利要求1-10中任一權利要求所述的雙歧桿菌菌株或權利要求 11-23中任一權利要求所述的制劑，其用于制備用于降低促炎細胞因子水平 的抗炎生物治療劑。
39. 權利要求1-10中任一權利要求所述雙歧桿菌菌株由于其具有拮抗 致病物種生長的能力從而用作抗感染益生菌株的用途。
全文摘要
本發明涉及口服攝取之后具有免疫調節作用且可用于預防和/或治療炎性活性，例如不良胃腸道炎性活性，例如炎性腸病的益生雙歧桿菌菌株AH1205或其突變株或變異株。
文檔編號C12N1/20GK101679938SQ200880017881
公開日2010年3月24日 申請日期2008年3月28日 優先權日2007年3月28日
發明者B·基利, D·歐沙利文, J·麥克謝里, L·歐馬奧尼 申請人:營養健康有限公司