高黑芥子酶活性益生菌菌株保藏方法
【專利摘要】本發明公開了一種高黑芥子酶活性益生菌菌株保藏方法，將高黑芥子酶活性益生菌菌株以2-5%接種量接種到50-100mLMRS液體培養基中37℃擴大培養24-48h，以使細菌生長進入穩定期，無菌的30-40%甘油與菌懸液各1mL加入滅菌的容量為3mL的離心管，塑料封口膜密封后放入-20℃冰箱保存0.5-1h后，立即放入冷凍罐中，使溫度均勻下降，然后放入液氮罐中保存。本發明重點考慮到溫度的驟然變化對菌體細胞的損傷影響，使菌體在面對低溫保存環境下，能最大限度保護菌體細胞崩解而造成的酶活性降低。本方法操作簡單，酶活性保持在高水平，而且花費少。
【專利說明】高黑芥子酶活性益生菌菌株保藏方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種益生菌保藏方法。
【背景技術】
[0002] 益生菌通常被定義為一類對宿主健康有益的活性微生物。一般認為其主要包括 三大類：第一大類乳酸桿菌類，常見的有嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、酪乳桿菌、詹氏乳桿 菌、拉曼乳桿菌；第二大類雙歧桿菌類，有長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、青春雙歧桿菌，此外 卵形雙歧桿菌和短雙歧桿菌也都是比較常見的；第三大類革蘭氏陽性球菌類，主要包括糞 鏈球菌、乳酸乳球菌等。另外，不少學者把酵母菌也歸為是益生菌的一種。
[0003] 顧名思義益生菌就是對人體有很強的益生功效的一類細菌。其具體表現在以下幾 個方面：益生菌可以有效地調節人體腸道，并對腹瀉起到一定的預防作用。如果能及時補充 益生菌就可使人體腸道中的該益生菌成為優勢菌種，從而對致病菌的生長形成抑制作用， 這樣便有助于保持人體腸道的正常功能；益生菌有助于緩解過敏癥狀。過敏是由于人體的 免疫系統過于敏感誤把正常物質當成有害物質造成的，常見的有花粉過敏、過敏性皮炎和 哮喘等。一般認為益生菌抗過敏機制為抑制Th2細胞活性，提高Thl細胞活性使兩者達到 動態平衡來達到緩解過敏癥狀的目的。對于嬰幼兒來說，這是一個福音。嬰幼兒發生過敏 反應時，考慮到其年齡較小及正處于最重要的發育期，傳統的藥物治療過敏由于不可避免 的副作用必須認真考慮，而益生菌由于是人體腸道的有機組成部分故而是抗過敏的有效手 段。不僅如此，益生菌還可以以酸奶、乳飲料等多種載體的形式進入嬰幼兒體內，可接受性 強；益生菌有助于有效緩解乳糖不耐癥，益生菌可分泌P-半乳糖苷酶，可將乳糖分解為 乳酸，從而有效改善乳糖不耐癥。除此之外，益生菌還能降低人體膽固醇、預防肥胖、預防腫 瘤、增強人體免疫功能，對于高血壓也有一定的緩解功效。
[0004] 實驗室常用的益生菌保藏方法有：斜面劃線法、液體石蠟覆蓋法、甘油低溫冷凍法 和冷凍干燥保藏法。四種保藏方法各有優缺點，斜面劃線法最為簡單，將需要保存的益生菌 劃線接種到MRS固體斜面上，待菌株充分生長后，放入4°C冰箱中即可。該方法雖較簡單，實 驗室也經常用得到，但該方法的缺點就是保藏期較短，一般只有1-2個月，且保藏的益生菌 容易被污染；液體石蠟覆蓋法的保存期較長，可以達到1-2年。此方法的操作相對而言也算 比較簡單，但要注意隨時堅直放置，以使液體石蠟隨時保持對菌體的覆蓋；甘油低溫冷凍法 的保藏時間較長且不易產生變異，菌株損失率低，是實驗室經常選用的方法；冷凍干燥保藏 法，較為復雜，對實驗設備要求較高，但是具有保存時間較的優點長，最長可達數十年，因此 被譽為最有效的保藏方法。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種甘油低溫冷凍保藏高黑芥子酶活性益生菌菌株的方法。
[0006] 本發明的目的是通過以下技術方案實現的： 一種甘油低溫冷凍保藏高黑芥子酶活性益生菌菌株的方法，其具體實施步驟如下： 將高黑芥子酶活性益生菌菌株以2-5%接種量接種到50-100mL MRS液體培養基中37°C 擴大培養24-48h，以使細菌生長進入穩定期，無菌的30-40%甘油與菌懸液（60-70%)各ImL 加入滅菌的容量為3mL的離心管，塑料封口膜密封后放入-20°C冰箱保存0. 5-lh后，立即放 入冷凍罐(裝有90vol. %異丙醇+10vol. %酒精）中，使溫度均勻下降（24h內），然后放入液 氣罐中保存。
[0007] 本發明中，所述高黑芥子酶活性益生菌的篩選方法如下： 一、將待測益生菌于無菌條件下以2%接種量接種于改良MRS液體培養基中，于37°C恒 溫培養24h，如此反復活化2-3次即可使菌株恢復活力。
[0008] 本步驟中，所述益生菌為桿菌類益生菌(乳桿菌和雙歧桿菌)。
[0009] 本步驟中，所述改良MRS液體培養基的配制方法如下：蛋白胨10g、牛肉浸取物 l〇g、酵母提取物5. 0g、乙酸鈉5. 0g、檸檬酸鈉2. 0g、磷酸氫二鉀2. 0g、七水硫酸鎂0. 2g、 七水硫酸錳0.05g，溶于水，然后加 Iml吐溫80,用水調至1000ml。
[0010] 二、初篩：用含黑芥子硫苷酸鉀濃度為5mmol/L、不含葡萄糖的改良MRS培養液5mL 培養待篩菌株，培養時間48h，培養溫度30°C，觀察菌株生長情況，能夠正常生長的菌株用 于下一步實驗。
[0011] 本步驟中，所述含黑芥子硫苷酸鉀濃度為5mmol/L、不含葡萄糖的改良MRS培養液 的配制方法如下：無菌IOOmmoVL黑芥子硫苷酸鉀與改良MRS液體培養基以1:20的體積 比混合。
[0012] 三、復篩：配置葡萄糖和黑芥子硫苷酸鉀濃度均為lOmmol/L的改良MRS培養液， 將待篩選菌株按常規接種量接種到該改良MRS培養液30°C過夜培養12-18h，然后離心取 菌體，加入IOmL MES緩沖液沖洗菌體，再次離心后將菌體重懸于3mLMES緩沖液中，將菌 懸液與lOmmol/L黑芥子硫苷酸鉀的MES緩沖液按照1-1. 5:1的體積比混合，在30°C培養 24-48h，最后離心取上清液在340nm處測定吸光度，篩選出吸光度值差異在0. 2以上的菌 株。
[0013] 本步驟中，所述lOmmol/L葡萄糖、lOmmol/L黑芥子硫苷酸鉀改良MRS的配制 方法如下：①lOmmol/L葡萄糖改良MRS的配制：蛋白胨10g、牛肉浸取物10g、酵母提取 物5. 0g、乙酸鈉5. 0g、檸檬酸鈉2. 0g、磷酸氫二鉀2. 0g、七水硫酸鎂0. 2g、七水硫酸錳 0. 05g，1.8g葡萄糖溶于水，然后加Iml吐溫80,用水調至1000ml。②10mmol/L葡萄糖改 良MRS與無菌lOOmmol/L黑芥子硫苷酸鉀以20:1的體積比混合。
[0014] 本發明采用自制的冷凍配方及冷凍罐，重點考慮到溫度的驟然變化對菌體細胞的 損傷影響，使菌體在面對低溫保存環境下，能最大限度保護菌體細胞崩解而造成的酶活性 降低。本方法操作簡單，酶活性保持在高水平，而且花費少。
【具體實施方式】
[0015] 下面對本發明的技術方案作進一步的說明，但并不局限于此，凡是對本發明技術 方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，均應涵蓋在本發明 的保護范圍中。
[0016] 一、高黑芥子酶活性益生菌菌株的篩選 1、益生菌的初篩 本實驗所用待測菌株為乳桿菌包括：嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、德氏 乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、棒狀乳桿菌、副干酪乳桿菌、雙歧桿菌。
[0017] 將待篩選的乳酸桿菌接種于含黑芥子硫苷酸鉀濃度為5mmol/L，不含葡萄糖的改 良MRS液體培養基5mL中培養待篩菌株，培養時間為48h，溫度為30°C。培養結束后觀察到 乳酸桿菌的生長情況，能夠正常生長的菌株用于下一步實驗。
[0018] 2、益生菌的復篩 將初篩得到的菌接種到葡萄糖和黑芥子硫苷酸鉀濃度均為10 mmol/L的改良MRS培養 液中301：過夜培養（12-1811)后離心（41：，10111111，700(^)，加入1011111^3緩沖液（30臟〇1/1 MES, Bmmol /T, MgCl2, 2mmol/L Vc，NaOH調節 pH=6. 5,121°C高壓蒸汽滅菌 15min)反復沖洗菌 體后再次離心（4°C，10min，7000g)，將菌體重懸于3mLMES緩沖液中，菌懸液與含10 mmol/ L黑芥子硫苷酸鉀的MES緩沖液各ImL混合，30°C分別培養24 h和48 h。最后離心（4°C， lOmin，IOOOOg)取上清液在340 nm處測定吸光度（用含5mmol/L黑芥子硫苷酸鉀的MES 緩沖液調零），與Oh的吸光度值作差，若二者差值越大，則表明黑芥子硫苷酸鉀被益生菌分 解，說明待篩益生菌菌株黑芥子酶的活性越大。
[0019] 綜合考慮初篩和復篩的情況，認為益生菌副干酪乳桿菌具有較高較穩定的黑芥子 酶活性，是希望得到的益生菌。
[0020] 二、菌株保藏 1、甘油低溫冷凍保藏法 (1) 30%甘油配制（L):取300ml甘油和700ml無菌水混勻，121°C高壓蒸汽滅菌30min。
[0021] (2)實驗方法：益生菌菌株副干酪乳桿菌以2%接種量接種到50mL MRS液體培養 基中37°C擴大培養24h，以使細菌生長進入穩定期，無菌的30%甘油與菌懸液各ImL加入滅 菌的容量為3mL的離心管，塑料封口膜密封后放入-20°C冰箱作中期保存。
[0022] 2、冷凍干燥保藏法 (1)5%蔗糖溶液配制（L):稱取50g蔗糖加無菌水至IL充分溶解，121°C高壓蒸汽滅 菌 30min。
[0023] (2)實驗方法：益生菌菌株副干酪乳桿菌以2%接種量接種到IL MRS液體培養基中 37°C擴大培養24h，使菌株進入穩定期后離心取菌泥，加入等體積無菌保護劑5%蔗糖溶液 震蕩混勻后，轉移到無菌平皿中用塑料封口膜密封后放入_20°C冰箱預凍12h，預凍完成后 在封口膜上扎若干個小孔便于透氣，然后轉移到真空冷凍干燥機中冷凍干燥12h。冷凍干燥 完成后將菌體制成菌粉，將菌粉轉移到菌粉保藏用密封袋中密封，整個過程均為無菌操作。 最后將密封袋放入-20°C冰箱作長期保存。
[0024] 3、活化 將保存一個月的菌種進行活化，取出保藏的菌株在無菌條件下使用接種環挑取少量菌 粉或適量菌懸液接種到改良的MRS液體培養基中，每種保存方法取三個平行，37°C恒溫培 養24h，這一代菌株稱作活化的第一代。取該菌株于無菌條件下以2%接種量接種于改良MRS 液體培養基中，于37°C恒溫培養24h，該菌株被稱為第二代，再按此方法活化一代的菌株稱 為第三代。觀察兩種保存方法每一代菌株的生長情況，并記錄。甘油低溫冷凍保藏法和冷 凍干燥保藏法菌株活化生長情況如下表1所示。
[0025] 表1副干酪乳桿菌活化生長情況
【權利要求】
1. 一種高黑芥子酶活性益生菌菌株保藏方法，其特征在于所述方法步驟如下： 將高黑芥子酶活性益生菌菌株以2-5%接種量接種到50-100mL MRS液體培養基中37°C 擴大培養24-48h，以使細菌生長進入穩定期，無菌的30-40%甘油與菌懸液各lmL加入滅菌 的容量為3mL的離心管，塑料封口膜密封后放入-20°C冰箱保存0. 5-lh后，立即放入冷凍罐 中，使溫度均勻下降，然后放入液氮罐中保存。
2. 根據權利要求1所述的高黑芥子酶活性益生菌菌株保藏方法，其特征在于所述高黑 芥子酶活性益生菌的篩選方法如下： 一、 將待測益生菌于無菌條件下以2%接種量接種于改良MRS液體培養基中，于37°C恒 溫培養24h，如此反復活化2-3次即可使菌株恢復活力； 二、 初篩：用含黑芥子硫苷酸鉀濃度為5mmol/L、不含葡萄糖的改良MRS培養液5mL培 養待篩菌株，培養時間48h，培養溫度30°C，觀察菌株生長情況，能夠正常生長的菌株用于 下一步實驗； 三、 復篩：配置葡萄糖和黑芥子硫苷酸鉀濃度均為10mm〇l/L的改良MRS培養液，將待 篩選菌株按常規接種量接種到該改良MRS培養液30°C過夜培養12-18h，然后離心取菌體， 加入lOmLMES緩沖液沖洗菌體，再次離心后將菌體重懸于3mLMES緩沖液中，將菌懸液與 10mmol/L黑芥子硫苷酸鉀的MES緩沖液按照1-1. 5:1的體積比混合，在30°C培養24-48h， 最后離心取上清液在340nm處測定吸光度，篩選出吸光度值差異在0. 2以上的菌株。
3. 根據權利要求2所述的高黑芥子酶活性益生菌菌株保藏方法，其特征在于所述益生 菌為桿菌類益生菌。
4. 根據權利要求2所述的高黑芥子酶活性益生菌菌株保藏方法，其特征在于所述改良 MRS液體培養基的配制方法如下：蛋白胨10g、牛肉浸取物10g、酵母提取物5. 0g、乙酸鈉
5. 〇g、檸檬酸鈉2. 0g、磷酸氫二鉀2. 0g、七水硫酸鎂0. 2g、七水硫酸錳0. 05g，溶于水，然 后加 lml吐溫80,用水調至1000ml。
5. 根據權利要求2或4所述的高黑芥子酶活性益生菌菌株保藏方法，其特征在于所述 含黑芥子硫苷酸鉀濃度為5mmol/L、不含葡萄糖的改良MRS培養液的配制方法如下：無菌 100mm 〇l/L黑芥子硫苷酸鉀與改良MRS液體培養基以1:20的體積比混合。
6. 根據權利要求2所述的高黑芥子酶活性益生菌菌株保藏方法，其特征在于所述 10mmol/L葡萄糖、10mmol/L黑芥子硫苷酸鉀改良MRS的配制方法如下：①10mmol/L葡萄糖 改良MRS的配制：蛋白胨10g、牛肉浸取物10g、酵母提取物5.0g、乙酸鈉5.0g、檸檬酸鈉
2.(^、磷酸氫二鉀2.(^、七水硫酸鎂0.28、七水硫酸錳0.058，1.88葡萄糖溶于水，然后加 lml吐溫80,用水調至1000ml。
7. ②10mm〇l/L葡萄糖改良MRS與無菌100mm〇l/L黑芥子硫苷酸鉀以20:1的體積比混 合。
8. 根據權利要求1所述的高黑芥子酶活性益生菌菌株保藏方法，其特征在于所述30% 甘油配制方法為：取300ml甘油和700ml無菌水混勻，121 °C高壓蒸汽滅菌30min。
9. 根據權利要求1所述的高黑芥子酶活性益生菌菌株保藏方法，其特征在于所述冷凍 罐中裝有90%異丙醇+10%酒精。
【文檔編號】C12R1/01GK104293669SQ201410530160
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月10日 優先權日:2014年10月10日
【發明者】單毓娟, 張蘭威, 李寶龍, 任明華, 宋微, 雷鵬, 何燦霞, 田思聰 申請人:哈爾濱工業大學