專利名稱：對源自hsp65的肽-6有特異性的人源化抗體及其方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及人源化的對源自HSP65的肽(具體而言，肽-6)有抗性的抗體及其任何抗原結合片段。更具體而言，本發明涉及用于治療免疫相關病癥的人源化抗肽-6抗體、組合物、方法及其用途。
背景技術：
將本申請中提及的所有出版物都通過援引完整地并入本文，包括其中所引用的所有參考文獻。、結核分枝桿菌(MT)的65kDa熱休克蛋白(HSP65)在自身免疫性關節炎的發病機理中起重要作用。其效果在佐劑性關節炎(AA)的實驗模型中得到了良好的例證。通過皮內接種懸浮于弗氏佐劑中的熱滅活分枝桿菌，可以在諸如Lewis或Wistar等大鼠的易感近交系中誘導AA。可以通過對HSP65的180 188位殘基有反應性的T細胞克隆來被動轉移AA[Holoshitz, J.等，Science 219:56-58(1983)]。已報道的證據表明，抵御疾病的保護作用可能是由針對HSP65的細胞應答引起的[Lider, 0.等，Proc. Natl. Acad. Sci. 84:4577-4580 (1987) ；Moudgil, K.等，J. Exp.Med. 185:1307-1316 (1997)]，這表示該蛋白含有參與發病機理和抗性獲得的不同表位。本發明人之前已指出，對AA的抗性還可以通過針對HSP65的抗體來賦予，并且可以通過向易患關節炎的大鼠靜脈內輸注來自具有關節炎抗性的品系的免疫球蛋白來被動轉移[Ulmansky, R.,和 Naparstek, Y. Eur. J. Tmmuno1. 25:952-957 (1995)]。進一步的分析明確了抗HSP保護性抗體對31 46位氨基酸殘基(命名為肽_6，且由SEQ ID NO: 15表示)的表位特異性[Ulmansky, R.和 Naparstek, Y. J. Eur. J. Tmmuno1. 168:6463-6469 (2002)]。用此肽對Lewis大鼠進行的疫苗接種導致產生了針對全分子的抗體以及對疾病誘導的抗性。本發明人之前已指出，針對肽-6的多克隆抗體刺激外周血單個核細胞(PBMC)產生白細胞介素-10 (IL-10) [Ulmansky (2002)，同上]。抗炎細胞因子IL-10在先天性免疫中起重要作用，主要是由于其使炎性應答受到抑制的抑制效果。據顯示，本發明人制造的單克隆抗肽-6抗體通過與PBMC結合并刺激該細胞分泌IL-10而保留了這種保護性效果。本發明人還指出針對肽-6的抗體不僅與肽-6相互作用，而且它們還直接與巨噬細胞的表面配體發生明顯的交叉反應，這種相互作用是理解這些抗體的作用機制的關鍵。在抗肽-6抗體結合巨噬細胞后，會激活導致細胞因子(特別是IL-10)的產生和分泌增加的信號轉導途徑。作為抗炎細胞因子，IL-10削弱并抑制炎性過程，從而使炎性病癥得到改善和治療。這會使諸如腫瘤壞死因子a (THF-a)等促炎Thl細胞因子與諸如IL-10等抗炎Th2細胞因子間的平衡發生傾斜。因此，利用抗肽-6抗體將Thl/Th2平衡向Th2抗炎應答的方面調節，適用于治療炎性病癥。然而，施用嚙齒動物抗體或抗體片段具有限制其在人體中的適用性的缺點，該缺點部分上是由這些抗體或其片段的免疫原性造成的。為了克服嚙齒動物抗體的這些不期望的性質，已通過用人抗體的區域對除抗原結合部位以外的框架區進行置換而開發了人源化抗體。制備此類人源化抗體的常用方法基于對編碼人抗體的基因的選擇，所述人抗體顯示出與小鼠抗體最接近的序列相似性，并且使用CDR移植法僅將該人抗體的互補決定區(CDR)置換成小鼠抗體的互補決定區。人源化抗體的優勢在于減少體內免疫應答。然而，當僅將CDR移植到人抗體上時，其選擇性和反應性經常會受到損害。此外，雖然人源化技術已提供了在施用給人時通常具有良好耐受性且免疫原性通常小于非人單克隆抗體的抗體。但已顯示，用這些技術產生的若干種抗體在患者中引發了免疫原性，即使此類抗體的遺傳起源是人。這種對免疫原性的誘導可能是因為在抗體可變區內存在小段的非自身氨基酸序列，所述小段的非自身氨基酸序列在某些情況下能夠產生T細胞表位，這些T細胞表位誘導導致免疫原性的T細胞應答。抗肽-6抗體作為免疫調節劑的潛在用途需要產生具有降低的抗原潛力的人源化抗體。因此有需要產生具有高比例的人源序列且避免形成可能誘導T細胞應答的序列的高特異性人源化抗肽-6抗體。因此本發明的目的是提供用于調節患有免疫相關病癥的受試對象中的Thl/Th2平衡的此類人源化抗肽-6抗體。本發明的各種目標將隨著描述的進行而變得明顯。
發明內容
根據第一方面，本發明涉及特異性地結合包含SEQ ID NO: 15的多肽的人源化抗體或其任何抗原結合片段。應注意的是，多肽SEQ ID勵:15，也稱為肽-6，源自肥 65。根據一個實施方式，本發明的人源化抗體包含(a)重鏈可變區，所述重鏈可變區包含位于H22位的Cys、位于H23位的Ser、位于H26位的Gly、位于H27位的Phe、位于H28位的Ser、位于H29位的Leu、位于H30位的Ser、位于H31位的Thr、位于H32位的Ser、位于H33位的Asn、位于H34位的Met、位于H35位的Gly、位于H35A位的Val、位于H35B位的Gly、位于H48位的Leu、位于H50位的His、位于H51位的He、位于H52位的Leu、位于H53位的Trp、位于H54位的Asn、位于H55位的Asp、位于H56位的Ser、位于H57位的Lys、位于H58位的Tyr、位于H59位的Tyr、位于H60位的Asn、位于H61位的Pro、位于H62位的Ala、位于H63位的Leu、位于H64位的Lys、位于H65位的Ser、位于H92位的Cys、位于H95位的Met、位于H96位的Gly、位于H97位的Gly、位于H98位的Tyr、位于H99位的Tyr、位于HlOO位的Gly、位于H100A位的Asn、位于H100B位的Tyr、位于H100C位的Gly、位于H100D位的Tyr、位于H100E位的Tyr、位于H100F位的Ala、位于H100G位的Met、位于HlOl位的Asp和位于H102位的Tyr，且可選地包含位于H49位的Leu、位于H74位的Tyr、位于Hll位的lie、位于H41位的Ser和位于H108位的Ser中的至少一個；和(b)輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含位于LI位的Gin、位于L23位的Cys、位于L24位的Thr、位于L25位的Ala、位于L26位的Ser、位于L27位的Ser、位于L27A位的Ser、位于L28位的Val、位于L29位的Ser、位于L30位的Ser、位于L31位的Ser、位于L32位的Tyr、位于L33位的Leu、位于L34位的His、位于L47位的Trp、位于L50位的Ser、位于L51位的Thr、位于L52位的Ser、位于L53位的Asn、位于L54位的Leu、位于L55位的Ala、位于、L56位的Ser、位于L71位的Tyr、位于L88位的Cys、位于L89位的His、位于L90位的Gin、位于L91位的Tyr、位于L92位的His、位于L93位的Arg、位于L94位的Ser、位于L95位的Pro、位于L96位的Pro和位于L97位的Thr，且可選地包含位于L21位的Met、位于LlO位的Ile和位于L80位的Ala中的至少一個。應認識到的是，所有指出的位置都是根據Kabat編號系統來確定的。本發明的另一方面涉及包含有效量的至少一種分離且純化的本發明的人源化抗體作為活性成分的組合物。本發明還提供用于預防、治療、改善或抑制免疫相關病癥的藥物組合物。本發明的藥物組合物包含治療有效量的至少一種分離且純化的本發明的人源化抗體作為活性成分。在又一方面，本發明提供用于使有需要的受試對象(具體為患有免疫相關病癥的受試對象)中的IL-IO (白細胞介素-10)的表達和水平增加的組合物和方法。本發明的另一方面提供用于預防、治療、改善或抑制免疫相關病癥的治療或改善 的方法。本發明的方法包括以下步驟向有需要的受試對象施用治療有效量的至少一種分離且純化的本發明的人源化抗體或治療有效量的包含所述抗體作為活性成分的組合物。根據一個實施方式，本發明的方法可以特別適用于治療和改善諸如自身免疫病或炎性病癥等免疫相關病癥。此外，本發明提供包含至少一種分離且純化的本發明的人源化抗體和至少一種抗炎劑的聯合組合物。在某些實施方式中，此類抗炎劑可以選自由以下物質組成的組甲基強的松(MPS)、抗TNF劑、依那西普(Enbrel)、英夫利昔單抗(Remicade)、阿達木單抗(Humira)和賽妥珠單抗(Cimzia)、抗IL-6劑、托珠單抗(Actemra)、抗IL-1受體劑、kineret (阿那白滯素)、CTLA-4-Ig、阿巴西普(Orencia)、抗CD20劑、利妥昔單抗(MabThera; Rituxan)、氨甲喋呤、任何皮質類固醇衍生物和誘導任何信號傳導途徑的任何抗炎劑。更具體而言，附加的抗炎劑可以誘導與由抗肽-6抗體所誘導的途徑(例如，參與IL-10誘導的任何途徑)不同的途徑。所述聯合組合物還可選地包含藥學上可接受的載劑、賦形劑或稀釋劑。本發明的再一方面涉及用于在患有免疫相關病癥的受試對象中獲得療效的試劑盒，所述試劑盒包含(i)至少一種分離且純化的本發明的人源化抗體或其任何抗原結合片段或其藥學上可接受的衍生物，和藥學上可接受的載劑或稀釋劑，上述物可選地為第一單位劑型；(ii)至少一種抗炎劑，和藥學上可接受的載劑或稀釋劑，上述物可選地為第二單位劑型；和(iii)用于容納所述第一劑型和第二劑型的容器裝置。在某些實施方式中，本發明的試劑盒中所包含的抗炎劑可以選自由以下物質組成的組甲基強的松(MPS)、抗TNF劑、依那西普(Enbrel)、英夫利昔單抗(Remicade)J^J達木單抗(Humira)和賽妥珠單抗(Cimzia)、抗IL-6劑、托珠單抗(Actemra)、抗IL-I受體劑、kineret (阿那白滯素)、CTLA-4-Ig、阿巴西普(Orencia)、抗CD20劑、利妥昔單抗(MabThera; Rituxan)、氨甲喋呤、任何皮質類固醇衍生物和誘導任何信號傳導途徑的任何其他抗炎劑。本發明的另一方面涉及用編碼本發明的人源化抗體的表達載體轉化或轉染的宿主細胞系。更具體而言，本發明的宿主細胞系表達具有重鏈可變區和輕鏈可變區的人源化抗體，所述重鏈可變區包含由SEQ ID N0:21所表示的氨基酸序列，所述輕鏈可變區包含由SEQ ID N0:26所表不的氨基酸序列。在又一方面，本發明提供了嵌合單克隆抗體，所述嵌合單克隆抗體特異性地結合包含SEQ ID NO: 15的多肽或與包含SEQ ID NO: 15的任何多肽結合，其中，所述抗體包含人免疫球蛋白恒定區和鼠類免疫球蛋白可變區。借助于以下附圖，本發明的其他方面將變得明顯。
圖IA IB :嵌合小鼠-人抗肽-6抗體的氨基酸序列和核酸序列該圖示出了嵌合小鼠-人抗體的可變結構域的氨基酸序列和核酸序列。圖IA示出了小鼠抗體重鏈可變區的氨基酸序列(SEQ ID NO: I)和編碼核酸序列 (SEQ ID NO:3)o圖IB示出了小鼠抗體輕鏈可變區的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)和編碼核酸序列(SEQ ID NO:4)o根據Kabat進行CDR的界定和蛋白序列編號。CDR核昔酸和蛋白序列用下劃線標出。縮寫M. Heav. Ch. Seq.(小鼠重鏈序列)；M. Ligh. Ch. Seq.(小鼠輕鏈序列);SEQID NO:(序列識別號)。圖2 :VK表達載體pANTVK和VH表達載體pANTVhGl/4的圖解該圖顯示了示出關鍵遺傳元件和限制性酶切位點的VK和VH表達載體的圖解。用于在細菌中進行增殖的元件(包括ColEl復制子和氨芐青霉素抗性基因)未示出。縮寫Hin.(鉸鏈)。圖3A 3B :嵌合抗肽_6抗體與肽_6的結合曲線圖3A 3B示出了小鼠IgM(3A)和嵌合小鼠-人IgGl(3B)與以10 y g/ml包被的肽-6抗原的結合曲線。縮寫OD (光密度)。圖4 :復合抗體序列和比對的區段以及約束性氨基酸該圖示出了人源化的變體重鏈(VHl VH4)和變體輕鏈(VKl VK3)的氨基酸序列(第I行)、約束性殘基譜圖(第2行)和用于組裝不同變體的復合人序列的序列區段(第3行)(圖中的第3行由代表不同區段的第3、4、5行組成，這些區段由SEQ IDNO: 12 14,16 19及34 59、96及97表示)。縮寫VH(重鏈可變區)，VK(輕鏈可變區)，SEQ ID NO:(序列識別號)。圖5 :用于將合成的復合人抗體(Composite Human Antiboy) 的VH和VK基因克隆到表達載體中的側翼序列該圖示出了用于將合成的復合人抗體tI^VH和VK基因克隆到表達載體中的側翼序列(SEQ ID N0:5、6、7 和 8)。縮寫Flank. Seq.(側翼序列)，SEQ ID NO:(序列識別號)，VH(重鏈可變區)，VK (輕鏈可變區)。
圖6A 6G :不同的人源化抗體變體的氨基酸序列和核酸序列圖6A 6D顯示了氨基酸序列分別為SEQ ID NO: 20、21、22和23且核酸序列分別為SEQ ID勵:27、28、29和30的變體￥111 ￥114的重鏈可變區核苷酸序列和推定的氨基酸序列。圖6E 6G顯示了氨基酸序列分別為SEQ ID NO:24、25和26且核酸序列分別為SEQ ID NO: 31、32和33的變體VKl VK3的輕鏈可變區核苷酸序列和推定的氨基酸序列。根據Kabat進行⑶R的界定和蛋白序列編號。⑶R核昔酸和蛋白序列用下劃線標出。由原始雜交瘤序列發生了變化的氨基酸以粗體突出顯示。縮寫Var.(變體)，CDR (互補決定區)，VH (重鏈可變區)，VK (輕鏈可變區)，SEQID NO:(序列識別號)。
圖7A 7C :復合人抗體與肽-6的結合用ELISA測試了純化的復合人抗體變體與肽-6的結合。將抗體變體從100 U g/ml稀釋到6. 125 u g/ml,并且使之與包被有肽-6的NuncMaxiSorp 96孔平板結合。通過抗人IgG K HRP和TMB底物來檢測結合。在450nm處測量吸光度。縮寫VH(重鏈可變區)，VK (輕鏈可變區)，CH/CK嵌合小鼠抗體。OD (光密度)。圖8 :嵌合抗肽-6抗體刺激人巨噬細胞分泌IL-10該柱式圖示出了與不同劑量的嵌合小鼠-人抗肽-6抗體溫育了 48小時的人PBMC的IL-10分泌。將未處理的細胞作為對照。收集上清液并用IL-10ELISA檢測試劑盒(R&Dsystems)進行測定。縮寫Chim. M-H a-pept. 6 (嵌合小鼠抗人肽_6), a (抗)，U. T.(未處理的)。圖9 :嵌合抗肽-6抗體抑制已建立的AA的嚴重程度該圖示出了用小鼠IgM抗體、嵌合小鼠-人IgGl抗肽-6抗體、對照嵌合抗體利妥昔單抗(Rituximab)和鹽水處理過的不同實驗組的的動物關節炎評分。關節炎評分是6 7只動物的平均值。*在第20天與用鹽水處理過的大鼠相比，p〈0. 05。縮寫D. A. Ind. AA.(誘導關節炎后的天數)；Sal.(鹽水);Chim. M-H(嵌合小鼠抗人)；AA Sc.(關節炎評分)。圖IOA IOB :嵌合抗肽-6抗體抑制已建立的AA的嚴重程度該圖繪出并比較了用嵌合小鼠-人抗肽-6抗體處理過的大鼠(圖10B)的關節用對照抗體利妥昔單抗處理過的大鼠(圖10A)的關節的病理學發現。縮寫Chim. M-H pept. 6 (嵌合小鼠抗人肽_6)。圖11 :嵌合抗肽_6抗體、MPS和Enbrel對已建立的AA的影響該圖示出了用嵌合小鼠-人IgGl抗肽-6抗體、甲基強的松(MPS)或Enbrel及其與所述嵌合小鼠-人抗體的組合處理過的不同實驗組的動物的關節炎評分。關節炎評分是6只動物的平均值。在第21天將嵌合抗肽-6抗體、Enbrel或MPS分別與PBS比較，p〈0. 05、p〈0. 02、p〈0. 05。在第19天將MPS與PBS比較，p〈0. 05。分別在第21天和第23天將嵌合抗肽-6抗體+Enbrel與PBS比較，p〈0. 02和p〈0. 05。分別在第18、19、21和23天將嵌合抗肽-6 抗體 +MPS 與 PBS 比較，p〈0. 02、p〈0. 02、p〈0. 01 和 p〈0. 05。縮寫D. A. Ind. AA.(誘導關節炎后的天數);Chim. M-H(嵌合小鼠抗人)；Chim.
(嵌合)；AA Sc.(關節炎評分)。
圖12A 12C :人源化抗肽-6抗體與人巨噬細胞(⑶14+細胞)結合單獨用抗⑶14抗體(偶聯有APC)對人PBMC進行染色，或用該抗⑶14抗體與人源化VH2/VK3抗肽-6抗體(偶聯有FITC ；10ug) 一起對人PBMC進行雙染色。隨后用FACS對細胞進行抗體結合分析。圖12A、12B繪出了被抗⑶14染色了的細胞(A)和被抗⑶14和人源化抗體染色了的細胞(B)的密度圖。圖12C繪出了被染色的細胞的柱式圖。縮寫Hum.(人源化)；Cou.(計數)；a (抗)，VH(重鏈可變區)，VK (輕鏈可變區)圖13 :人源化抗肽-6抗體結合過表達的His-CAPl，但不結合His-CREBP、
使用了商購的小鼠抗人CAPI、商購的小鼠抗His-tag和人源化的抗肽-6VH2/VK3變體來對過表達且純化的His-CAPl (I)和His-CREB(II)進行蛋白質印跡分析。縮寫aHum. CAPl (抗人 CAPl 抗體);aHis(抗 his-tag 抗體);Hum.a -pep. 6.(人源化的抗肽-6抗體，VH2/VK3變體)。圖14 :人源化抗肽-6抗體誘導人巨噬細胞分泌IL-10該柱式圖示出了與人源化抗肽-6抗體的兩種變體VH2/VK1和VH2/VK3溫育了 48小時的人PBMC的IL-10分泌。將未處理的細胞作為對照。收集上清液并用IL-10ELISA檢測試劑盒(R&D systems)進行測定。縮寫U. T.(未處理的)，VH(重鏈可變區)，VK (輕鏈可變區)。圖15A 15B :復合人抗體與肽_6的結合并不與IL-10誘導直接相關圖15A 33 u g/ml或100 u g/ml的不同的VH和VK人源化抗體變體的PBMC IL-10誘導能力。圖 I5B :肽 6 對 VHVVK2、VH2/VK3, VH2/VK1 和 VH2/VK2 的親和力。縮寫Chim.(嵌合體)；0D (光密度)；Ab. Cone.(抗體濃度)，U. T.(未處理的)，VH (重鏈可變區)，VK (輕鏈可變區)。圖16A 16C :人源化抗肽_6F(ab)2片段結合人巨噬細胞單獨用抗CD14抗體(偶聯有PE)對人PBMC進行染色，或用該抗CD14抗體與人源化VH2/VK3抗肽-6抗體的F (ab) 2片段(偶聯有FITC ；10ug) 一起對人PBMC進行雙染色。圖16A、16B繪出了被抗⑶14染色了的細胞(A)和被抗⑶14和人源化抗體的F(ab)2片段染色了的細胞(B)的密度圖。圖16C繪出了被染色的細胞的柱式圖。縮寫Frag.(片段)；Cou.(計數)；a (抗)，VH (重鏈可變區)，VK (輕鏈可變區)。圖17 :人源化抗肽_6F(ab)2片段誘導人巨噬細胞分泌IL-10該柱式圖示出了與人源化抗肽-6VH2/VK3變體的F(ab)2片段溫育了 48小時的人PBMC的IL-10分泌。將未處理的細胞作為對照。收集上清液并用IL-10ELISA檢測試劑盒(R&D systems)進行測定。縮寫U. T.(未處理的)。圖18 :人源化抗肽-6抗體抑制已建立的AA的嚴重程度該圖示出了用小鼠-人嵌合IgGl抗肽-6抗體、人源化抗肽-6變體VH2/VK3或作為對照的PBS處理過的動物的關節炎評分。關節炎評分是6 7只動物的平均值。*在第20和第22天將人源化抗肽-6抗體與PBS比較，p〈0. 02 ;在第24天比較，p〈0. 05。*在第20和第22天將嵌合抗肽-6抗體與PBS比較，p〈0. 01 ;在第24天比較，p〈0. 02 ;在第18天比較，p〈0. 05。縮寫D. A. Ind. AA.(誘導關節炎后的天數)；Chim. M_H a pept. 6 (嵌合小鼠抗人肽-6) ；Hum.(人源化)；AA Sc.(關節炎評分)。圖19 :人源化抗肽-6抗體對AA中各種細胞因子的影響該柱式圖示出了以下細胞因子在已建立了 AA的大鼠的血清中的水平IL_6、IFN- y、IL-4、IL-10、IL-17、IL-I 和 TNF- a。用人源化抗肽-6VH2/VK3 變體或用 PBS 處理動物。將健康的、非關節炎的動物的血清用作對照。除11-17、11-1和1即-[1的結果表示每組I只大鼠以外，所有細胞因子的結果為每組2只大鼠的平均值土SE。縮寫Health.(健康的)；Hum.(人源化)；IFN-Y ( y干擾素)，VH (重鏈可變區)，VK (輕鏈可變區)。
圖20 :人源化抗肽-6抗體抑制已建立的膠原誘導型關節炎(CIA)的嚴重程度該圖示出用人源化VH2/VK3抗肽_6抗體處理過的動物相對于用TBS處理過的動物的關節炎評分。通過測量爪直徑來評估關節炎，其是每組8只小鼠的平均值。*與用TBS處理過的小鼠相比，P〈0. 05。縮寫Hum.(人源化)；D.A. Diseas. Ons.(疾病發作后天數)；Aver. Fee. Diam.(平均爪直徑)，VH (重鏈可變區)，VK (輕鏈可變區)。圖21 :人源化抗肽-6抗體誘導類風濕性關節炎患者的PBMC分泌IL-10收集自兩位RA患者的PBMC在與VH2/VK3抗肽-6人源化抗體一起溫育或未與該抗體一起溫育48小時后的培養物上清液中的IL-10水平。縮寫U. T.(未處理的)；Pat.(患者),hum. a -pep-6 (VH2/VK3抗肽_6人源化抗體)。圖22 :人源化抗肽-6抗體改善TNBS結腸炎，一種炎性腸病(IBD)模型該柱式圖示出并比較了在使用經人源化VH2/VK3抗體變體處理過的動物和對照動物(每組10只動物)的TBNS結腸炎模型中測得的體重(克)。*與對照小鼠相比，p〈0. 05。縮寫Bod.Weigh. Gr.(體重(克));Weigh. Los (體重損失)；Sens.(在敏化時)；Dis. Ind.(在疾病誘導時)；Sacrif. D. 3 (在處死時(第3天))；Hum.(人源化)；Cont.(對照)，VH (重鏈可變區)，VK (輕鏈可變區)。圖23A 23C :人源化抗肽_6抗體改善TNBS結腸炎，一種IBD模型圖23A顯示的柱式圖指示并比較了用人源化VH2/VK3抗體變體處理過的TBNS結腸炎動物和對照(每組10只動物)的顯微鏡疾病評分。圖23B 23C顯示了取自經處理的動物(C)和對照動物⑶的組織切片(放大率X 100)。*與對照小鼠相比，p〈0. 05。縮寫Micro. Dis. Sc.(顯微鏡疾病評分)；Hum.(人源化)；Cont.(對照)，VH(重鏈可變區)，VK (輕鏈可變區)。圖24 :人源化抗肽-6抗體抑制TNBS結腸炎IBD模型中的體重損失在第-7天(敏化)、第0天(疾病誘導)和第3天(處死)，對經直腸內施用TNBS進行激發用人源化抗肽-6抗體(VH2/VK3)、利妥昔單抗或PBS處理過的小鼠的體重進行的比較，每組使用了 10只小鼠。*與對照小鼠相比，p〈0.05。縮寫Bod.Wei.(體重)；Sens.(敏化)；Dis. Ind. D.3(疾病誘導(第 3 天))；Sacrif.(處死),Hum. a -pep. 6.(人源化抗肽 _6 抗體，VH2/VK3 變體)。圖25 :人源化抗肽-6抗體的藥代動力學特征在腹膜內或皮下施用20mg/kg的小鼠血清人源化抗肽-6抗體(人源化抗肽-6抗體，VH2/VK3變體)后11天期間的所述人源化抗肽-6抗體的水平的圖示。縮寫S.C.(皮下)；I.P.(腹膜內)；D. Ant. Adm.(施用抗體后天數)。圖26 pPR014雙順反子表達載體的圖譜顯示了(未按比例)對表達人IgG和在真核細胞中進行選擇而言需要的元件。VH區是PR001重鏈變體2，VK區是PR001輕鏈變體3。未示出用于原核細胞增殖和選擇的元件細節。縮寫Hin.(鉸鏈)。圖27A 27B :細胞系 PR001-SF-14-524-AJ 的生產力(productivity)和生長在十代的時間內對細胞系PR001-SF-14-524-AJ的生產力和生長特性進行的分析。間隔十代建立SPR(比生產率)培養物，即在250ml搖瓶中的70ml培養物，每天取樣以獲得細胞計數、細胞活力和Ig滴度。(圖27A)SPR#1，(圖27B)SPR#2。虛線表示用于計算峰值SPR的時間窗。縮寫Cel.DenS.(細胞密度)；CeI. Cou.(細胞計數)；Tit.(滴度)；T.D.PI (接種后時間(天))。圖28A 28B :細胞系PR001-SF-14-524-A0的生產力和生長在十代的時間內對細胞系PR001-SF-14-524-A0的生產力和生長特性進行的分析。間隔十代建立SPR培養物，即在250ml搖瓶中的70ml培養物，每天取樣以獲得細胞計數、細胞活力和Ig滴度。(圖28A)SPR#1，(圖28B)SPR#2。虛線表示用于計算峰值SPR的時間窗。縮寫Cel.DenS.(細胞密度)；CeI. Cou.(細胞計數)；Tit.(滴度)；T.D.PI (接種后時間(天))。圖29A 29B :細胞系PR001-SF-14-524-AZ的生產力和生長在十代的時間內對細胞系PR001-SF-14-524-AZ的生產力和生長特性進行的分析。間隔十代建立SPR培養物，即在250ml搖瓶中的70ml培養物，每天取樣以獲得細胞計數、細胞活力和Ig滴度。(圖29A)SPR#1，(圖29B)SPR#2。虛線表示用于計算峰值SPR的時間窗。縮寫Cel.DenS.(細胞密度)；CeI. Cou.(細胞計數)；Tit.(滴度)；T.D.PI (接種后時間(天))。圖30A 30B :細胞系PR001-SF-14-524-BE的生產力和生長在十代的時間內對細胞系PR001-SF-14-524-BE的生產力和生長特性進行的分析。間隔十代建立SPR培養物，即在250ml搖瓶中的70ml培養物，每天取樣以獲得細胞計數、細胞活力和Ig滴度。(圖30A)SPR#1，(圖30B)SPR#2。虛線表示用于計算峰值SPR的時間窗。縮寫Cel.Dens.(細胞密度);CeI. Cou.(細胞計數)；Tit.(滴度);T.D.PI (接種、后時間(天))。圖31 :來自不同細胞系的抗體的結合從細胞系PR001-SF-14-524-AJ、PR001-SF-14-524-A0、PR001-SF-14-524-AZ 和PR001-SF-14-524-BE的上清液中純化出的抗體的結合。在被10 u g/ml肽-6預包被的微量滴定板中溫育每種抗體的梯度稀釋液。用經HRP標記的小鼠抗人K輕鏈和TMB檢測結合。
縮寫Chim.(嵌合)；Ab. Cone.(抗體濃度)，Abs (吸光度)。
具體實施例方式縮寫BSA-牛血清白蛋白⑶R-抗體可變區的互補決定區(根據Kabat定義,對于每條重鏈和輕鏈編號為CDRl 3)。Ec (0. l%)-lmg/ml的蛋白溶液的吸光度。ED50-產生最大可觀測效果的50%的測試物質的濃度。ELISA-酶聯免疫吸附測定FR-框架區-支持⑶R的可變結構域的支架(scaffold)區域IgG-免疫球蛋白GmAb-單克隆抗體MHC-主要組織相容性復合物0D280nm-280nm處測得的光密度PBS-磷酸鹽緩沖鹽水TMB 3，3’，5，5’ -四甲基聯苯胺PCR-聚合酶鏈式反應V區-抗體鏈的可變區本發明提供特異性地識別并結合包含氨基酸序列SEQ ID NO: 15的多肽的人源化抗體。應注意的是，多肽SEQ ID勵:15，即肽-6，源自肥 65。如下文所示，示例性的本發明的人源化抗體是通過將來自多種其他人抗體可變區的氨基酸序列的區段合并起來產生的。第一步，產生了不同可變區基因的文庫，并將其克隆至表達載體中，隨后進行篩選以回收具有所需特性(例如，與肽-6 (SEQ ID NO: 15)的結合)的文庫成員。將這些區段選擇為包含參與表位識別的“約束性”氨基酸殘基，這些殘基也存在于本發明所用的參照小鼠抗體中。更具體而言,通過從已知的人V區序列(例如在Kabat抗體數據庫(www. bioinf.org. uk/abs/simkab. html)、NCBI 數據庫(www. ncbi. nlm. nih. gov)中可獲得的那些序列)和從蛋白數據庫(例如 UniProt (www. ebi. uniprot. org)和 PRF/SBQDB (www. prf. or. ip))選擇VH和VL序列的區段來設計VH和VL序列的文庫。此外，通過從一個或多個單獨區段擴增人源VH和VLmRNA而進行直接測序，而收集人VH和VL序列，來作為上述序列的補充。對于設計VH和VL基因，考慮了序列區段的各種組合。本領域技術人員將理解，除了上述方法以外，還存在其他的用于創造和測試本發明的人源化抗體的方法和用于優化此類抗體的性質的方法。本發明的抗體是新穎的，并且由于V區是全人源的，本發明的抗體在人體中的免疫原性應當比包含非人序列的其他抗體的更小。本發明的人源化抗體的其他可選特征，即避免T細胞表位，也可以有助于低免疫原性。應理解的是，產生組合人抗體的抗體區段及其組合可以經選擇而符合多種標準，包括可選地避免T細胞表位。例如，人蛋白序列的區段及其組合能夠經選擇而用于避免B細胞表位和其他表位(例如I類MHC限制型表位)、用于避免可能對人源化抗體的表達有害的氨基酸序列、用于避免可能對人源化抗體帶來不適當修飾(例如N-糖基化)的序列、用于包含某些功能(例如輔助T細胞表位和/或B細胞表位)(例如，在疫苗應用中)、用于與其他部分的后續偶聯和用于達到多種其他標準。應注意的是，本文所用的“T細胞表位”是由T細胞受體識別并結合的抗原決定簇。由T細胞受體識別的表位經常位于抗原的內部未暴露偵牝并且在對該抗原進行蛋白水解加工后對T細胞受體變得可及。MHC限制型抗原識別，或MHC限制性，是指下述事實指定的T細胞將僅在肽抗原與特定MHC分子結合時才識別肽抗原。通常，由于僅在自身MHC分子存在時才會刺激T細胞，抗原僅作為與自身MHC分子結合的肽被識別。在一個實施方式中，抗肽-6人源化抗體或其抗原結合片段的重鏈和輕鏈可變區 完全源自一種或多種人抗體,如W02006/08246中所描述的。在另一個實施方式中，可變區由來自一種或多種人抗體的氨基酸序列區段組成。在又一個實施方式中，人區段的長度為兩個氨基酸以上。在一個實施方式中，人區段的長度為100個氨基酸以下。在其他實施方式中，人區段的長度為50個以下、40個以下、30個以下、20個以下、15個以下、10個以下、9個以下、8個以下、7個以下、6個以下、5個以下、4個以下或3個以下氨基酸。此類區段的實例由圖4展示。因此，根據第一方面，本發明涉及特異性地結合包含SEQ ID N0:15的多肽的分離且純化的人源化抗體或其任何抗原結合片段。根據一個實施方式，本發明的人源化抗體包含(a)重鏈可變區，所述重鏈可變區包含位于H22位的Cys、位于H23位的Ser、位于H26位的Gly、位于H27位的Phe、位于H28位的Ser、位于H29位的Leu、位于H30位的Ser、位于H31位的Thr、位于H32位的Ser、位于H33位的Asn、位于H34位的Met、位于H35位的Gly、位于H35A位的Val、位于H35B位的Gly、位于H48位的Leu、位于H50位的His、位于H51位的He、位于H52位的Leu、位于H53位的Trp、位于H54位的Asn、位于H55位的Asp、位于H56位的Ser、位于H57位的Lys、位于H58位的Tyr、位于H59位的Tyr、位于H60位的Asn、位于H61位的Pro、位于H62位的Ala、位于H63位的Leu、位于H64位的Lys、位于H65位的Ser、位于H92位的Cys、位于H95位的Met、位于H96位的Gly、位于H97位的Gly、位于H98位的Tyr、位于H99位的Tyr、位于HlOO位的Gly、位于H100A位的Asn、位于H100B位的Tyr、位于H100C位的Gly、位于H100D位的Tyr、位于H100E位的Tyr、位于H100F位的Ala、位于H100G位的Met、位于HlOl位的Asp和位于H102位的Tyr，且可選地包含位于H49位的Leu、位于H74位的Tyr、位于Hll位的lie、位于H41位的Ser和位于H108位的Ser中的至少一個；和(b)輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含位于LI位的Gin、位于L23位的Cys、位于L24位的Thr、位于L25位的Ala、位于L26位的Ser、位于L27位的Ser、位于L27A位的Ser、位于L28位的Val、位于L29位的Ser、位于L30位的Ser、位于L31位的Ser、位于L32位的Tyr、位于L33位的Leu、位于L34位的His、位于L47位的Trp、位于L50位的Ser、位于L51位的Thr、位于L52位的Ser、位于L53位的Asn、位于L54位的Leu、位于L55位的Ala、位于L56位的Ser、位于L71位的Tyr、位于L88位的Cys、位于L89位的His、位于L90位的Gin、位于L91位的Tyr、位于L92位的His、位于L93位的Arg、位于L94位的Ser、位于L95位的Pro、位于L96位的Pro和位于L97位的Thr，且可選地包含位于L21位的Met、位于LlO位的Ile和位于L80位的Ala中的至少一個。應認識到的是，所有指出的位置都是根據Kabat編號系統來確定的。應注意的是，根據某些實施方式，約束性氨基酸殘基(具體為輕鏈可變區的位于L27位的殘基Ser、位于L27A位的殘基Ser、位于L28位的殘基Val、位于L29位的殘基Ser、位于L30位的殘基Ser、位于L31位的殘基Ser)，可以根據圖IB所示的編號方式來對其進行如下編號位于L27位的Ser、位于L28位的Ser、位于L29位的Val、位于L30位的Ser、位于L30A位的Ser。
還應當注意的是，上面指出的氨基酸殘基被本發明鑒定為參與識別表位(即，肽-6(SEQ ID NO: 15))的“約束性”氨基酸。這些殘基也存在于對應的參照小鼠抗體中，所述參照小鼠抗體具有SEQ ID NO: I所表示的重鏈可變區和SEQ ID NO: 2所表示的輕鏈可變區。因此，根據一個實施方式，本發明的人源化抗體的重鏈可變區與小鼠參照可變區的SEQID NO: I具有至少30%的同一性，輕鏈可變區與小鼠參照可變區的SEQ ID N0:2具有至少25%的同一性。技術人員將認識到，重鏈和輕鏈的位置號是根據同樣的編號方案(例如Kabat和Chothia編號方案)來指定的。Chothia編號方案與Kabat方案相同，但其在⑶R-Ll和CDR-Hl中在具有結構差異的位置放置插入。除非另有說明，本文中述及序列位置時使用Kabat編號方案。特定Vh或\序列中的氨基酸殘基位置并不是指特定序列中的氨基酸號，而是指參照編號方案指定的位置。使用本領域中的標準定義來確定人重鏈和輕鏈的⑶R位置并由此確定其框架區位置。例如，通常使用以下四種定義。Kabat定義基于序列變異性，并且是最常用的。Chothia定義基于結構環區域的位置。AbM定義是兩者的折中，由Oxford Molecular的AbM抗體建模軟件使用。最近，引入了接觸定義，其基于對可獲得的復雜晶體結構的分析。例如，使用Kabat編號方法，本發明的輕鏈的框架通常包含殘基I 23、殘基35 49、殘基57 88和殘基98 109 (或殘基98至C端殘基，例如殘基98 108)。本領域技術人員將認識到，這些編號可以不指Vh或\序列中的氨基酸號，而是指使用Kabat編號系統(或其他編號系統)的殘基位置。術語“抗體”是指由免疫球蛋白基因編碼的多肽或特異性地結合并識別抗原的其功能性片段(即，下文所定義的抗原結合片段)。已證實的免疫球蛋白基因包括K、入、a、Y、S、e和ii恒定區基因以及無數的免疫球蛋白可變區基因。將輕鏈分類為K或入。將重鏈分類為Y、U、a、S或e，這些類別又分別定義了免疫球蛋白的類別，即IgG、IgM、IgA, IgD 和 IgE0示例性的免疫球蛋白(抗體)結構單位由四聚體構成。每個四聚體由兩個相同的多肽鏈對組成，每對具有一條“輕”(約25kDa)鏈和一條“重”(約50kDa 70kDa)鏈。每條鏈的N端界定了具有約100 110個或更多個氨基酸的可變區，主要負責抗原識別。術語輕鏈可變區(VJ和重鏈可變區(Vh)分別描述上述輕鏈和重鏈。更具體而言，將可變區再劃分為超變區和(FR)框架區。對于指定的位置，相對于該位置最常見的氨基酸，超變區在該位置具有高比率的不同的氨基酸。在輕鏈和重鏈中，存在三個超變區。具有更穩定的氨基酸序列的四個FR區將超變區分隔開。超變區直接接觸抗原表面的部分。因此，本文中的超變區稱為“互補決定區”或“CDR”。FR區形成P疊片結構，該結構充當支架以將超變區保持在接觸抗原的位置。從N端到C端，輕鏈和重鏈均包含以下區域FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。⑶R主要負責結合抗原的表位。每條鏈的⑶R通常被稱作⑶R1XDR2和⑶R3，是從N端開始依次編號，并且還通常憑借特定⑶R所在的鏈來識別⑶R。因此，Vh⑶R3位于發現其的抗體的重鏈可變結構域，而' CDRl是來自發現其的抗體的輕鏈可變結構域的CDR1。除非另有說明，本文所述的對輕鏈和重鏈可變區的編號遵循Kabat[參見例如Johnson等，(2001)“Kabat Database and its applications:future directions, NucIeicAcids Research, 29:205-206 ;以及 the Kabat Database of Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 2002 年 2 月 22 日數據集]。
Vh或\鏈的“框架”是指該鏈的框架區。該術語在應用到每條鏈時涵蓋所有的框架區。本文所用的“人源化抗體”是指具有參照抗體的結合特異性(即，與參照抗體的CDR區基本相同的CDR區，所述參照抗體通常為小鼠單克隆抗體)的抗體。更具體而言，根據本發明，參照抗體可以是重鏈可變區和輕鏈可變區分別為SEQ ID NO: I和SEQ ID NO: 2的單克隆小鼠抗肽-6抗體。本文所用的“人源化抗體”結合與參照抗體的表位相同的表位，并且通常具有至少25%的結合親和力。實施例2描述了示例性的結合親和力測定(圖7)。確定抗體是否結合相同表位的方法在本領域中是公知的,參見例如Harlow&Lane, UsingAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999,其公開了表位定位技術或替代性的競爭實驗技術，用來確定抗體是否結合與參照抗體的表位相同的表位。如上文指出的，根據某些實施方式，本發明提供人源化抗肽-6抗體及其任何抗原結合片段。術語“抗原結合片段”是指保留了與抗原的結合的任何抗體部分。抗體的功能性片段的實例包括但不限于完整抗體分子，諸如Fv、單鏈Fv(SCFv)、互補決定區(⑶R)、Vl(輕鏈可變區)、VH(重鏈可變區)、Fab、F(ab)2’及其任意組合等抗體片段，或免疫球蛋白肽的能夠結合靶抗原的任何其他功能部分。本領域技術人員會認識到，各種抗體片段可以通過多種方法來獲得，例如，用諸如胃蛋白酶等酶來消化完整抗體，或從新合成。經常使用化學手段或使用重組DNA方法來從新合成抗體片段。因此，本文所用的術語“抗體”包括通過修飾整個抗體而產生的抗體片段或使用重組DNA方法從新合成的那些片段(例如，單鏈Fv)或使用噬菌體展示文庫而鑒定出的那些片段。術語“抗體”還包括二價分子、微型雙功能抗體(diabody)、微型三功能抗體(triabody)和微型四功能抗體(tetrabody)。述及“VH ”或“VH”時指的是免疫球蛋白的重鏈可變區，包括Fv、scFV、二硫鍵穩定化的Fv (dsFv)或Fab。述及“\”或“ VL”時指的是免疫球蛋白的輕鏈可變區，包括Fv、scFV、dsFv 或 Fab0更具體而言，術語“單鏈Fv”或“scFv”是指其中傳統雙鏈抗體的重鏈和輕鏈的可變區域已結合起來形成了一條鏈的抗體。通常，將連接肽插到兩條鏈之間以使可變結構域穩定，而不干擾活性結合部位的正確折疊和形成。本發明的單鏈人源化抗體，例如人源化抗肽-6抗體，可以作為單體來進行結合。其他示例性單鏈抗體可以形成微型雙功能抗體、微型三功能抗體和微型四功能抗體。另外，本發明的人源化抗體，例如人源化肽-6抗體，還可以形成“重構”抗體或抗體片段(例如，Fab、Fab’單體、F(ab)2 二聚體或整個免疫球蛋白分子)的一種成分。應注意本發明的人源化抗體還可以包含人Fe區。根據某些實施方式，本發明提供特異性地識別多肽SEQ ID N0:15(肽-6)或包含所述肽-6的任何序列(例如序列SEQ ID NO:98)的人源化抗體。在某些實施方式中，本發明的人源化抗體還可以識別含有SEQ IDN0:15的片段的序列。此類片段的非限制性實例由SEQ ID NO: 101 (命名為肽-7)表示。因此應注意的是，當述及表位時，術語“結合特異性”、“特異性地與抗原結合”、、“對……具有特異免疫反應性”、“特異性地針對”或“特異性地識別”是描述結合反應，該結合反應可用來確定在異源蛋白群體或其他生物分子中存在該表位。因此，在指定的免疫測定條件下，特異性的抗體與特定表位的結合至少為背景的兩倍，且更常見為背景的10倍 100倍。可以使用多種免疫測定規程來選擇對特定蛋白或碳水化合物有特異免疫反應性的抗體。例如，常規地使用固相ELISA免疫測定來選擇對蛋白或碳水化合物有特異免疫反應性的抗體。術語“表位”意思是指任何分子的能夠被抗體結合且還能夠被該抗體識別的部分。表位或“抗原決定簇”通常由諸如氨基酸或糖側鏈等具有化學活性的表面分子基團構成，并且具有特定的三維結構特性和特定的電荷特性。如上文指出的，在某些實施方式中，本發明提供分離且純化的人源化抗體。在述及抗體或編碼抗體的核酸分子時，本文中所用的“分離的”或“基本純化的”意為已將所述抗體或核酸從其天然環境中移出或已改變了其天然狀態。因此“分離的”不必反映該抗體或核酸分子的純化程度。然而應理解的是，已純化至某種程度的抗體或核酸分子是“分離的”。如果該抗體或核酸分子在天然環境中并不存在，即它并不存在于自然界中，則不論該分子出現在何處它都是“分離的”。舉例而言，并不天然存在于人體中的人源化抗體即使在其出現在人體中時也是“分離的”。此外，術語“分離的”或“基本純化的”在應用于核酸或蛋白時是表示該核酸或蛋白基本不含其在自然狀態下所聯結的其他細胞組分。其優選為同質態，但也可以在速干劑(dry solution)或水溶液中。通常使用諸如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜等分析化學技術來確定純度和同質性。作為存在于制備物中的最占優勢物種(species)的蛋白是基本純化的。如圖4和表3所示，本發明的人源化抗體的可變區是由源自不同的人抗體的不同區段構成的，這些區段經組合而產生了本發明的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區。因此，在某些實施方式中，所述人源化抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區是由至少兩個或更多個人抗體的至少兩個或更多個區段構成的，這些區段產生了完全由人源的區段組成的人源化抗體。應注意的是，這些區段既不是完整的CDR也不是框架區。在本發明的背景下，術語“區段”是指見于抗體分子內的鄰近氨基酸序列，此類區段的尺寸為2 125個氨基酸長、優選為2 31個氨基酸長，但此類區段既不是完整的⑶R也不是完整的框架區。如圖4所示，本發明的人源化抗體將通常在該人源化抗體的可變區內組合兩個以上的來自不同的人抗體的氨基酸序列區段。特別而言，本發明涉及人源化抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區(分別為VH和VL)，其中每個VH和VL都完全是由來自兩個以上人抗體可變區的序列的區段組成，且其中每個組合得到的VH和VL通常都包含人可變區序列位置的區段，所述位置對應于這些區段在作為來源的人抗體的VH和VL中的位置，例如，組合得到的VH序列中的氨基酸I 10將會來自人抗體中的氨基酸I 10。作為另一選擇，本發明的人源化抗體中的人VH或VL序列的區段可以位于任何序列位置，而不考慮在作為來源的人抗體的VH或VL中的序列位置。作為來源的人抗體的VH或VL將是任何已有的人抗體可變(V)區氨基酸序列，例如在人單克隆抗體V區序列數據庫中提供的那些序列，并且可以包括來自非種系的帶有V區體細胞突變和其他變異的親和力成熟的抗體的序列、來自種系V區的序列、來自從該物種的抗體(例如具有一組固定的V區框架但具有可變的CDR的抗體)的序列區段產生的人工構建的抗體V區的序列、從人抗體文庫(例如噬菌體展示文庫)中選出的序列和來自源于表達編碼人抗體或抗體片段的基因的轉基因動物的人抗體的序列。更具體地，如圖4和表3所示，根據一個實施方式，本發明的人源化抗體的重鏈可 變區可以包含a)框架區I (FRl)，所述框架區I包含區段SEQ ID NO: 12和區段SEQ ID NO: 13或其任意部分的氨基酸序列，或區段SEQ ID N0:40和區段SEQ ID NO: 13或其任意部分的
氨基酸序列；b)互補決定區I (⑶Rl)，所述互補決定區I包含區段SEQ ID NO: 13或其任意部分和區段SEQ ID NO: 14或其任意部分的氨基酸序列；c)FR2，所述FR2包含區段SEQ ID N0:16、區段SEQ ID N0:14和區段SEQ IDNO: 17或其任意部分的氨基酸序列，或區段SEQ ID N0:41、區段SEQ ID NO: 14和區段SEQ IDNO: 17的氨基酸序列，或區段SEQ ID N0:41、區段SEQ ID NO: 14和區段SEQ ID N0:44的氨
基酸序列；d)CDR2，所述CDR2包含區段SEQ ID NO: 18和區段SEQ ID NO: 19或其任意部分
的氨基酸序列；c)FR3，所述 FR3 包含區段 SEQ ID N0:34、區段 SEQ ID N0:19、區段 SEQ IDNO:35和區段SEQ ID N0:36或其任意部分的氨基酸序列，或區段SEQ ID N0:43、區段SEQ IDNO: 19和區段SEQ ID NO:36或其任意部分的氨基酸序列；f)CDR3，所述CDR3包含區段SEQ ID NO:36或其任意部分、區段SEQ ID N0:37和區段SEQ ID NO: 38或其任意部分的氨基酸序列，或區段SEQ ID NO: 36或其任意部分、區段SEQ ID N0:37和區段SEQ ID N0:42或其任意部分的氨基酸序列，或區段SEQ ID N0:36或其任意部分、區段SEQ ID N0:96和區段SEQ ID NO:42或其任意部分的氨基酸序列；和g)包含區段SEQ ID NO:38或其任意部分和區段SEQ ID NO:39的氨基酸序列，或區段SEQ ID NO:42或其任意部分的氨基酸序列；應注意的是，所述重鏈可變區在選自由H10、H11、H12、H13、H15、H19、H41、H49、H74、H75、H79、H81、H82、H82A、H82C、H84、H85和H108組成的組的至少一個位置上包含置換，其中，這些位置是根據Kabat編號系統確定的。
根據另一個實施方式，圖4和表3所示的所述復合抗體的輕鏈可變區包含a)FRl，所述FRl包含區段SEQ ID NO:45、區段SEQ ID NO:46和區段SEQ IDNO:47或其任意部分的氨基酸序列，或區段SEQ ID N0:45、區段SEQ ID N0:57和區段SEQ IDN0:47或其任意部分的氨基酸序列，或區段SEQ ID N0:45和區段SEQ IDN0:97或其任意部分的氨基酸序列；b) CDRl，所述CDRl包含區段SEQ ID NO:47或其任意部分、區段SEQ IDNO:48和區段SEQ ID NO: 49或其任意部分的氨基酸序列，或區段SEQ ID NO: 97或其任意部分、區段SEQ ID N0:48和區段SEQ ID NO:49或其任意部分的氨基酸序列；c)FR2，所述FR2包含區段SEQ ID NO:49或其任意部分、SEQ ID N0:50或其任意部分和區段SEQ ID N0:51或其任意部分的氨基酸序列；d)CDR2，所述CDR2包含區段SEQ ID NO:50或其任意部分、SEQ ID N0:51或其任意部分和區段SEQ ID NO:52或其任意部分的氨基酸序列； e)FR3，所述FR3包含區段SEQ ID NO:52或其任意部分、區段SEQ ID N0:53或其任意部分、區段SEQ ID NO:54或其任意部分和區段SEQ ID NO:55或其任意部分的氨基酸序列，或區段SEQ ID NO: 52或其任意部分、區段SEQ ID NO: 58或其任意部分和區段SEQ IDNO:59或其任意部分的氨基酸序列；f)CDR3，所述CDR3包含區段SEQ ID NO:54或其任意部分、區段SEQ ID N0:55或其任意部分和區段SEQ ID NO: 56或其任意部分的氨基酸序列，或區段SEQ IDNO: 58或其任意部分、區段SEQ ID NO:59或其任意部分和區段SEQ ID NO:56或其任意部分的氨基酸序列；和g)FR4，所述FR4包含區段SEQ ID NO: 56或其任意部分的氨基酸序列。根據另一個實施方式，所述輕鏈可變區在選自由Lio、L11、L13、L15、L19、L21、L22、L42、L43、L60、L70、L72、L78、L79、L80、L83和LlOO組成的組的至少一個位置上可以包含置換，其中，這些位置是根據Kabat編號系統確定的。應認識到的是，根據某些實施方式，本發明的人源化抗體是通過將表3所公開的多個人VH和VL序列區段以在最終的人源化抗體V區中限制或避免了人T細胞表位的組合方式組合而構建成的。T細胞表位的消除降低了組合人源化抗體的免疫原性。此處所述的人T細胞表位是指能夠結合人MHC II類分子并通過呈遞至⑶4T細胞來誘導輔助T細胞應答的氨基酸序列。能夠選擇在最終的人源化抗體中限制或避免T細胞表位的人VH和VL序列區段及區段組合。這能夠通過以下方式來實現使用不含T細胞表位的區段，例如來自人種系序列的區段，并且例如通過在兩個區段的接合處產生非MHC結合序列、通過產生另一人種系序列或通過產生雖然是非種系序列但不誘導輔助T細胞應答的序列，來將相鄰的區段接合起來以產生不含T細胞表位的新序列。因此，根據一個實施方式，本發明的人源化抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區都不具有人T細胞表位。更具體而言，當將所有人區段組合起來以產生最終的本發明的人源化抗體時，除去了全部可能的T細胞表位中的約70% 99%、75% 99%、80% 99%、85% 99%、具體為 90% 99%、更具體為 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%。術語“免疫原性”是指抗體或抗原結合片段在施用到接收者時引發免疫應答(體液應答或細胞應答)的能力，包括例如HAMA (人抗小鼠抗體)應答。HAMA應答是在受試對象的T細胞對所施用的抗體產生免疫應答時啟動的。該T細胞隨后募集B細胞來產生特異性的“抗抗體”抗體。如上文指出的，本發明的人源化抗體包含人源化重鏈和人源化輕鏈。重鏈可變區和輕鏈可變區都是由人源的組合區段構成的。根據一個具體實施方式
，人源化輕鏈包含三個互補決定區(⑶R1XDR2和⑶R3)，這三個互補決定區具有的氨基酸序列基本上與參照小鼠抗肽-6抗體的對應互補決定區具有至少約60% 95%的同一性。根據一個具體實施方式
，參照小鼠抗肽-6抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含氨基酸序列SEQ ID N0:1和SEQ ID NO:2。 在另一個具體實施方式
中，本發明的人源化抗體的重鏈可變區包含參照小鼠可變區的SEQ ID N0:1中示出的⑶R1XDR2和⑶R3，輕鏈可變區包含參照小鼠可變區的SEQ IDNO: 2 中示出的 CDRl、CDR2 和 CDR3。因此，在具體實施方式
中，本發明的人源化抗體可以包含(a)與參照小鼠抗體的SEQ ID NO: I具有至少約70%同一性的重鏈可變區；和(b)與參照小鼠抗體的SEQ ID N0:2具有至少約70%同一性的輕鏈可變區。更具體而言，本發明的人源化抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區分別與參照小鼠的重鏈可變區和輕鏈可變區SEQID NO: I和SEQ ID NO: 2具有約70% 85%同一性。更特別的是，該氨基酸序列同一性可以是至少 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84% 或 85%。就兩條或更多條核酸序列或多肽序列而言，術語“同一”、“基本同一性”、“基本同源性”或“百分比同一性”是指兩條或更多條序列或子序列，在按下述缺省參數使用BLAST或BLAST 2. 0序列比較算法后或者在通過手動比對和目視檢查進行測量后，這些序列或子序列相同或具有規定百分比的相同氨基酸殘基或相同核苷酸(即，當為獲得最大對應而在比較窗口或指定區域上進行比較或比對時，在特定區域(例如，氨基酸序列SEQ ID N0:1或SEQ ID NO:2)上的同一性約為 60%，優選為 65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)。隨后稱這些序列為“基本同一”的。此定義還指或可以適用于測試序列的互補序列。該定義還包括具有缺失和/或添加的序列以及具有置換的序列。如下文所述，優選的算法可以考慮空位等。優選的是，同一性存在于長度為至少約25個氨基酸或核苷酸的區域上，或更優選在長度為50 100個氨基酸或核苷酸的區域上。對于序列比較，通常由一條序列充當參照序列，并將測試序列與其比較。當使用序列比較算法時，將測試序列和參照序列輸入計算機，如有必要則指定子序列配位，并指定序列算法程序參數。優選的是，可以使用缺省的程序參數，或者可以指定替代性的參數。隨后，序列比較算法基于程序參數計算出測試序列相對于參照序列的百分比序列同一性。此外，本發明的人源化抗體可以包含的重鏈可變區與參照小鼠重鏈可變區SEQIDNO: I具有至少約30% 70%同一性，更具體而言，與參照小鼠重鏈可變區SEQ IDNO: I具有至少約40%、50%、60%、65%或70%同一性。在一個具體實施方式
中，本發明的人源化抗體可以包含的重鏈可變區與參照小鼠重鏈可變區SEQ ID NO: I具有至少約70%同一性，并且在選自由 H10、Hll、H12、H13、H15、H19、H41、H49、H74、H75、H79、H81、H82、H82A、H82C、H84、H85和H108組成的組的至少一個位置上具有置換。本發明的人源化抗體可以包含的輕鏈可變區與參照小鼠重鏈可變區SEQ ID N0:2具有至少約70%同一性，并且在選自由L10、L11、L13、L15、L19、L21、L22、L42、L43、L60、L70、L72、L78、L79、L80、L83 和 LlOO 組成的組的至少一個位置上具有置換。如上文之前指出的，所有指出的位置都是根據Kabat編號系統來確定的。在一個實施方式中，與結合肽-6 (SEQ ID NO: 15)或包含氨基酸序列SEQ IDNO: 15的任何肽(例如，SEQ ID NO:98的肽)或含有SEQ ID NO: 15的片段的肽(例如，SEQ IDNO: 101所表示的序列)的小鼠參照抗體或親本抗體相比，抗肽-6人源化抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區和輕鏈可變區具有18個以下 氨基酸置換。在另一個實施方式中，與參照小鼠抗肽-6抗體相比，抗肽-6人源化抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區在所指定的位置上具有17個以下、16個以下、15個以下、14個以下、13個以下、12個以下、11個以下、10個以下、9個以下、8個以下或7個以下氨基酸置換。在一個實施方式中，與具有的重鏈可變區和輕鏈可變區分別為SEQ ID NO: I和SEQ ID NO: 2的參照小鼠抗肽_6抗體相比，抗肽_6人源化抗體的重鏈可變區或輕鏈可變區具體在上文指出的位置上具有至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個或至少13個氨基酸置換。對于氨基酸序列而言，技術人員將認識到，對核酸、肽、多肽或蛋白序列進行的單 個的置換、缺失或添加是“保守性修飾的變體”，其會在編碼序列中改變、添加或刪除單個氨基酸或一小部分氨基酸，其中改變的結果是將一個氨基酸用化學上相似的氨基酸進行置換。提供在功能上相似的氨基酸的保守性置換表在本領域中是公知的。此類經保守性修飾的變體是本發明的多態變體、種間同源物和等位基因的補充且并不排除這些多態變體、種間同源物和等位基因。例如，可以進行將脂肪族氨基酸(G、A、I、L或V)置換為該組另一成員的置換，或進行例如用一個極性殘基置換另一個的置換，例如用精氨酸置換賴氨酸、用谷氨酸置換天冬氨酸或用谷氨酰胺置換天冬酰胺。以下8組中的每一組都含有彼此為保守性置換物的其他示例性氨基酸I)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)。根據一個特定實施方式，本發明的人源化抗體包含(a) SEQ ID NO: I所示的重鏈可變區，不同之處在于HlO是Ala，Hll是Ile或Leu，H12 是 Val，H13 是 Lys,H15 是 Thr, H19 是 Thr, H41 是 Ser 或 Ala, H49 是 Leu 或 Ala, H74 是Tyr 或 Ser，H75 是 Lys，H79 是 Val，H81 是 Thr，H82 是 Met，H82A 是 Thr，H82C 是 Met，H84是 Pro, H85 是 Val，且 H108 是 Ser 或 Leu ;和(b)SEQ ID N0:2所示的輕鏈可變區，不同之處在于LlO是Ile或Thr，Lll是Leu，L13 是 Leu, L15 是 Pro, L19 是 Ala, L21 是 Met 或 Leu, L22 是 Ser, L42 是 Lys, L43 是 Ala,L60 是 Ser, L70 是 Asp, L72 是 Thr, L78 是 Leu, L79 是 Gin, L80 是 Ala 或 Pro, L83 是 Phe,且LlOO是Gin。這些位置是根據Kabat編號系統來確定的。更具體而言，本發明提供的人源化抗體包含(a)重鏈可變區，所述重鏈可變區包含SEQ ID N0:21、SEQ ID NO:22,SEQ IDNO:23和SEQ ID NO:20中的任何一個或者它們的任何變體的氨基酸序列。所述變體可以在選自由 H10、Hll、H12、H13、H15、H19、H41、H49、H74、H75、H79、H81、H82、H82A、H82C、H84、H85 和H108組成的組的至少一個位置上包含置換；和(b)輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO:26, SEQ ID N0:24和SEQIDNO:25中的任何一個或者它們的任何變體的氨基酸序列。所述變體可以在選自由L10、Lll、L13、L15、L19、L21、L22、L42、L43、L60、L70、L72、L78、L79、L80、L83 和 LlOO (根據Kabat編號系統)組成的組的至少一個位置上可以包含置換。本發明的人源化抗體的變體與目的蛋白在氨基酸水平上可以具有至少80%，經常為至少85%、90%或至少95%、96%、97%、98%或99%的序列相似性，例如本發明的人源化抗 肽-6抗體的各種變體。如上所述，術語“變體”能夠應用于氨基酸序列和核酸序列。對于特定的核酸序列，優選保守性修飾的變體。這些變體是指編碼相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸序列，或者如果核酸不編碼氨基酸序列，則指基本相同的核酸序列。由于遺傳密碼具有簡并性，大量功能相同的核酸編碼任何給定的多肽。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在由密碼子指定為丙氨酸的所有位置上，可以將該密碼子變更為所描述的任何對應密碼子而不改變所編碼的多肽。此類核酸變異是“沉默變異”，為保守性修飾變異中的一種。本文中編碼多肽的所有核酸序列還描述該核酸的所有可能的沉默變異。技術人員將認識到，可以對核酸中的每個密碼子(除了 AUG，其通常為甲硫氨酸的唯一密碼子)進行修改來產生功能相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的每個沉默變異都隱含在每個所描述的序列中。應意識到的是，基于氨基酸對CDR構象和/或與肽-6抗原的結合的可能影響，來選擇用于進行置換的氨基酸。對這些可能的影響的研究是通過建模來檢查特定位置的氨基酸的特性或對特定氨酸的置換或誘變的影響進行經驗觀察。通常，人源化抗體中的CDR區與小鼠參照抗體中的對應CDR區基本相同，或更通常地，二者相同。雖然不經常需要，但有時可以對CDR殘基進行一個或多個保守性氨基酸置換而不明顯影響所得到的人源化免疫球蛋白的結合親和力。偶爾，CDR區中的置換能夠增強結合親和力。在一個特定實施方式中，本發明涉及具有選自由SEQ ID NO:21, SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23和SEQ ID NO:20組成的組的重鏈可變區的人源化抗體。根據另一個具體實施方式
，所述人源化抗體的輕鏈可變區可以選自由SEQ ID NO:26,SEQ ID N0:24和SEQ IDNO:25組成的組。在各種實施方式中，本文提出的人源化抗肽-6抗體包含的重鏈可變區具有SEQID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23 和 SEQ ID NO:20 的氨基酸序列，或與 SEQIDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23 和 SEQ ID NO:20 具有 60% 以上、70% 以上、80% 以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上序列同一性的氨基酸序列。在所述抗體包含的重鏈可變區具有的氨基酸序列與SEQ ID NO:21,SEQID NO:22,SEQ ID N0:23和SEQID NO:20具有90%以上、95%以上、98%以上或99%以上序列同一性的一些實施方式中，一個、多個或全部氨基酸差異為保守性置換。在一些實施方式中，本文提出的抗肽-6抗體包含的輕鏈可變區具有SEQIDNO:26, SEQ ID NO: 24 和 SEQ ID NO: 25 的氨基酸序列，或與 SEQ ID NO: 26、SEQ IDNO: 24和SEQ ID NO:25具有60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上序列同一性的氨基酸序列。在所述抗體包含的輕鏈可變區具有的氨基酸序列與SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 24 和 SEQ ID NO: 25 具有 90% 以上、95% 以上、98% 以上或 99% 以上序列同一性的一些實施方式中，一個、多個或全部氨基酸差異為保守性置換。當然，本文還涉及這些重鏈和輕鏈氨基酸序列的任何可能的組合。因此，在一個實施方式中，本發明提供一種人源化抗體，所述人源化抗體具有重鏈可變區 SEQ ID NO: 21，可以選自由 SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 24 和 SEQ ID NO: 25 組成的組中的輕鏈可變區。根據一個具體實施方式
，本發明的人源化抗體具有重鏈可變區SEQ ID N0:21和輕、鏈可變區SEQ ID N0:26o將該人源化抗體變體命名為VH2/VK3。在另一個具體實施方式
中，本發明的人源化抗體包含重鏈可變區SEQ ID NO:21和輕鏈可變區SEQ ID N0:25o將該人源化抗體命名為VH2/VK2。在另一個具體實施方式
中，本發明的人源化抗體包含重鏈可變區SEQ ID NO:21和輕鏈可變區SEQ ID N0:24o將該變體命名為VH2/VK1。在又一個實施方式中，本發明提供一種人源化抗體，所述人源化抗體具有重鏈可變區 SEQ ID NO: 22 和可以選自由 SEQ ID NO: 24,SEQ ID NO: 25 和 SEQ ID NO: 26 組成的組中的輕鏈可變區。根據一個具體實施方式
，本發明的人源化抗體可以包含重鏈可變區SEQ IDNO:22和輕鏈可變區可以是SEQ ID N0:25。將該人源化抗體變體命名為VH3/VK2。本發明的其他實施方式提供以下人源化抗體重鏈可變區為SEQ ID N0:22且輕鏈可變區為SEQ ID N0:24人源化抗體(VH3/VK1)，重鏈可變區為SEQ ID N0:22且輕鏈可變區為SEQ ID N0:26人源化抗體(VH3/VK3)，重鏈可變區為SEQ ID N0:23且輕鏈可變區為SEQ ID勵:24人源化抗體(￥114/￥1(1)，重鏈可變區為3￡0 ID NO: 23且輕鏈可變區為SEQ IDN0:25人源化抗體(VH4/VK2)，重鏈可變區為SEQ ID NO:23且輕鏈可變區為SEQ ID NO:26人源化抗體(VH4/VK3)，重鏈可變區為SEQ ID NO:20且輕鏈可變區為SEQ ID N0:24人源化抗體(VH1/VK1)，重鏈可變區為SEQ ID NO:20且輕鏈可變區為SEQ ID N0:25人源化抗體(VH1/VK2)，和重鏈可變區為SEQ IDNO: 20且輕鏈可變區為SEQ ID NO: 26人源化抗體(VHl/VK3)。如本文之前所公開的，根據具體實施方式
，本發明的人源化抗體在包含下述重鏈可變區和輕鏈可變區時特別適合用于誘導IL-10，所述重鏈可變區是SEQ ID NO: I所示的重鏈可變區，不同之處在于H10是Ala，Hll是Ile或Leu，H12是Val，H13是Lys，H15是Thr, H19 是 Thr，H41 是 Ser 或 Ala，H49 是 Leu 或 Ala，H74 是 Tyr 或 Ser，H75 是 Lys，H79是 Val，H81 是 Thr，H82 是 Met，H82A 是 Thr，H82C 是 Met，H84 是 Pr。，H85 是 Val，且 H108是 Ser 或 Leu，即，由 SEQ ID NO:21, SEQ IDNO:22, SEQ ID N0:23 和 SEQ ID N0:20 分別表示的重鏈變體H2、H3、H4和Hl中的任一個所展示的重鏈可變區；所述輕鏈可變區是SEQ IDNO: 2所示的輕鏈可變區，不同之處在于L10是Ile或Thr，Lll是Leu，L13是Leu，L15是Pro, L19 是 Ala, L21 是 Met 或 Leu, L22 是 Ser, L42 是 Lys, L43 是 Ala, L60 是 Ser, L70 是Asp, L72 是 Thr, L78 是 Leu，L79 是 Gin, L80 是 Ala 或 Pro, L83 是 Phe，且 LlOO 是 Gln,即，由SEQ ID NO:26,SEQ ID N0:25和SEQ ID NO:24分別表示的輕鏈變體K3、K2和Kl中的任一個所展示的輕鏈可變區。應注意的是，這些位置是根據Kabat編號系統來確定的。如以下實施例、特別是比較性的圖7、圖14和圖15所示，上述置換中的每一個都是重要的，并且可以有助于不同變體對肽-6的結合親和力，或可以通過不同變體的誘導IL-10表達的能力反映。更具體而言，如圖7所示，由VH2重鏈構成的變體顯示出最佳的肽-6結合親和力，然而VHl變體顯示出最低的結合親和力。因此，根據某些實施方式，如變體VH2所示，殘基Hll的優選置換物可以是Leu。在另一個實施方式中，如變體VHl所示，殘基H41的優選置換物是Ala，H74的優選置換物可以是Tyr，H108的優選置換物可以是Leu。圖15B示出，變體VH2/VK3展現出最佳親和力，而變體VH3/VK2則顯示出明顯下降的親和力。與在H3中將殘基H74置換為Ser相比，在H2中將殘基H74置換為Tyr看上去很重要。帶有不同輕鏈的 各種組合還可以造成差異化的結合親和力，例如，變體VH2/VK3顯示出比VH2/VK2更佳的結合親和力。兩種變體的輕鏈之間的唯一區別在于在含有VK2的變體中，將L21置換成了Met，而在優選的變體VK3中，將L21置換成了 Leu。VH2/VK1組合顯示出最低的親和力，因此可以表明，輕鏈中的置換的優選組合可以是LI OThr、L21Leu和L80PrO。如圖15所示，不同的變體與肽-6的結合并不與IL-10誘導直接相關。因此，重鏈和輕鏈中的不同置換組合可以反映在變體的誘導IL-10表達的不同能力上。例如，如圖15A和15B所示，VH2/VK3變體顯示出最佳的IL-10誘導。在對不同的重鏈進行比較時，含有VH2的變體優于VH3變體。二者之間的唯一區別在于在VH2變體中位于位置H74上的是Tyr殘基，而在變體VH3中，H74上為Ser。應注意的是，在功能上，帶有不同的VK變體的組合也反映在了 IL-10誘導中。例如，與變體VH2/VK2相比，VH2/VK3變體顯示出明顯更高的對IL-10的誘導。兩種變體之間的唯一區別在于輕鏈有一個殘基不同。在VK3變體中，位置L21上是Leu，而相比之下，在有效性較低的含VK2的變體中，此處為Met。這些結果表明，甚至一個置換都可能具有顯著的功能影響。因此，在某些實施方式中，應注意的是，可以將Hll置換為Ile和Leu中的任何一個，對于結合肽-6而言，優選Leu，對于誘導IL-10表達而言，優選Leu ;可以將H41置換為Ser和Ala中的任何一個，對于結合肽-6而言,優選Ala,對于誘導IL-10表達而言,優選Ala ;可以將H49置換為Leu和Ala中的任何一個，對于結合肽_6而言，優選Leu，對于誘導IL-10表達而言，優選Leu ;可以將H74置換為Tyr和Ser中的任何一個，對于結合肽_6而言，優選Tyr，對于誘導IL-10表達而言，優選Tyr ;可以將H108置換為Leu和Ser中的任何一個，對于結合肽_6而言,優選Leu,對于誘導IL-10表達而言,優選Leu ;可以將LlO置換為Ile和Thr中的任何一個，對于結合肽-6而言，優選Thr，對于誘導IL-10表達而言，優選Thr ;可以將L21置換為Met和Leu中的任何一個，對于結合肽_6而言，優選Leu，對于誘導IL-10表達而言,優選Leu ;可以將L80置換為Pro和Ala中的任何一個,對于結合肽_6而言，優選Pro,對于誘導IL-10表達而言,優選Pro。還考慮上述置換的所有組合，包括含有HllLeu、H41Ala、H49Ala、H74Ser和H108Leu的經置換重鏈，和含有LlOThr、L21Leu和L80Pro的經置換輕鏈；含有HllLeu、H41Ala、H49Ala、H74Ser 和 H108Leu 的經置換重鏈，和含有 LlOThr、L21Met 和 L80Pro 的經置換輕鏈；含有HllLeu、H41Ala、H49Ala、H74Ser和H108Leu的經置換重鏈，和含有LlOIIe、L21Met 和 L80Ala 的經置換輕鏈；含有 HllLeu、H41Ala、H49Leu、H74Tyr 和 H108Leu 的經置換的重鏈，和含有LlOThr、L21Leu和L80Pro的經置換輕鏈；含有HllLeu、H41Ala、H49Leu、H74Tyr和H108Leu的經置換重鏈，和含有LlOThr、L21Met和L80Pro的經置換輕鏈；含有HllLeu、H41Ala、H49Leu、H74Tyr 和 H108Leu 的經置換重鏈，和含有經 LlOIle, L21Met 和L80Ala的置換輕鏈；含有HllIle, H41Ser、H49Leu、H74Tyr和H108Ser的經置換重鏈，和含有 LlOThr、L21Leu 和 L80Pro 的經置換輕鏈；含有 HllIle, H41Ser、H49Leu、H74Tyr 和H108Ser的經置換重鏈，和含有LlOThr、L21Met和L80Pro的經置換輕鏈；含有HllIle,H41Ser、H49Leu、H74Tyr 和 H108Ser 的經置換重鏈，和含有 LlOIle、L21Met 和 L80Ala 的經置換輕鏈；含有HllLeu、H41Ala、H49Leu、H74Ser和H108Leu的經置換重鏈，和含有LlOThr、L21Met 和 L80Pro 的經置換輕鏈；含有 HllLeu、H41Ala、H49Leu、H74Sei^PH108Leu 的經置換重鏈，和含有LlOIle、L21Met和L80Ala的經置換輕鏈；和最優選的，含有HllLeu、H41Ala、H49Leu、H74Ser和H108Leu的經置換重鏈，和含有L10Thr、L21Leu和L80Pro的經置換輕鏈。
不應忽視的是，還考慮其中一些上述置換出現而另一些不出現的部分置換。應意識到的是，本發明的人源化抗體包括具有所有恒定區類型的抗體(包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE)以及任何同型(包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)。該人源化抗體可以包含來自多于一個類別或同型的序列。根據一個具體實施方式
，本發明的抗體屬于IgGl同型。根據某些實施方式，本發明的人源化抗體可以顯示出的針對其各自抗原(肽-6或包含肽-6的任何氨基酸序列，例如SEQ ID NO:98的肽)的特異性結合親和力可以是至少105、106、107、IO8UO9或IOkiM'該人源化抗體的結合親和力的上下限通常在其所源自的參照小鼠抗體的結合親和力的1/3 3倍范圍內、1/5 5倍范圍內或1/10 10倍范圍內。本發明的重鏈區和輕鏈區通常是使用重組DNA技術獲得的。經常用來執行此操作的重組DNA方法對本領域的技術人員而言是公知的。通常，編碼包含在本發明的組合人源化抗體內的不同區段的核酸序列是用PCR產生的，例如，利用重疊延伸。在此技術中，通常通過將所需序列并入寡核苷酸中并用PCR產生包含所需區段序列的一系列產物來將區段序列接合起來。隨后，通常使用額外的PCR反應，可以將這些產物沿正確的方向接合起來，從而產生Vh鏈和'鏈。使用本領域技術人員公知的技術，可以將VL和VH DNA序列直接連接到一起，或通過編碼連接肽的DNA序列連接到一起。這些技術包括PCR和諸如體外連接等技術。可以沿任一方向將\和Vh序列連接起來。技術人員將意識到，利用為可變區提供的序列信息，可以使用本領域技術人員所公知的任意數量的其他方法來獲得編碼這些序列的核酸。因此，通過任何適合的方法制備編碼Fv區的DNA，所述方法包括例如其他擴增技術，例如，連接酶鏈式反應(LCR)，轉錄擴增和自主序列復制，或對合適的序列的克隆和限制性切割。通過與互補序列雜交，或者通過以單鏈為模板用DNA聚合酶進行聚合，可以將該DNA轉變為雙鏈DNA。雖然可以化學合成整個單鏈Fv區，但優選的是合成大量更短的序列(約100 150個堿基)，隨后，通常使用例如重疊延伸PCR來將這些序列拼接起來。
核酸的大小以千堿基(kb)或堿基對(bp)給出。這些是從瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠電泳、從已測序的核酸或從公開的DNA序列得到的估計值。蛋白的大小以千道爾頓(kDa)或氨基酸殘基數給出。蛋白的大小是從凝膠電泳、從已測序的蛋白、從推導出的氨基酸序列或從公開的蛋白序列估計得到的。可以將本發明的抗體的VdP'結構域直接連接起來，或者可以用連接物將它們隔開，以例如分別使輕鏈和重鏈的可變抗體結構域穩定。適合的連接物是本領域技術人員公知的，包括公知的GlyGlyGlyGlySer連接肽或其變體。
為了獲得克隆基因或核酸(例如編碼本發明的人源化抗體(例如人源化抗肽-6抗體)或其Fab片段的那些cDNA)的高水平表達，通常將編碼抗體的核酸亞克隆到含有合適的引導轉錄的啟動子和轉錄/翻譯終止子的表達載體中，如果針對編碼蛋白的核酸，所述表達載體還含有用于啟動翻譯的核糖體結合位點。適合的細菌啟動子在本領域是公知的，并且在例如Sambrook等和Ausubel等中有所描述。用于表達蛋白的細菌表達系統可在例如大腸桿菌、桿菌屬物種和沙門氏菌屬中獲得。此類表達系統的試劑盒可商購獲得。用于哺乳動物細胞、酵母和昆蟲細胞的真核表達系統在本領域是公知的，并且也是可商購獲得的。通常，為了在細胞中高水平地表達蛋白(例如，本發明的VH或VK變體)，在構建要表達的核酸序列時，考慮了針對表達系統的優選密碼子。因此，來自一種有機體(例如人或小鼠)的核酸可以經改造而包含表達系統的優選密碼子。用來指導異源核酸的表達的啟動子視特定的應用而定。可選的是，啟動子的位置與異源轉錄起始位點的距離大約等于其在天然環境中與轉錄起始位點的距離。然而，本領域中已知的是，能夠在不喪失啟動子功能的情況下容忍該距離上一些變化。除了啟動子之外，表達載體通常還含有轉錄單元或表達盒，所述轉錄單元或表達盒包含在宿主細胞中表達編碼蛋白的核酸所需的全部附加元件。因此常見的表達盒包含與編碼待表達的蛋白的核酸序列可操作地連接的啟動子，以及使轉錄物有效多腺苷酸化所需的信號、核糖體結合位點和翻譯終止序列。通常，可以將編碼蛋白的核酸序列連接到可切割的信號肽序列上，以促進已轉化的細胞分泌所編碼的蛋白。此類信號肽特別包括來自組織纖溶酶原激活子、胰島素和神經元生長因子以及煙芽夜蛾(Heliothis virescens)的保幼激素酯酶的信號肽，等等。表達盒的其他元件可以包括增強子，如果將基因組DNA用作結構基因，則還包括帶有功能性剪接供體和受體位點的內含子。除了啟動子序列外，表達盒還應當包含位于結構基因下游的轉錄終止區，以提供有效的終止。終止區可以從與啟動子序列相同的基因中獲得，或者可以從其他基因中獲得。適合在特定宿主細胞中使用的表達控制序列通常是通過克隆該細胞中所表達的基因來獲得的。據本文中的定義，常用的原核控制序列，包含用于啟動轉錄的啟動子和核糖體結合位點序列，并可選地帶有操縱基因(operator)。此類常用的啟動子為例如圖2的載體中所示的CMV啟動子、￠-內酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(Iac)啟動子系統、色氨酸(trp)啟動子系統、tac啟動子和源自\的PL啟動子及N-基因核糖體結合位點。具體的啟動子系統對本發明來說并非至關重要，可以使用在原核生物中發揮功能的任何可獲得的啟動子。用于哺乳動物細胞、酵母和昆蟲細胞的真核表達系統在本領域是公知的，并且也是可商購獲得的。在酵母中，載體包括酵母整合質粒(如nP5)和酵母復制質粒(YRp系列質粒)以及PGPD-2。包含來自真核生物病毒的調控元件的表達載體通常在真核表達載體中使用，例如，SV40載體、乳頭瘤病毒載體和源自愛潑斯坦一巴爾二氏(Epstein-Barr)病毒的載體。其他示例性的真核載體包括使蛋白在SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠乳腺瘤病毒啟動子、勞氏肉瘤病毒啟動子、多角體蛋白啟動子(polyhedrinpromoter)或顯示出對真核細胞中的表達有效的其他啟動子的指導下可以表達的載體。一些表達系統具有提供基因擴增的標志物，例如胸苷激酶、潮霉素B磷酸轉移酶和二氫葉酸還原酶。作為另一選擇，不涉及基因擴增的高產率表達系統同樣是合適的，例如在昆蟲細胞中使用桿狀病毒載體，其具有在多角體蛋白啟動子或其他強桿狀病毒啟動子引導下的GPCR編碼序列。表達載體中常包含的元件還包括在大腸桿菌中起作用的復制子，允許篩選出攜帶重組質粒的細菌的抗生素抗性編碼基因，和使得可以插入真核序列的在質粒的非必需區中的獨特限制性位點。所選的具體抗生素抗性基因并非至關重要，本領域中已知的多種抗性基因中的任何一種都是適合的。可選的是，如有必要，選擇不會干擾真核細胞中的DNA復 制的原核序列。使用標準的轉染方法來產生表達大量蛋白(特別是本發明的不同的人源化抗肽-6抗體變體)的細菌、哺乳動物、酵母或昆蟲細胞系，隨后使用標準技術將這些蛋白純化。可以使用將外來核苷酸序列導入宿主細胞的任何公知方法。這些方法包括對磷酸鈣轉染、聚凝胺、原生質體融合、電穿孔、脂質體、顯微注射、原生質載體、病毒載體的使用，以及用于將克隆的基因組DNA、cDNA、合成DNA或其他外來遺傳物質導入宿主細胞的任何其他公知方法。唯一必要的是，所使用的特定基因工程方法能夠成功地將至少一種基因導入能夠表達本發明的多肽的宿主細胞中。在將表達載體導入細胞后，在有利于蛋白表達的條件下培養已轉染的細胞，并使用下文指出的標準技術從培養物中回收該蛋白。技術人員會認識到，可以對編碼本發明的人源化抗體變體的核酸進行修飾而不減小其生物活性。可以進行一些修飾來促進克隆、表達或將靶向分子并入融合蛋白中。此類修飾是本領域的技術人員公知的，并且包括例如終止密碼子，添加到氨基末端以提供起始位點的甲硫氨酸，設置在任一末端以產生方便定位的限制性位點的額外氨基酸，或輔助純化步驟的額外氨基酸(例如聚His)。一旦被表達，本發明的人源化抗體能夠根據本領域的標準方法(包括硫酸銨沉淀、親和柱和柱色譜法等)來純化。優選同質性至少為約90% 95%的基本純的組分，對于藥物用途，最優選98% 99%以上的同質性。一旦被純化(無論是部分純化或純化至所需同質性)，如果要實施治療性應用，所述多肽應當基本不含內毒素。通常，將來自大腸桿菌或其他細菌的功能性異源蛋白從包涵體中分離出，并需要使用強變性劑對該蛋白進行增溶化并進行后續的重折疊。在增溶步驟中，如本領域所公知的，必須存在還原劑來切斷二硫鍵。具有還原劑的示例性緩沖液是0. IM Tris pH8，6M胍，2mM EDTA，0. 3M DTE (二硫赤蘚醇)。二硫鍵的重新氧化可以在還原態和氧化態的低分子量硫醇試劑存在時出現。
復性通常是通過將變性的還原蛋白稀釋(例如，100倍)到重折疊緩沖液中來實現的。示例性的緩沖液是0. IM Tris, pH 8.0,0. 5M L-精氨酸，8mM氧化谷胱甘肽(GSSG)和2mM EDTA。作為對雙鏈抗體純化操作規程的修改，對重鏈和輕鏈區單獨進行增溶化和還原，隨后合并到重折疊溶液中。當將這兩種蛋白以一種蛋白相對于另一種蛋白不超過5倍摩爾過量的摩爾比混合時,得到了優選的產率。理想的是,在氧化還原轉換(redox-shuffling)完成后，向重折疊溶液中添加過量的氧化谷胱甘肽或其他氧化性低分子量化合物。除了重組方法外，還可以使用標準肽合成法來構造完整的或部分的本發明的抗體。長度小于約50個氨基酸的本發明的多肽的固相合成可以通過以下方法來實現將該序列的C端氨基酸連接到不溶性支持物上，隨后依次添加該序列中的其余氨基酸。
此外，用來篩選抗體以鑒定出所需抗體的技術可以影響所得到抗體的性質。可以獲得多種不同的技術來測試抗體/抗原的相互作用，從而鑒定出特別需要的抗體。此類技術包括ELISA、表面等離子體共振結合測定(例如，Biacore結合測定，Bia-coreAB,Uppsala,瑞典)、夾心法測定(例如，順磁珠系統，IGEN International, Inc. , Gaithersburg, Maryland)、蛋白質印跡、斑點印跡、酶聯免疫斑點法、免疫沉淀測定和免疫組化。還應該理解的是，本申請還提供并因此涵蓋編碼本文所述的抗體的重鏈和輕鏈的框架區和⑶R的多核苷酸序列以及用于在哺乳動物細胞中有效表達這些多核苷酸序列的表達載體。更具體而言，本發明涵蓋編碼由SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQID NO:23、SEQID NO:20,SEQ ID NO:26,SEQ ID N0:24和SEQ ID NO:25中任一個表示的本發明的重鏈可變區變體和輕鏈可變區變體(具體為，VHl VH4和VKl VK3)的核酸序列。在一個特定實施方式中，這些核酸序列可以分別包含由SEQ IDNO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQID NO:27,SEQ ID NO:33,SEQ ID N0:31 和 SEQ ID NO:32 中的任一個表示的序列。本發明還提供包含至少一個所述核酸序列及其任意組合的核酸構建體和表達載體，和用所述構建體轉化或轉染的表達至少一種所述VH和VK變體的宿主細胞。術語“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互換使用，指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其單鏈或雙鏈形式的聚合物。該術語涵蓋了包含已知核苷酸類似物或經修飾的骨架殘基或鍵的核酸，它們是合成的、天然存在的或非天然存在的，它們的結合性質與參照核酸相似，并且以與參照核苷酸相似的方式進行代謝。這些類似物的實例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。本領域的技術人員會認識到，核酸序列的互補序列能夠容易地從另一條鏈的序列確定。因此，本文所述的任何特定的核酸序列還公開了互補鏈。“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互換使用，指的是氨基酸殘基的聚合物。這些術語適用于天然存在的氨基酸聚合物，以及其中一種或多種氨基酸殘基是對應的天然存在的氨基酸的人工化學模擬物的氨基酸聚合物。“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及在功能上與天然存在的氨基酸相似的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些氨基酸，以及后來受到修飾的那些氨基酸，例如，羥基脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和0-磷酸絲氨酸。“氨基酸類似物”是指基本化學結構與天然存在的氨基酸相同的化合物，即，與氫結合的a碳、羧基、氨基和R基，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這種類似物具有經修飾的R基或經修飾的肽骨架，但保留了與天然存在的氨基酸相同的基本化學結構。“氨基酸模擬物”是指結構與氨基酸的常見化學結構不同、但功能與天然存在的氨基酸相似的化合物。在本文中，氨基酸可以用其公知的三字母符號來指代，或者可以用IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的單字母符號來指代。應意識到的是,在某些方面中，本申請提供雜交瘤細胞系，以及由這些雜交瘤細胞系產生的單克隆人源化抗體。所公開的細胞系還具有產生單克隆抗體以外的用途。例如，這些細胞系能夠與其他細胞(例如，適當帶有藥物標志物的人骨髓瘤細胞、小鼠骨髓瘤細胞、人-小鼠異質骨髓瘤細胞或人成淋巴細胞樣細胞)融合，從而產生其他雜交瘤，并因此用于轉移編碼單克隆抗體的基因。此外，這些細胞系能夠用作編碼抗肽-6人源化抗體的核酸的來源，所述抗體可以被分離和表達。另外，對于下文描述的診斷和治療應用，本發明的抗體可以可選地以共價或非共價方式連接到可檢測標記或額外的治療劑上。適合于此類應用的可檢測標記包括可以通過光譜學手段、光化學手段、生物化學手段、免疫化學手段、電子手段、光學手段或化學手段檢測的任何組分。本發明中可用的標記包括磁珠(例如DYNABEADS)、熒光染料(例如，異硫、氰酸熒光素、德克薩斯紅、羅丹明和綠色熒光蛋白等)、放射性標記(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如，辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和常用于ELISA和競爭性ELISA及本領域其他相似方法中的其他酶)和比色標記(例如膠體金或有色玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳月父等)珠)。檢測這些標記的手段是本領域的技術人員公知的。因此，例如，可以使用照相膠片或閃爍計數器來檢測放射性標記，可以使用用來檢測所發射的光照的光檢測器來檢測熒光標志物。通常通過向酶提供底物并檢測因該酶對該底物的作用而產生的反應產物來檢測酶標記；通過簡單地目視觀察有色標記來檢測比色標記。本發明的另一方面涉及包含有效量的至少一種分離且純化的人源化抗體作為活性成分的組合物，所述人源化抗體特異性地結合包含SEQ ID NO: 15的多肽，所述人源化抗體包含(a)重鏈可變區，所述重鏈可變區包含位于H22位的Cys、位于H23位的Ser、位于H26位的Gly、位于H27位的Phe、位于H28位的Ser、位于H29位的Leu、位于H30位的Ser、位于H31位的Thr、位于H32位的Ser、位于H33位的Asn、位于H34位的Met、位于H35位的Gly、位于H35A位的Val、位于H35B位的Gly、位于H48位的Leu、位于H50位的His、位于H51位的He、位于H52位的Leu、位于H53位的Trp、位于H54位的Asn、位于H55位的Asp、位于H56位的Ser、位于H57位的Lys、位于H58位的Tyr、位于H59位的Tyr、位于H60位的Asn、位于H61位的Pro、位于H62位的Ala、位于H63位的Leu、位于H64位的Lys、位于H65位的Ser、位于H92位的Cys、位于H95位的Met、位于H96位的Gly、位于H97位的Gly、位于H98位的Tyr、位于H99位的Tyr、位于HlOO位的Gly、位于H100A位的Asn、位于H100B位的Tyr、位于H100C位的Gly、位于H100D位的Tyr、位于H100E位的Tyr、位于H100F位的Ala、位于H100G位的Met、位于HlOl位的Asp和位于H102位的Tyr，且可選地包含位于H49位的Leu、位于H74位的Tyr、位于Hll位的lie、位于H41位的Ser和位于H108位的Ser中的至少一個；和(b)輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含位于LI位的Gin、位于L23位的Cys、位于L24位的Thr、位于L25位的Ala、位于L26位的Ser、位于L27位的Ser、位于L27A位的Ser、位于L28位的Val、位于L29位的Ser、位于L30位的Ser、位于L31位的Ser、位于L32位的Tyr、位于L33位的Leu、位于L34位的His、位于L47位的Trp、位于L50位的Ser、位于L51位的Thr、位于L52位的Ser、位于L53位的Asn、位于L54位的Leu、位于L55位的Ala、位于L56位的Ser、位于L71位的Tyr、位于L88位的Cys、位于L89位的His、位于L90位的Gin、位于L91位的Tyr、位于L92位的His、位于L93位的Arg、位于L94位的Ser、位于L95位的Pro、位于L96位的Pro和位于L97位的Thr，且可選地包含位于L21位的Met、位于LlO位的Ile和位于L80位的Ala中的至少一個；其中，這些位置是根據Kabat編號系統來確定的。根據某些實施方式，本發明的組合物還可以可選地包含藥學上可接受的載劑、賦形劑或稀釋劑。根據一個實施方式，本發明的組合物可以包含本發明所描述的任何人源化抗體中的至少一種或者其任意組合或片段來作為活性成分。在一個特定實施方式中，本發明的組合物可以包含具有重鏈可變區SEQ ID NO:21和輕鏈可變區SEQ ID N0:26的至少一種人源化抗體(VH2/VK3)。
在另一個具體實施方式
中，本發明的組合物可以包含具有重鏈可變區SEQIDNO:21和輕鏈可變區SEQ ID NO:24的至少一種人源化抗體(VH2/VK1)。在又一個具體實施方式
中，本發明的組合物可以包含具有重鏈可變區SEQIDNO:21和輕鏈可變區SEQ ID NO:25的至少一種人源化抗體(VH2/VK2)。根據另一個具體實施方式
，本發明的組合物可以包含具有重鏈可變區SEQIDNO:22和輕鏈可變區SEQ ID NO:25的至少一種人源化抗體(VH3/VK2)。本發明的其他具體實施方式
提供包含至少一種下述抗體的組合物具有重鏈可變區SEQ ID NO: 22和輕鏈可變區SEQ ID NO: 24的人源化抗體(VH3/VK1)，具有重鏈可變區SEQ ID NO:22和輕鏈可變區SEQ ID N0:26的人源化抗體(VH3/VK3)，具有重鏈可變區SEQID NO: 23和輕鏈可變區為SEQ ID NO: 24的人源化抗體(VH4/VK1)，具有重鏈可變區SEQ IDNO: 23和輕鏈可變區SEQ ID NO: 25的人源化抗體(VH4/VK2)，具有重鏈可變區SEQ ID NO: 23和輕鏈可變區SEQ ID勵:26人源化抗體(￥114/￥1(3)，具有重鏈可變區3￡0 ID N0:20和輕鏈可變區SEQ ID勵24人源化抗體(￥111/￥1(1)，具有重鏈可變區3￡0 ID N0:20和輕鏈可變區SEQ ID NO:25人源化抗體(VH1/VK2)，以及具有重鏈可變區SEQ ID N0:20和輕鏈可變區SEQ ID NO:26 的人源化抗體(VH1/VK3)。本發明還提供用于預防、治療、改善或抑制免疫相關病癥的藥物組合物。本發明的藥物組合物包含治療有效量的特異性地結合含有SEQ ID NO: 15的多肽或含有SEQID NO: 15的任何氨基酸序列(例如SEQ ID NO:98)的至少一種分離且純化的人源化抗體作為活性成分。根據一個實施方式，本發明的組合物包含人源化抗體，所述人源化抗體包含(a)重鏈可變區，所述重鏈可變區包含位于H22位的Cys、位于H23位的Ser、位于H26位的Gly、位于H27位的Phe、位于H28位的Ser、位于H29位的Leu、位于H30位的Ser、位于H31位的Thr、位于H32位的Ser、位于H33位的Asn、位于H34位的Met、位于H35位的Gly、位于H35A位的Val、位于H35B位的Gly、位于H48位的Leu、位于H50位的His、位于H51位的He、位于H52位的Leu、位于H53位的Trp、位于H54位的Asn、位于H55位的Asp、位于H56位的Ser、位于H57位的Lys、位于H58位的Tyr、位于H59位的Tyr、位于H60位的Asn、位于H61位的Pro、位于H62位的Ala、位于H63位的Leu、位于H64位的Lys、位于H65位的Ser、位于H92位的Cys、位于H95位的Met、位于H96位的Gly、位于H97位的Gly、位于H98位的Tyr、位于H99位的Tyr、位于HlOO位的Gly、位于H100A位的Asn、位于H100B位的Tyr、位于H100C位的Gly、位于H100D位的Tyr、位于H100E位的Tyr、位于H100F位的Ala、位于H100G位的Met、位于HlOl位的Asp和位于H102位的Tyr，且可選地包含位于H49位的Leu、位于H74位的Tyr、位于Hll位的lie、位于H41位的Ser和位于H108位的Ser中的至少一個；和(b)輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含位于LI位的Gin、位于L23位的Cys、位于L24位的Thr、位于L25位的Ala、位于L26位的Ser、位于L27位的Ser、位于L27A位的Ser、位于L28位的Val、位于L29位的Ser、位于L30位的Ser、位于L31位的Ser、位于L32位的Tyr、位于L33位的Leu、位于L34位的His、位于L47位的Trp、位于L50位的Ser、位于L51位的Thr、位于L52位的Ser、位于L53位的Asn、位于L54位的Leu、位于L55位的Ala、位于L56位的Ser、位于L71位的Tyr、位于L88位的Cys、位于L89位的His、位于L90位的Gin、位于L91位的Tyr、位于L92位的His、位于L93位的Arg、位于L94位的Ser、位于L95位的Pro、位于L96位的Pro和位于L97位的Thr，且可選地包含位于L21位的Met、位于LlO位的 Ile和位于L80位的Ala中的至少一個。所有位置都是根據Kabat編號系統來確定的。還應當注意的是，本發明的組合物還可以可選地包含藥學上可接受的載劑、賦形劑或稀釋劑。根據一個具體實施方式
，本發明的藥物組合物可以包含本發明所描述的任何人源化抗體中的至少一種或其任意組合來作為活性成分。在一個具體實施方式
中，本發明的藥物組合物包含具有重鏈可變區SEQ IDNO:21和輕鏈可變區SEQ ID NO: 26的至少一種人源化抗體(VH2/VK3)，或其任意組合或混合。本發明所呈現的結果清楚地展示了本發明的抗體對免疫相關病癥的治療潛力。因此，根據另一個實施方式，本發明的藥物組合物可以特別適合用于治療免疫相關病癥，例如，自身免疫性病癥或炎性病癥。如上文指出的，下文的實施例10 13使用兩種不同的動物模型清楚地證明了本發明的人源化抗體在治療已建立的炎性關節炎中的適用性。更具體而言，經AA誘導處理并隨后用已本發明的抗肽-6人源化抗體(尤其是VH2/VK3變體)處理的Lewis大鼠顯示出關節炎的顯著下降。類似地，用抗肽-6人源化抗體對已誘導產生膠原誘導性關節炎(CIA)的DBA/1小鼠進行治療，減輕了關節炎的嚴重程度。本發明還展示了對收集自類風濕性關節炎(RA)患者的PBMC以及來自健康個體的PBMC中的IL-10的離體誘導。因此，在特定實施方式中，本發明的人源化抗體誘導罹患免疫相關病癥(例如，關節炎、IBD、結腸炎、克羅恩氏病和糖尿病)患者的PBMC分泌IL-10。例如，如實施例13所示，本發明的人源化抗體誘導收集自類風濕性關節炎患者的PBMC分泌IL-10。因此，根據特定實施方式，與未經處理的PBMC相比，本發明的人源化抗體誘導PBMC IL-10分泌增加到至少I. I倍、增加到至少
I.2倍、增加到至少I. 3倍、增加到至少I. 4倍、增加到至少I. 5倍、增加到至少I. 6倍、增加到至少I. 7倍、增加到至少I. 8倍、增加到至少I. 9倍或優選增加到至少2倍。此外，如實施例所示，與未處理的對照中的疾病評分相比，用本發明的抗體對已建立的關節炎進行的治療可以使疾病評分降低至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%或者甚至降低至少55%或60%或更多。
此外，如Berent, J.等(Berent，J.等,Springer Semin.Immunopathol. 25:7-63 (2003))所指出的，佐劑性關節炎(AA)是類風濕性關節炎(RA)、幼年特發性關節炎(JIA)和膿毒性關節炎的成熟確立的動物模型。此外，不同的出版物(分別為 Myers 等，Life Sciences 61 (19) : 1861-1878 (1997)和 Brand 等,Springer SeminImmunopathol (2003) 25:3-18 (2003))清楚地指出膠原誘導性關節炎(CIA)也是RA及其他自身免疫病、風濕病和炎癥的確立模型。應了解的是，存在不同形式的關節炎，通常可以將其分為兩大類炎性關節炎和退化性關節炎，每一類都具有不同的起因。因此，根據一個具體實施方式
，可以將本發明的藥物組合物特定地設計用于治療和/或改善炎性病癥，例如，炎性關節炎。炎性關節炎的特征為滑膜炎、骨質侵蝕、骨質減少、軟組織腫脹和均一的關節間隙變窄。更具體而言，關節炎癥的特點是滑膜炎和骨質侵蝕。后者在初期表現為白色薄軟骨下骨板的局灶性中斷。通常，甚至在嚴重骨質減少的情況下也能夠看到該軟骨下骨板，但該骨板的中斷表明存在侵蝕。雖然在真正的骨質侵蝕前確實可以出現關節周骨質減少和局灶性軟骨下骨質減少，但表明確定的關節炎癥的卻是骨質侵蝕的存在。隨著骨質侵蝕的擴大，骨 破壞延伸到骨髓腔內的骨小梁中。炎性關節炎的一個重要特征是邊界性骨質侵蝕的概念。該術語是指位于發炎的滑液關節邊界的骨質侵蝕。該特定部位表示位于關節內但未被透明軟骨覆蓋的關節部分。因此，早期關節炎癥將在關節表面下的軟骨下骨板受到侵蝕之前產生邊界性侵蝕。在尋找骨質侵蝕時，關節的多個視圖對描述各個骨表面而言是必不可少的。炎性關節進程的第二個重要特征是均一的關節間隙變窄。其出現原因是，對關節軟骨的破壞在整個關節內空間是均一的。有關炎性關節疾病的第三個發現是軟組織腫脹。應認識到的是，還可以將炎性關節炎劃分為幾個子組，因此，后文所述的本發明的組合物以及方法、聯合組合物和試劑盒可以適用于治療不同子組的每種炎性關節炎病況。更具體而言，單個關節受累表示存在膿毒性關節炎。膿毒性關節炎的起因通常與葡萄球菌或鏈球菌微生物所引起的血源性播散(hematogenous seeding)有關。膿毒性關節的放射照相特征涵蓋了任何炎性關節炎的特征，即，關節周骨質減少、均一的關節間隙變窄、軟組織腫脹和骨質侵蝕。并不是所有的發現都會同時存在，而且確切地講，骨質侵蝕可能不明顯。因此，根據一個實施方式，可以將本發明的組合物和方法用于治療和/或改善炎膿毒性關節炎。相比之下，系統性關節炎的特征是多關節受累，并且包括兩大類類風濕性關節炎和血清陰性脊柱關節病。根據一個實施方式，可以將本發明的組合物以及方法、聯合組合物和試劑盒用于治療和/或改善類風濕性關節炎。類風濕性關節炎(RA)是慢性的系統性自身免疫病癥，最常見的是，其引起關節(關節炎)和腱鞘內的炎癥和組織損傷，并引起貧血。其還可以在肺、心包、胸膜和眼鞏膜中產生彌漫性炎癥，而且還會引起最常見于皮下組織中的小節損傷(nodular lesion)。其可以是能夠導致機能和行動能力大幅度喪失的令人失去能力和令人疼痛的病況。諸如類風濕因子和針對環瓜氨酸肽抗體等血清標志物是類風濕性關節炎的重要指示因子。類風濕性關節炎的放射照相特征涵蓋了關節炎癥的特征，且包括特別的骨質減少、均一的關節間隙減小、骨質侵蝕和軟組織腫脹。由于炎癥的慢性特點，諸如關節不全脫位和軟骨下囊腫等其他發現也可能是明顯的。
血清陰性脊柱關節病類包括銀屑病關節炎、反應性關節炎和強直性脊柱炎，其特征是炎性體征、多關節受累和帶有附加的骨增殖特征的手足遠端受累。因此，根據一個實施方式，可以將本發明的組合物和方法用于治療和/或改善血清陰性脊柱關節病類的任何病況。更具體而言，根據一個實施方式，可以將本發明的組合物和方法用于預防、治療、改善或抑制炎銀屑病關節炎。銀屑病關節炎是以皮膚炎癥(銀屑病)和關節炎癥(關節炎)為特征的慢性疾病。在美國接近306，000人患有銀屑病關節炎，而且在歐洲的前5大市場另有308，000人據信患有此疾病。銀屑病和關節炎經常單獨出現。事實上，在幾乎80%的患者中該皮膚疾病要早于關節炎。在最多15%的患者中，關節炎可以早于銀屑病。
銀屑病是銀屑病關節炎的特點之一，是一種普通的皮膚病況，其特征為斑駁的、凸起的帶有剝落的皮膚炎癥紅色區域。銀屑病經常影響肘和膝的末端、頭皮、臍和生殖器或肛門周圍的區域。約10%的銀屑病患者還發展有其關節的伴隨炎癥。通常，皮膚癥狀越嚴重，人就越可能發展銀屑病關節炎。銀屑病關節炎的起因未知，其可能是遺傳、環境和免疫起因的組合。雄性和雌性患銀屑病的可能性相等。對于銀屑病關節炎，雄性更可能具有脊椎炎形式(其中脊柱受到了影響)，而雌性更可能具有類風濕病形式(其中可能累及到許多關節)。銀屑病關節炎通常在35 55歲的人中發展。然而，其可以在幾乎任何年齡的人中發展。銀屑病關節炎與若干其他關節炎病況有許多共同特征，例如強直性脊柱炎、反應性關節炎、克羅恩氏病相關的關節炎和潰瘍性結腸炎。所有這些病況都能夠在脊柱和關節中、在目艮、皮膚、口和多種器官中引起炎癥。根據另一個實施方式，可以將本發明的組合物以及方法、聯合組合物和試劑盒用于預防、治療、改善或抑制強直性脊柱炎。強直性脊柱炎(AS，舊稱Bechterew氏病、Bechterew綜合征、Marie Striimpell病,是脊椎關節炎的一種形式)通常是關節炎的慢性和進行性形式，是由位于脊柱基部的脊柱面小關節和骶髂關節為特征的多個關節的炎癥引起的。當強直性脊柱炎趨于影響這些關節和脊柱周圍的軟組織時，其他關節以及關節周圍的組織也可能受到影響(肌腱末端病，其中腱和韌帶吸附到骨上)。強直性脊柱炎還可能累及關節以外的身體區域，例如眼、心臟和肺。該病癥經常導致骨性關節強硬(或融合)，因此術語強直性脊椎炎是指關節的僵硬，該術語源自希臘語ankylos。Spondylos意為椎骨(或脊柱)，描述一個或多個椎骨的炎癥。該疾病據估算可影響約0. 1% 0. 2%的一般群體。強直性脊柱炎主要影響年輕雄性。雄性患強直性脊柱炎的可能性是雌性的4 10倍高。大多數具有該疾病的人在15 35歲時發展該疾病，在平均26歲時發作。雖然確切原因未知，但據信強直性脊柱炎是由遺傳影響和觸發性環境因子的組合引起的。與一般群體中的7%相比，強直性脊柱炎患者中有約90% 95%具有組織抗原人白細胞抗原B27 (HLA-B27)。患有強直性脊柱炎的人經常具有該疾病的家族史。在另一個實施方式中，可以將本發明的組合物以及方法、聯合組合物和試劑盒用于預防、治療、改善或抑制反應性關節炎(ReA)。反應性關節炎是血清陰性脊柱關節病的另一種類型，是在響應身體另一部分的感染時發展的自身免疫性病況。與細菌接觸并形成感染可以觸發反應性關節炎。其癥狀與統稱為“關節炎”的各種其他病況(例如風濕病)類似。其由另一種感染因起，因此是“反應性”的，即，依賴于另一種病況。在慢性病例中，該“觸發”性感染經常得到了治愈或緩解，因此難以確定最初起因。反應性關節炎的癥狀常常包括三種表面上無關聯的癥狀的組合，即大關節的炎性關節炎、眼部炎癥(結膜炎和葡萄膜炎)和尿道炎。應指出的是，ReA還稱作Reiter氏綜合征(以德國醫師Hans Reiter命名)，還稱作尿道性關節炎、性病性關節炎和腸多動脈炎(polyarteritis enterica)。應認識到的是，存在很多其他形式的炎性關節炎，包括幼年特發性關節炎、痛風和假性痛風以及與結腸炎或銀屑病相關的關節炎。因此應認識到的是，本發明的組合物以及方法、聯合組合物和試劑盒也適用于這些病況。因此，根據另一個實施方式，可以將本發明的組合物和方法用于預防、治療、改善或抑制幼年特發性關節炎(JIA)。JIA是兒童中持續性未分化關節炎的最常見形式(在此、背景下，幼年是指16歲前的發作，特發性是指無確定起因的病況，關節炎是指關節的滑膜的炎癥)。JIA是見于兒童時期的關節炎的亞類，其可以是短暫且自限的或者是慢性的。其明顯有別于成人中常見的關節炎(類風濕性關節炎)和可以存在于兒童時期的作為慢性病況的其他類型的關節炎(例如，銀屑病關節炎和強直性脊柱炎)。根據另一個實施方式，可以將本發明的組合物以及方法、聯合組合物和試劑盒用于治療和/或改善痛風。痛風(代謝性關節炎)是由尿酸的積累產生的疾病。在此病況中，尿酸單鈉或尿酸的晶體沉積在關節的關節軟骨、腱和周邊組織上。這些晶體引起炎癥和疼痛，二者都是嚴重的。如果不進行治療，這些晶體會形成痛風石(tophi)，其可以引起明顯的組織損傷。假性通風是由鈣晶體引起的病況。當鈣晶體在腱中引起炎癥發作時，稱其為“鈣化性肌腱炎”。本發明還提供用于治療此病癥的組合物和方法。通常，如上文同樣公開的，存在多種類型的關節炎，應注意的是，本發明的組合物以及方法、聯合組合物和試劑盒還可以適用于治療所指出的關節炎的所有原發性形式和關節炎的所有繼發性形式。這些病況可以包括紅斑狼瘡、Henoch-Sduhk:u!紫癜、銀屑病關節炎、反應性關節炎、血色病、肝炎、韋格納肉芽腫病(及很多其他血管炎綜合征)、萊姆病、家族性地中海熱、帶有回歸熱的高免疫球蛋白血癥D、TNF受體相關的周期性綜合征和炎性腸病(包括克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎)。實施例14和15使用TNBS-結腸炎動物模型清楚地展示了人源化抗肽_6抗體的顯著改善效果。因此，在另一個具體實施方式
中，本發明的藥物組合物以及方法、聯合組合物和試劑盒可以適用于預防、治療、改善或抑制炎性腸病(IBD)，具體為潰瘍性結腸炎和克羅恩氏病。根據具體實施方式
，對結腸炎或克羅恩失病的治療、預防或改進可以反映在對體重損失的抑制和對與該疾病相關的炎癥應答的抑制以及總體顯微組織學疾病評分的提高上。例如，與未處理的對照中的顯微疾病評分相比，用本發明的人源化抗體進行的治療可以使顯微疾病評分降低至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%或者甚至降低至少55%或60%或更多。此外，在另一個實施方式中，與未處理的對照中的體重損失相比，用本發明的人源化抗體進行的治療可以使體重損失降低至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%或者甚至降低75%或更多。炎性腸病(IBD)是常見的胃腸病癥，可以將其理解為免疫應答的Thl-促炎亞型和Th2-抗炎亞型之間失衡的結果。IBD是結腸和小腸的一組炎性病況。IBD的主要類型是克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎。IBD的其他形式只占很小一部分。這些是膠原性結腸炎、淋巴細胞性結腸炎、缺血性結腸炎、改道性結腸炎、白塞氏綜合征和未定型結腸炎，未定型結腸炎不能作出將克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎區分開的明確診斷。克羅恩氏病和UC的主要區別是炎性變化的位置和特性。克羅恩氏病能夠影響從口到肛門的任何胃腸道部分(跳躍性病變)，但是大部分情況是起始于回腸末端。相比之下，潰瘍性結腸炎則局限在結腸和直腸。顯微觀察下，潰瘍性結腸炎局限在粘膜處(腸的上皮層)，而克羅恩氏病影響整個腸壁。最終，克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎與不同比例的腸外表現(例如肝問題、關節炎、皮膚表現和眼問題)一起出現。克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎具有相同的癥狀，例如腹瀉、嘔吐、體重損失、發熱和腹痛。最近的假說推斷，IBD的可能起因是因缺乏常規靶標(例如寄生蟲和蠕蟲)，過度活躍的免疫系統攻擊各種消化道組織。隨著由諸如蛔蟲、鉤蟲和人的鞭蟲等寄生蟲引起的 感染數量的減少，診斷有IBD的人的數量在增加，并且在常出現寄生蟲感染的國家，該病況仍然很稀少。存在若干種伴隨IBD的腸外表現，例如自身免疫現象；免疫復合物在目標器官損傷(target organ damage)中起作用；并且使用免疫抑制劑(例如糖皮質激素、硫唑嘌呤、氨甲喋呤和環孢霉素)來減輕該疾病。IBD患者具有針對結腸細胞組分和若干種不同的細菌抗原的抗體。這些抗原因上皮損傷而得以接觸免疫系統。在這些患者中還已描述了T細胞介導的免疫性的異常，包括皮試無反應(cutaneous anergy)和對T細胞刺激的反應性減小。此外，確定了粘膜細胞介導的免疫性的變化，包括粘膜IgG細胞的濃度升高和T細胞亞群的變化，這暗示了抗原剌激。在感染性損傷、免疫損傷或毒性損傷后靶抗原的暴露導致粘膜免疫細胞的激活，該激活產生了引發粘膜炎性應答的細胞因子。促炎細胞因子(例如IFNy)的分泌有助于提高粘膜滲透性，并且已在IBD的動物模型中有所描述。可以將⑶4和⑶8淋巴細胞分型為產生IL-2和IFNy的Thl細胞或產生IL_4或11-10的Th2細胞。免疫系統應答外來或自身的抗原的方式是這兩種應答亞型之間的平衡的結果。Thl型應答參與若干種自身免疫病癥和慢性炎癥病癥(例如IBD)的發病機制。因此，可以將人類中的實驗性結腸炎和IBD理解為促炎的Thl型細胞因子和抗炎的Th2型細胞因子之間的失衡。最近顯示，在動物和人中，抗炎細胞因子(例如IL-10)能夠使Thl介導的細胞因子的促炎效果下調，從而減輕免疫介導的病癥。通常，通過施用具有強抗炎效果的藥物(例如潑尼松)來開始進行對IBD的治療。一旦成功地控制了炎癥，通常會使患者改用更溫和的藥物來使疾病保持在消退狀態。如果不成功，可以施用免疫抑制藥的組合。治療的目的是為了實現消退，此后通常會使患者改用潛在副作用更少的更弱的藥物。常常會出現原始癥狀的急性再現；這稱作“突發(flare-up)”。根據環境，其可能自行消散或需要藥物治療。突發的間隔時間可以是從數周到數年的任何長度，并且患者之間的差異很大，少數患者從未經歷過突發。通常使用類固醇來控制疾病突發，而且類固醇作為維持藥物曾經是可接受的。諸如TNF抑制劑等生物試劑已在克羅恩氏病患者中使用了若干年，近來用在了潰瘍性結腸炎患者中。嚴重的情況可能需要外科手術，例如腸切除、狹窄成形術或者臨時或永久的結腸造口術或回腸造口術。克羅恩氏病是炎性腸病(IBD)的一種類型。其為慢性病況，目前對其沒有治愈方法。其特征為，在癥狀突發時周期性的改善，然后偶發(印isode)。其能夠影響消化道(亦稱為從口到肛門的胃腸(GI)道)的任何區域，但最常見的是影響小腸的下部(稱之為回腸)。腫脹延伸到受影響器官的內壁深處。腫脹可以引起疼痛，并且可以使腸頻繁地清空，導致腹瀉。克羅恩氏病可以根據其所影響的區域來進行分類。回結腸克羅恩氏病影響回腸(小腸的最末部分，與大腸連接)和大腸，并占病例的50%。克羅恩氏回腸炎僅影響回腸，占病例的30% ;克羅恩氏結腸炎影響大腸，占累及小腸最末部分和大腸的克羅恩氏病的病例的剩余20%，而且可能特別難與潰瘍性結腸炎區分開。胃十二指腸克羅恩氏病在胃和小腸的最前部分(即十二指腸)中引起炎癥。空腸回腸炎在小腸的上半部(即空腸)中引起炎癥斑塊。還可以將克羅恩氏病稱為回腸炎或腸炎。腹痛可以是克羅恩氏病的初期癥狀。其通常伴有腹瀉，由腸狹窄引起的癥狀也常見于克羅恩氏病中。腹痛通常在狹窄的腸區域最嚴重。克羅恩氏病與很多其他慢性炎癥疾病一樣，能夠引起各種全身性癥狀。在兒童中，生長不足較為常見。基于不能保持生長，許多兒童最先被診斷患有克羅恩氏病。除了全身性受累和胃腸受累以外，克羅恩氏病能夠影響許多其他器官系統。眼內部的炎癥，即葡萄膜炎，能夠引起眼痛，特別是在暴露于光時(畏光)。炎癥還可能累及眼白部分(鞏膜)，即一種被稱為鞏膜外層炎的病況。如不治療，鞏膜外層炎和葡萄膜炎均能夠導致失明。克羅恩氏病與被稱為血清陰性脊柱關節病的一種類型的風濕病有關。該組疾病的特征是一個或多個關節的炎癥(關節炎)或肌止點的炎癥(起止點炎)。關節炎能夠影響更大的關節，例如膝或肩，或者可以僅累及手和足的小關節。關節炎還可以累及脊柱，導致強直性脊柱炎(如果整個脊柱受累)或只是骶髂關節炎(如果僅下部脊柱受累)。關節炎的癥狀包括疼痛、溫熱、腫脹、僵硬的關節，以及關節運動性或功能的喪失。結腸鏡檢查術是對克羅恩氏病做出診斷的最佳測試，因為其使得可以對結腸和回腸末端進行直接目視觀察，從而確定疾病累及模式。發現疾病的塊狀分布，且累及結腸或回腸但并不累及直腸，表明有克羅恩氏病。目前，對克羅恩氏病沒有治愈方法，且消退可能不會實現，或者如果實現也不會長久。對克羅恩氏病的治療僅僅是在癥狀活躍時進行，并且包括先治療急性問題，隨后維持消退。急性治療使用藥物來減少炎癥(通常為氨基水楊酸鹽抗炎劑和皮質類固醇)。當癥狀在消退狀態時，治療進入維持階段，目的是避免癥狀的復發。長期使用皮質類固醇具有明顯的副作用；所以通常并不將其用于長期治療中。替代形式包括僅使用氨基水楊酸鹽，但是僅有少數能夠維持治療，而很多都需要免疫抑制藥。用于治療克羅恩氏病的癥狀的藥物包括5-氨基水楊酸(5-ASA)制劑、潑尼松、免疫調節劑(例如硫唑嘌呤、巰基嘌呤、氨甲喋呤、英夫利昔單抗、阿達木單抗、賽妥珠單抗(certolizumab)和那他珠單抗)。氫化可的松用于克羅恩氏病的嚴重發作。從20世紀90年代末開始，可以得到生物藥物(參見英夫利昔單抗)。克羅恩氏病不能通過外科手術治愈，但是在腸出現部分或全部堵塞時會使用外科手術。克羅恩氏病的發病率已從在挪威和美國進行的群體研究中得到確定，且相似，為、(6 7. I) :100, 100。克羅恩氏病在北部國家更常見，并且在同一國家的北部地區顯示出更高的比重。認為克羅恩氏病發病率在歐洲是相似的，但在亞洲和非洲更低。作為年齡的函數，克羅恩氏病的發病率為雙峰分布該疾病傾向于侵襲10多歲到20多歲的人以及50多歲到70多歲的人。應注意的是，本發明的人源化抗體還適用于治療或預防上述的克羅恩氏病以及下述的潰瘍性結腸炎。潰瘍性結腸炎(U.C.)是GI道內壁的另一種慢性(長期持續的)炎癥。UC通常從直腸開始延伸，并累及幾乎整個結腸，且該疾病局限于結腸(大腸)。內壁變得發炎，其特征是開口的瘡或潰瘍。在活動性疾病中，潰瘍形成在炎癥已將通常位于結腸內壁的細胞殺傷的地方，隨后出現流血和化膿。結腸炎癥還會引起結腸頻繁地清空，從而引發緩起的混有血液的腹瀉。潰瘍性結腸炎是間歇病，具有周期性的惡化癥狀，以及相對無癥狀的時期。雖然潰瘍性結腸炎的癥狀有時可以自行減弱，但是該疾病通常需要治療來進入消退階段。在美國，每100，000人中有35 100人，或低于總人口的0. 1%，患有潰瘍性結腸 炎。在世界上的北部國家以及單個國家或其他區域的北部地區，該疾病更為普遍。在北美，潰瘍性結腸炎的發病率為每100，000人中每年出現10 12個新病例，且潰瘍性結腸炎的峰值發病率出現在15歲到25歲之間。患病率是1/1000。認為在發作年齡上存在雙峰分布，第二個發病率峰出現在生命的第6個十年中。受該疾病影響的雌性多于雄性。潰瘍性結腸炎和克羅恩氏病的地理分布在全世界范圍內相似，最高發病率在美國、加拿大、英國和斯堪的納維亞。在歐洲和美國，與南部地區相比，在北部地區見到的發病
率更高。與克羅恩氏病一樣，潰瘍性結腸炎的患病率在德系猶太人中更高，而且在猶太血統的其他人、非猶太高加索人、非洲人、西班牙人和亞洲人中逐步下降。潰瘍性結腸炎的臨床表現取決于疾病的進展程度。患者通常表現出緩起的混有血液和粘液的腹瀉。他們還可能具有如下體征體重損失，和在直腸檢查時發現血液。該疾病通常伴有從輕微不適到劇痛痙攣的不同程度的腹痛。潰瘍性結腸炎與影響身體多個部位的一般炎癥過程相關。有時，這些相關的腸外癥狀是該疾病的早期體征，例如，十幾歲的青少年中的疼痛的關節炎膝蓋。然而，在腸部表現發作之前，不能確定該疾病的存在。診斷患有潰瘍性結腸炎的人有約一半具有輕微癥狀。其他的則遭受頻繁的發熱、血性腹瀉、惡心和嚴重的腹部痙攣。潰瘍性結腸炎還可以引起諸如關節炎(血清陰性關節炎、強直性脊柱炎、骶髂關節炎)、眼部炎癥(虹膜炎、葡萄膜炎、鞏膜外層炎)、肝臟疾病和骨質疏松癥。這些并發癥可能是免疫系統所觸發的炎癥造成的結果，因為患有潰瘍性結腸炎的人具有免疫系統異常。潰瘍性結腸炎通常從直腸向上沿結腸延伸。根據該疾病沿結腸向上延伸的距離，按受累程度來對該疾病進行分類。除了受累程度以外，UC患者還可以用其疾病的嚴重程度來表征。潰瘍性結腸炎的標準治療視受累程度和疾病嚴重程度而定。目標是，最初用藥物誘發消退，隨后施用維持性藥物來防止疾病復發。誘發消退和維持消退的概念非常重要。用來誘發和維持消退的藥物在一定程度上有所重疊，但治療是不同的。醫師首先引導治療來誘發消退，包括緩解癥狀并使結腸內壁粘膜愈合，隨后進行更長時間的治療來維持消退。所用的藥物包括氨基水楊酸鹽(例如5-氨基水楊酸或5-ASA)、皮質類固醇(例如潑尼松)、免疫抑制藥(例如氨甲喋呤)和生物治療劑(例如英夫利昔單抗)。與克羅恩氏病不同，潰瘍性結腸炎通常能夠通過外科手術切除大腸來得到治愈。潰瘍性結腸炎并不是由情緒困擾(emotional distress)或對某些食物或食物產品的敏感性引起的，但是這些因素可能會在一些人中觸發癥狀。因患潰瘍性結腸炎而帶來的生活壓力也可能促使癥狀的惡化。雖然可以使用藥物來誘發并維持疾病消退，但僅有部分是成功的，并且約25% 40%的潰瘍性結腸炎患者最終會因大量出血、病情嚴重、結腸破裂或癌癥風險而必須將其結腸切除。
診斷潰瘍性結腸炎的最佳測試仍然是內窺鏡檢查術。可屈性乙狀結腸鏡檢查通常足以支持診斷。取粘膜的組織活檢來明確地診斷UC并將其與克羅恩氏病區分開，后者在臨床上受到不同的處理。應注意的是，本發明的人源化抗體還適合于治療或預防IBD及其所有亞型，其中一些在上文中有更詳細的描述。與包括克羅恩氏病和UC在內的IBD—樣，銀屑病也是與促炎和抗炎細胞因子的產生相互影響的炎性病癥。雖然銀屑病的確切起因和發病機理未知，但在銀屑病中已表明存在促炎的I型(Thl)細胞因子的過表達，并認為其具有病理生理學重要性。重要的是，表明了皮膚IL-IOmRNA的表達與其他炎性皮膚病相比相對缺乏。此外，早先的出版物表明，正在接受確立的抗銀屑病療法的患者顯示出比治療前的患者更高的外周血單個核細胞IL-IOmRNA的表達。這表示IL-10可能具有抗銀屑病能力。事實上，表皮施用IL-10在患者中產生了免疫抑制效果(降低的單核細胞HLA-DR表達、TNF- a和IL-12分泌能力、IL-12血漿水平和對回憶抗原的應答性)，并觀察到了向2型(Th2)細胞因子模式的偏移(使產生IL4、I15和ILlO的T細胞的比例升高，IgE血清水平的選擇性升高)。所以，11-10對治療銀屑病的重要性很明顯。因此，根據一個具體實施方式
，可以將本發明的人源化抗體用于預防、治療、改善或抑制銀屑病或任何有關病況。更具體而言，銀屑病是一種常見的皮膚病況，其特征為斑駁的、凸起的帶有剝落的皮膚炎癥紅色區域。銀屑病經常影響肘和膝的末端、頭皮、臍和生殖器或肛門周圍的區域。其在免疫系統發出加速皮膚細胞生長周期的錯誤信號的時發生。銀屑病通常引起的鱗狀斑稱作銀屑病斑塊，是炎癥區域和皮膚過量生成的區域。皮膚在這些部位快速地積累，從而使皮膚具有銀白色外表。斑塊常出現在肘和膝的皮膚上，但可以影響包括頭皮、手掌及足底和生殖器在內的任何區域。與濕疹不同，銀屑病更可能出現在關節的外側上。該病癥是慢性的重現性病況，其嚴重程度從微小的局部斑塊到完全覆蓋身體不等。指甲和趾甲常常受到影響(銀屑病甲營養不良)并且可以視作獨立癥狀。如在關節炎中提到的，銀屑病也可以引起關節的炎癥，即銀屑病關節炎。10% 15%的患有銀屑病的人發展有銀屑病關節炎。雖然有多種治療可以使用，但由于其慢性重現性特性，銀屑病難以治療。銀屑病的癥狀可以表現為多種形式。變化形式包括斑塊狀銀屑病、膿皰性銀屑病、滴狀銀屑病和屈側銀屑病。可以將銀屑病分為非膿皰性類型和膿皰性類型。應注意的是，本發明的方法涵蓋了對非膿皰性和膿皰性銀屑病的治療。更具體而言，非膿皰性銀屑病包括尋常性銀屑病和紅皮病性銀屑病。尋常性銀屑病(也稱慢性靜止性銀屑病(Chronic stationary psoriasis)或斑塊狀銀屑病)是最常見的銀屑病類型。其影響80% 90%的患有銀屑病的人。斑塊狀銀屑病看上去通常為覆蓋有銀白色鱗狀皮膚的凸起的發炎皮膚區域。這些區域稱作斑塊。紅皮病性銀屑病(紅皮性銀屑病)涉及遍及大部分身體表面的大范圍皮膚炎癥和皮膚頁狀剝落。其可能伴有嚴重的搔癢、腫脹和疼痛。其通常是不穩定的斑塊狀銀屑病發生惡化的結果，特別是在突然取消全身治療之后。這種形式的銀屑病可以是致命的，因為極度的炎癥和頁狀剝落會破壞身體的溫度調節能力和皮膚的屏障功能。在又一個具體實施方式
中，本發明的人源化抗體以及其組合物、方法和試劑盒可以用于治療膿皰性銀屑病。膿皰性銀屑病看上去為充滿非感染性膿的凸起腫塊(膿皰)。膿包下面及周圍的皮膚發紅且變得一觸即痛。膿皰性銀屑病可以常常局限在手和足部(掌跖膿皰病)，或者可以泛發為隨機出現在身體任何部分的大范圍的斑塊。膿皰性銀屑病的亞 型包括泛發性膿皰性銀屑病(von Zumbusch膿皰性銀屑病)、掌跖膿皰病(永久性掌跖膿皰病、Barber型膿皰性銀屑病、四肢膿皰性銀屑病)、膿皰性環狀銀屑病、連續性肢端皮炎和皰疹樣膿皰病。應了解的是，本發明的人源化抗體以及其組合物、方法和試劑盒還可以適用于治療任何其他類型的銀屑病，例如藥物引起的銀屑病、皮褶銀屑病(或屈側銀屑病)。皮褶銀屑病看上去為光滑的發炎的皮膚斑。其出現在皮膚褶皺中，特別是在生殖器周圍(在大腿和腹股溝之間)、腋窩、過重的胃部下方(血管翳)和乳房下方(乳房下褶皺)。其因摩擦和出汗而加重，并且易受真菌感染。此外，本發明的人源化抗體可以用于治療滴狀銀屑病。這種類型的銀屑病的特征是大量的小的鱗狀的紅色或粉色淚滴形損傷。這些大量的銀屑病斑點出現在身體的較大區域上，主要是軀干，但也出現在四肢和頭皮上。在滴狀銀屑病之前，經常是鏈球菌所致的感染，通常為鏈球菌所致的咽炎。指(趾)甲銀屑病也可以用本發明的方法來治療，其造成指甲和趾甲外觀上的多種變化。這些變化包括指(趾)甲板下脫色、指(趾)甲的孔蝕、跨甲紋、甲下皮膚增厚和甲的松弛(甲剝離)與塊狀崩落。如前文提到的，本發明的人源化抗體以及其組合物、方法和試劑盒可以用于治療銀屑病關節炎。銀屑病關節炎涉及關節和結締組織的炎癥。銀屑病關節炎能夠影響任何關節，但最常見于指和趾的關節中。這可以造成指和趾的香腸形腫脹，又稱為指(趾)炎。銀屑病關節炎還能夠影響髖、膝和脊柱(脊柱炎)。患有銀屑病的人中約有10% 15%還患有銀屑病關節炎。在一些實施方式中，對患有銀屑病的受試對象的治療可以改進該受試對象的生理學狀態，例如，使因疾病而粗糙的皮膚變得光滑。在優選實施方式中，局部應用本發明的人源化抗體不會刺激皮膚且不會助長炎癥。應了解的是，其他慢性或急性的炎癥相關的皮膚病理病況可以用本發明的人源化抗體以及其組合物、方法和試劑盒來治療。所述其他病況包括皮炎、炎性皮膚損傷、皮膚色素沉著的炎癥相關擾亂，例如，白癜風和濕疹。
更具體而言，本發明的某些實施方式涉及本發明的人源化抗體以及其組合物、方法和試劑盒的治療皮炎的用途。術語“皮炎”通常是指皮膚的炎癥。不同的種類通常對特定的過敏原具有相同的變態反應。該術語可以用來指濕疹，濕疹還稱為皮炎濕疹或濕疹性皮炎。對濕疹的診斷通常意味著特應性皮炎(兒童濕疹)，但在沒有適當背景的情況下，其意思僅僅是“疹(rash)”，即，短暫的皮膚炎癥。在一些用語中，“皮炎”和“濕疹”是同義詞，但是在另一些用語中，“皮炎”意味著急性病況而“濕疹”意味著慢性病況。經常將這兩種病況歸為一類。根據另一個具體實施方式
，可以將本發明的組合物以及方法、聯合組合物和試劑盒用于治療和/或改善自身免疫病癥，例如糖尿病。因此，根據一個具體實施方式
，可以將本發明的人源化抗體用于預防、治療、改善或抑制I型糖尿病。糖尿病是以紊亂的代謝和不適當高的血糖(高血糖癥)為特征的綜合征，其原因是低水平的激素胰島素，或者是伴有待補償的胰島素分泌水平不足的對胰島素效果的異常抵抗。特征性癥狀是過量的尿的產生(多尿)、過渡口渴和增加的液體攝取(煩渴)以及視覺模糊；如果血糖僅略微上升，這些癥狀就可能不存在。 存在三種主要形式的糖尿病1型、II型和妊娠糖尿病(出現在懷孕過程中)。I型糖尿病的特征是胰腺中產生胰島素的胰島P細胞的喪失，導致胰島素缺乏。P細胞喪失的主要原因是T細胞介導的自身免疫攻擊。沒有已知的預防措施可以用來抵抗I型糖尿病。另一方面，當發病出現時，多數患病的人是健康的且具有健康的體重。尤其在早期，對胰島素的敏感性和應答性通常是正常的。I型糖尿病可以影響兒童或成人，而由于其代表了影響兒童的主要糖尿病情況，傳統上將其命名為“幼年糖尿病”。對I型糖尿病的主要治療，甚至從極早期開始，是更換胰島素，并組合有用血液測試監視儀小心監控血液葡萄糖水平。在無胰島素的情況下，可以形成糖尿病酮酸中毒，其可以導致昏迷或死亡。還應注意對生活方式的調整(飲食和鍛煉)，雖然這些并不會使損失逆轉。除了常見的皮下注射外，還可以用泵來遞送胰島素，該方法使得可以一天24小時以預設的水平持續輸注胰島素，并且能夠在用餐時間按需定制胰島素的劑量(推注)。I型治療必須無限期地持續下去。如果在測試和藥物治療中采取足夠的注意、適當的照料和紀律，治療并不會破壞正常活動。在美國，患病率是人口的0. 12%，或接近340，000人。發病率是每年約30，000例，占人口的0. 01%。在另一個具體實施方式
中，可以將本發明的人源化抗體用于預防、治療、改善或抑制II型糖尿病。II型糖尿病或非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)或成年發作型糖尿病是代謝紊亂，其特征是在胰島素抵抗和相對胰島素缺乏背景下的高血糖。隨著該病況的進行，可能需要藥物治療。高血糖引起的長期并發癥包括心臟病發作、中風、截肢和腎功能衰竭的風險升高。存在多種因素能夠潛在地使II型糖尿病發生或加重。這些因素包括肥胖、高血壓、升高的膽固醇(混合性高脂血癥)和通常被稱作代謝綜合征的病況(還稱作X綜合征、Reavan氏綜合征或CHAOS)。其他起因包括肢端肥大癥、柯興綜合征、甲狀腺毒癥、嗜鉻細胞瘤、慢性胰腺炎、癌癥和藥物。已發現可提高II型糖尿病風險的其他因素包括衰老、高脂肪飲食和活動較少的生活方式。胰島素抵抗是指在胰島素存在時體細胞不發生適當的應答。與I型糖尿病不同，胰島素抵抗通常是“受體后的”，意思是其為應答胰島素的細胞的問題，而不是胰島素產生方面的問題。不恰當處理的II型糖尿病能夠引起嚴重的并發癥，包括腎功能衰竭、勃起功能障礙、失明、緩慢愈合的傷口(包括外科手術切口)和動脈疾病(包括冠狀動脈疾病)。II型的發作在中老年中最為常見，但是由于兒童肥胖和不活動性的增多，其出現在青少年和年輕成人中的頻率越來越高。被稱作MODY的一種糖尿病類型在青少年中越來越常見，但是將其類型劃分為特定原因引起的糖尿病而不是II型糖尿病。越來越多的證據表明，在炎癥和II型糖尿病的發病機理之間可能存在關聯。暗示胰島素抵抗和II型糖尿病可能具有免疫因素的這一新興概念為研究免疫治療性方法開辟了新的通道，從而既可以理解II型糖尿病的發病機理又可以開發對該疾病的新的治療方法。在免疫相關病癥的另一實例中，本發明還提供了本發明的人源化抗體以及其組合物和試劑盒在預防、治療、改善或抑制多發性硬化的方法中的用途。更具體而言，多發性硬化(縮寫為MS，舊稱彌漫性硬化或彌漫性腦脊髓炎)是影響中樞神經系統(CNS)的慢性、炎 性、脫髓鞘性疾病。疾病發作通常出現在年輕成年人中，且更常見于女性，根據國家或特定人群，患病率為 2/100，000 150/100，000。MS影響腦和脊髓的被稱為白質的區域中的神經元。這些細胞在完成處理的灰質區之間以及在這些區和身體其他部分之間攜帶信號。更具體而言，MS破壞少突細胞，少突細胞是負責產生并維持脂層的細胞，所述脂層稱作髓鞘，其輔助神經元攜帶電信號。MS導致髓磷脂的變薄或完全喪失，并且在不太常見的情況下，導致神經元的延長部分或軸突的切斷(橫切)。當髓磷脂喪失時，神經元不再有效地傳導其電信號。名稱多發性硬化是指白質中的疤痕(硬化，更多地稱為斑塊或損傷)。這些損傷中的髓磷脂喪失會引起一些癥狀，這些癥狀視何種信號受到阻斷而大不相同。然而，如今更先進的成像形式顯示很多傷害發生在這些區域外。該疾病可伴隨有幾乎任何神經學癥狀。MS有若干種形式，其中新癥狀以不連續的偶發形式(復發形式)出現或隨時間緩慢積累(進行性形式)。多數人首先被診斷患有復發性-消退性MS，但多年后發展了繼發性-進行性MS(SPMS)。在偶發或發作之間，癥狀可能完全消失，但永久性的神經問題經常會持續，尤其是隨著疾病的進展。雖然對該疾病過程中所涉及的機制知之甚多，但起因仍然難以捉摸。具有最多支持者的理論是，該疾病是由自身免疫反應引起的。該疾病不能治愈，但已證明若干種療法是有益的。治療的目的是在偶發后恢復功能、防止新的發作和防止失能。如任何治療一樣，藥物治療具有若干種不良作用，而且很多療法仍在研究中。MS的臨床特征通常為CNS中的損傷所引起的重現性或慢性進展性的神經學功能障礙。在病理學上，所述損傷包括影響大腦、視神經和脊髓的多個脫髓鞘區域。潛在的病原學尚不明確，但MS被廣泛認為至少在部分上是自身免疫疾病或免疫介導的疾病。EAE是用于研究MS的新治療方案的有用的實驗模型。已發現多種免疫抑制劑在預防和治療EAE中有效，包括皮質類固醇和共聚物I。然而，到目前為止患者要么接受對癥治療，要么用免疫抑制劑治療，尚未確立對MS的滿意療法。因此，本發明包括治療、推遲或預防MS發作的組合物和方法，包括向有需要的受試對象施用本發明的抗體。
如下文實施例所示，本發明的抗肽-6人源化抗體清楚地展示了抗炎效果。更具體而言，圖14和圖15示出，使人PBMC暴露于本發明的抗肽-6人源化抗體(具體為VH2/VK3變體及其F(ab)2片段)引發了最終導致IL-10基因表達上調的后繼事件。炎癥部位中IL-10分泌的增加能夠將局部細胞因子特征從炎性應答轉變為抗炎應答，并因此可以說明針對由這些抗體引發的炎癥的保護機制。對IL-10分泌的誘導可以是抗體與巨噬細胞蛋白之間的相互作用的直接效應，并且不需要任何HSP抗原的存在。如圖12所示，本發明的人源化抗體特異性地結合人巨噬細胞膜蛋白。因此，可以將本發明的抗體用作免疫調節劑，將Thl/Th2細胞平衡向抗炎的Th2應答方向調節。因此，本發明還提供用于增加IL-10(白細胞介素-10)的表達和水平的組合物和方法。根據此方面，本發明的組合物包含有效量的針對含有氨基酸序列SEQ ID NO: 15的肽的至少一種分離且純化的抗肽-6人源化抗體作為活性成分。本發明的組合物還可選地包含藥學上可接受的載劑、賦形劑或稀釋劑。根據一個實施方式，在表示“增加”或“增強”抗炎細胞因子(例如，IL-10、IL-4、和IL-6中的任何一種，尤其是IL-10)的表達或水平時，其意思是，此類增加或增強可以是此類細胞因子的表達增加或提高約10% 100%的。本文所用的術語“增加”、“增大”和“增強”涉及在尺寸、量、數目或強度上逐漸變大的過程。特別是指，與適當的對照相比，表達增加 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或100%。還應當注意的是，上述增加或上升還可以是約2 100倍的增加。此外，應認識到的是，所述IL-10細胞因子的水平或表達的升高可以是在所述細胞因子的轉錄、翻譯或穩定性上。對此，應理解的是，在被提到時，諸如10%、50%、120%、500%等百分比值可以分別與0. 1、0. 5、I. 2、5等“倍數變化”值互換使用。如上文指出的，增強的IL-10表達可以將Thl/Th2平衡向Th2抗炎應答方向調節。因此，本發明的抗體可用于需要將Thl/Th2平衡向抗炎應答方向調節的病況。因此，根據一個實施方式，可以將本發明的組合物用于增加有需要的受試對象的IL-10的表達和水平，從而將接受治療的受試對象的Thl/Th2細胞平衡向抗炎Th2應答方向調節。根據一個具體實施方式
，受試對象是患有免疫相關病癥的受試對象。例如，諸如自身免疫疾病(例如關節炎、IBD、銀屑病，I型和II型糖尿病、多發性硬化(MS)、狼瘡、格雷夫斯病和甲狀腺炎)、移植排斥病理學及移植物抗宿主病、超抗原誘導的病癥(例如中毒性休克、敗血病性休克和嚴重敗血病)等免疫相關病癥。還應當認識到的是，通常，本發明的組合物以及方法、聯合組合物和試劑盒可以用于預防、治療、改善或抑制任何自身免疫疾病，例如但不限于肌無力綜合征、古德帕斯丘綜合征、格雷夫斯病、格-巴二氏綜合征、自身免疫性溶血性貧血(AIHA)、肝炎、胰島素依賴性糖尿病(IDDM)及NIDDM、系統性紅斑狼瘡(SLE)、多發性硬化(MS)、重癥肌無力、叢病癥(例如，急性臂神經炎)、多腺性缺乏綜合征、原發性膽汁性肝硬化、類風濕性關節炎、硬皮病、血小板減少、甲狀腺炎(例如橋本病)、干燥綜合征、過敏性紫癜、銀屑病、混合性結締組織病、多肌炎、皮膚肌炎、血管炎、結節性多動脈炎、風濕性多肌痛、韋格納肉芽腫病、萊特爾氏綜合征、Behget氏綜合征、強直性脊柱炎、天皰瘡、大皰性類天皰瘡、皰疹樣皮炎、炎性腸病、潰瘍性結腸炎及克羅恩氏病和脂肪肝病。包含本發明的人源化抗體的藥物組合物可用于胃腸外施用，S卩，腹膜內(i. p.)、皮下(s. C.)、肌肉內(i.m.)和靜脈內(i.v.)施用以及口服和局部應用。用于胃腸外施用的組合物通常包含將溶解于可接受的載劑(優選水性載劑)中的抗體或其混合物的溶液。可以使用多種水性載劑，例如水、經緩沖的水、0. 4%的鹽水和0. 3%的甘氨酸等。這些溶液是無菌的，并且通常不含顆粒物。該組合物可以包含藥學上可接受的、接近生理條件所需的輔助物質，例如PH調節與緩沖劑和毒性調節劑等，如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉。人源化抗體在這些制劑中的濃度可以大幅度變化，即，從小于約0. 01重量％、通常從小于約0. I重量％至幾乎5重量％，且將主要根據所選的特定施用模式基于流體體積和粘度來選擇該濃度。更具體而言，可以將包含本發明的抗肽-6人源化抗體的可注射組合物制備到水、鹽水、等滲鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水和檸檬酸鹽緩沖鹽水等中，并可以可選地與無毒的表面活性劑混合。在普通的儲藏和使用條件下，這些制備物可以包含防腐劑，以防止微生物生長。適合于注射或輸注的藥物劑型包括含有活性成分的無菌水性溶液或分散液或者無菌粉末，所述粉末適合于即席制備可注射或可輸注的無菌溶液或分散液。優選的是，最終劑型是無菌流體，并且在制造和儲藏條件下穩定。該溶液、懸浮液或分散液的液體載劑或載質可以是溶劑或液體分散介質，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇或液體聚乙二醇等)、 植物油、無毒甘油酯和其適合的混合物。通過下述方式可以保持溶液、懸浮液或分散液的正常流動性，例如，通過形成脂質體，通過保持所需的粒徑(對于分散體的情況)，或通過使用無毒的表面活性劑。使用各種抗細菌劑和抗真菌劑(例如，對羥基本甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸和硫汞撒等)可以實現預防微生物的作用。可以包含等滲試劑，例如糖、緩沖劑或氯化鈉。通過在組合物中加入推遲吸收的藥劑，例如一硬脂酸鋁水凝膠和明膠，可以延長對可注射組合物的吸收。可以添加溶解度增強劑。可以通過下述方式來制備無菌的可注射組合物將抗肽-6人源化抗體按所需的量與各種其他成分(例如，上文所列舉的)添加在適合的溶劑中，隨后必要時通過例如過濾滅菌來進行滅菌。對于用來制備無菌可注射溶液的無菌粉末，制備方法包括真空干燥和冷凍-干燥技術，該方法可產生活性成分的粉末以及存在于之前無菌過濾過的溶液中的任何其他所需成分。可以采用任何適合的滅菌方法，例如過濾滅菌(如，0. 22微米濾膜或納米過濾)、Y射線或電子束滅菌。在各種實施方式中，將最終溶液的pH調節至約4 約9、約5 約7、約5. 5 約6. 5或約6。可以用藥理學上可接受的酸、堿或緩沖劑來調節組合物的pH。此外，本發明的組合物可以以每劑量包含預定量的各活性成分的單位劑型存在。可以將這種單位調整為可提供0. I 100mg/kg體重的本發明的人源化抗體。具體而言，可以是 0. I 10mg/Kg、5 15mg/Kg、10 30mg/Kg、25 50mg/Kg、40 80mg/Kg 或 60 100mg/Kg。更具體而言，所述有效劑量為約0. 01 約100mg/Kg人源化抗體、約0. I 約90mg/Kg、約 0. 3 約 8mg/Kg、約 0. 4 約 70mg/Kg、約 0. 5 約 60mg/Kg、約 0. 7 約 50mg/Kg、約0. 8 約40mg/Kg、約0. 9 約30mg/Kg、約I 約20mg/Kg、特別是約I 約10mg/Kg。可以將這些劑量提供為單劑量形式或多個不連續劑量。當然，最終劑量將依賴于受治療的病況、施用途徑以及患者的年齡、重量和狀況，并且將由醫生決定。如上文指出的，除了胃腸外途徑外，本發明的組合物可以經改造而適用于任何其他適當途徑的施用，例如口服(包括口腔和舌下)、直腸、鼻部、局部(包括口腔、舌下或經皮)或陰道途徑。可以通過制藥領域中的任何已知方法來制備此類制劑，例如通過使活性成分與一種或多種載劑或賦形劑結合。經改造適合用于口服施用的藥物制劑可以呈現為不連續的單位，例如膠囊或片齊U，粉末或顆粒，在水性液體或非水性液體中的溶液或懸浮液，可食用的泡沫或攪打泡沫(whips),或者水包油液體乳劑或油包水液體乳劑。經改造適合用于經皮施用的藥物制劑可以呈現為不連續的貼片，該貼片意在使其與接受者的表皮保持長時間的緊密接觸。可以將經改造適合用于局部施用的藥物制劑配制成軟膏、乳膏、懸浮液、洗劑、粉末、溶液、糊劑、凝膠、噴霧劑、氣溶膠或油劑。對于向眼或其他外部組織(例如口和皮膚)的敷用而言，制劑優選以局部軟膏或乳膏敷用。當配制成軟膏形式時，可以將活性成分與石蠟或水可混溶的軟膏基底一起使用。 另一選擇為，可以將活性成分與水包油乳膏基底或油包水基底一起配制到乳膏中。經改造適合于局部施用至眼部的藥物制劑包括滴眼劑，其中活性成分溶解或懸浮在適合的載劑尤其是水性溶劑中。經改造適合于局部施用至口中的藥物制劑包括錠劑、軟錠劑和漱口劑。具體的實施方式包括通過向受影響的皮膚區域局部施用包含本發明的人源化抗體的軟膏、乳膏、懸浮液、糊劑、洗劑、粉末、溶液、油劑、包封的凝膠、脂質體，包含所述抗體的任何納米顆粒，或包含所述抗體的可噴霧氣溶膠或蒸氣，來治療皮膚炎癥病況(特別是銀屑病)。常規的藥物載劑，水性基底、粉末基底或油性基底，以及增稠劑等，可以是必要的或理想的。術語“局部敷用”或“局部施用”意思是將軟膏、乳膏、軟化劑、香脂、洗劑、溶液、油膏劑、軟藥(unguent)或任何其他藥物形式敷用到患者皮膚的受到或已受到一種或多種銀屑病癥狀影響的區域或者顯示或已顯示一種或多種銀屑病癥狀的區域的一部分或全部上。在優選實施方式中，用于治療皮膚病癥(特別是銀屑病)的本發明的人源化抗體是通過局部敷裹物來施用的。術語“敷裹物”的意思是用于傷口或外科手術部位的覆蓋物，通常是由布、織物、合成膜或紗布等構成。其通常是覆蓋皮膚區域的含聚合物的基質。該敷裹物可以與或不與皮膚緊密接觸。其可以是例如布或紗布，或可以是涂抹或噴在皮膚上的聚合物溶液，其中所述聚合物在溶劑變干后和/或在聚合物交聯后在皮膚上發生固化。敷裹物還包括凝膠，通常是交聯的水凝膠，其主要設計用來覆蓋和保護傷口和外科手術部位
坐寸o經改造適合用于直腸施用的藥物制劑可以呈現為栓劑或灌腸劑。經改造適合用于鼻部施用的、其中載劑為固體的藥物制劑包括粒徑為例如20 500微米的粗粉末，該粗粉末的施用是以吸入嗅劑的方式，即從舉到鼻下近距離處的該粉末的容器中通過鼻道快速吸入的方式。作為鼻噴霧劑或滴鼻劑施用的、其中載劑為液體的適合制劑包括活性成分的水性溶液或油性溶液。經改造適合用于通過吸入施用的藥物制劑包括細粒粉塵或薄霧，可以通過使用各種類型的定量的加壓氣溶膠、霧化器或吹入器來產生所述細粒粉塵或薄霧。經改造適合用于陰道施用的藥物制劑可以呈現為陰道栓、塞、乳膏、凝膠、糊劑、泡沫或噴霧制劑。
優選的單位劑量制劑是包含上文所述的每日、每周兩次、每周、每幾周或每月劑量或子劑量或者其適合的部分劑量的活性成分的那些制劑。應指明的是，尤其在IBD中，還存在以下情況最初給予較大的推注劑量，隨后減小該劑量用于后續治療。應理解的是，除了上文特別提到的成分以外，所述制劑還可以包含與所討論的制齊幞型有關的領域中常見的其他試劑，例如，適合于口服施用的那些制劑可以包含調味劑。本發明的另一方面提供用于預防、治療、改善或抑制免疫相關病癥的方法。本發明的方法包括向有需要的受試對象施用治療有效量的特異性地結合含有SEQ IDNO: 15的多肽的至少一種分離且純化的人源化抗體或含有所述抗體的組合物。根據一個實施方式，本發明的方法所用的人源化抗體包含(a)重鏈可變區，所述重鏈可變區包含位于H22位的Cys、位于H23位的Ser、位于H26位的Gly、位于H27位的Phe、位于H28位的Ser、位于H29位的Leu、位于H30位的Ser、位于H31位的Thr、位于H32位的Ser、位于H33位的Asn、位于H34位的Met、位于H35位的 Gly、位于H35A位的Val、位于H35B位的Gly、位于H48位的Leu、位于H50位的His、位于H51位的He、位于H52位的Leu、位于H53位的Trp、位于H54位的Asn、位于H55位的Asp、位于H56位的Ser、位于H57位的Lys、位于H58位的Tyr、位于H59位的Tyr、位于H60位的Asn、位于H61位的Pro、位于H62位的Ala、位于H63位的Leu、位于H64位的Lys、位于H65位的Ser、位于H92位的Cys、位于H95位的Met、位于H96位的Gly、位于H97位的Gly、位于H98位的Tyr、位于H99位的Tyr、位于HlOO位的Gly、位于H100A位的Asn、位于H100B位的Tyr、位于H100C位的Gly、位于H100D位的Tyr、位于H100E位的Tyr、位于H100F位的Ala、位于H100G位的Met、位于HlOl位的Asp和位于H102位的Tyr，且可選地包含位于H49位的Leu、位于H74位的Tyr、位于Hll位的lie、位于H41位的Ser和位于H108位的Ser中的至少一個；和(b)輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含位于LI位的Gin、位于L23位的Cys、位于L24位的Thr、位于L25位的Ala、位于L26位的Ser、位于L27位的Ser、位于L27A位的Ser、位于L28位的Val、位于L29位的Ser、位于L30位的Ser、位于L31位的Ser、位于L32位的Tyr、位于L33位的Leu、位于L34位的His、位于L47位的Trp、位于L50位的Ser、位于L51位的Thr、位于L52位的Ser、位于L53位的Asn、位于L54位的Leu、位于L55位的Ala、位于L56位的Ser、位于L71位的Tyr、位于L88位的Cys、位于L89位的His、位于L90位的Gin、位于L91位的Tyr、位于L92位的His、位于L93位的Arg、位于L94位的Ser、位于L95位的Pro、位于L96位的Pro和位于L97位的Thr，且可選地包含位于L21位的Met、位于LlO位的Ile和位于L80位的Ala中的至少一個(位置是根據Kabat編號系統確定的)。根據一個實施方式，如本發明所述，本發明的方法可以使用本發明的人源化抗體中的任何一種或包含所述抗體的任何組合物。一個特定實施方式涉及具有重鏈可變區SEQID NO:21和輕鏈可變區SEQ ID NO:26的至少一種人源化抗體(VH2/VK3)的應用。根據一個實施方式，本發明的方法可以特別適用于預防、治療、改善或抑制諸如自身免疫病或炎性病癥等免疫相關病癥。根據一個具體實施方式
，本發明的方法特別適用于治療炎性關節炎。根據另一個實施方式，可以將本發明的方法用于治療炎性腸病(IBD)。根據另一個實施方式，可以將本發明的方法用于治療銀屑病。
在又一個實施方式中，可以將本發明的方法用于治療自身免疫病，例如糖尿病。在又一個實施方式中，可以將本發明的方法用于治療MS(多發性硬化)。在本說明書和以下的實施例部分中，本文所用的術語“治療”及其各種衍生形式涵蓋實質上抑制、延緩或逆轉病況的進展，實質上改善病況的臨床癥狀，或實質上預防病況的臨床癥狀的出現。本文所用的術語“疾病”、“病癥”和“病況”等在它們涉及受試對象的健康時可以互換使用，并且其意義可指每個和全部這些術語。本文所用的“受試對象”是指出于治療或研究目的被施用了藥劑(例如抗體)的哺乳動物。哺乳動物包括小鼠、大鼠、貓、豚鼠、倉鼠、狗、猴、黑猩猩和人。本發明還涵蓋了本發明的抗體在治療與上述病況有關的任何病況中的應用。應理解的是，可互換使用的術語“相關的”和“有關的”在本文中描述病理時是指具有相同的起因 和/或以高于巧合的頻率共存的疾病、病癥、病況或任何病理，或者指在至少一種疾病、病癥、病況或病理引起第二疾病、病癥、病況或病理的情況下的疾病、病癥、病況或任何病理。對于關節炎來說，此類相關的或有關的病況可以包括例如所有類型的原發性關節炎，例如類風濕性關節炎、膿毒性關節炎、銀屑病關節炎、反應性關節炎(ReA)、強直性脊柱炎(舊稱別赫捷列夫氏病、別赫捷列夫綜合征)、幼年特發性關節炎(JIA)和痛風(代謝性關節炎)。除了所述的所有原發性形式的關節炎外，本發明所治療的病況可以包括所有繼發性形式的關節炎，例如紅斑狼瘡、過敏性紫癜(Henoch- Schdnlein purpura)、血色病、肝炎、韋格納肉芽腫病(及很多其他血管炎綜合征)、萊姆病、家族性地中海熱、帶有回歸熱的高免疫球蛋白血癥D、TNF受體相關的周期性綜合征和炎性腸病(包括克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎)。對于IBD來說，此類相關的或有關的病況可以包括例如克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、膠原性結腸炎、淋巴細胞性結腸炎、缺血性結腸炎、改道性結腸炎、白塞氏白塞氏綜合征和未定型結腸炎。對于銀屑病來說，此類相關的或有關的病況可以包括例如銀屑病關節炎、尋常型天皰瘡、大皰性類天皰瘡、皮肌炎、瘢痕性類天皰瘡、CREST綜合征、狼瘡、盤狀狼瘡和白癜風。對于糖尿病來說，此類相關的或有關的病況可以包括例如與眼有關的并發癥(白內障、青光眼、視網膜病變)、神經病、腎病變、心肌病、中風、高血壓、外周動脈病和瘡。本發明的另一方面提供增加有需要的受試對象中的IL-10的表達和水平的方法，該方法包括以下步驟向所述受試對象施用治療有效量的特異性地結合含有SEQ IDNO: 15的多肽的至少一種分離且純化的人源化抗體或含有所述抗體的組合物。根據一個實施方式，可以將本發明的任何人源化抗體用于所述方法。根據一個實施方式，增加IL-10的表達和水平會將受治療的患有免疫相關病癥的受試對象的Thl/Th2細胞平衡向抗炎的Th2應答方向調節。還應注意的是，本發明提供本文所述的人源化抗體(尤其是VH2/VK3變體)在制備用于預防、治療、改善或抑制免疫相關病癥的組合物中的應用。本發明展示了新型人源化抗肽-6抗體作為適用于治療免疫相關病癥的免疫調節劑的應用。還應該了解的是，所述抗體的有益免疫調節效果可以通過將其與其他已知的抗炎劑結合來增強。因此，本發明還提供本發明的抗體與任何治療劑(尤其是抗炎劑)的任何組合或混合。因此，根據某些實施方式，本發明提供治療有效量的由至少一種分離且純化的人源化抗體或其任何抗原結合片段與至少一種抗炎劑組成的組合的應用，所述抗炎劑選自由以下物質組成的組甲基強的松(MPS)、抗TNF劑、依那西普(Enbrel)、英夫利昔單抗(Remicade)、阿達木單抗(Humira)和賽妥珠單抗(Cimzia)、抗IL-6劑、托珠單抗(Actemra)、抗 IL-I 受體劑、kineret (阿那白滯素)、CTLA-4-Ig、阿巴西普(Orencia)、抗⑶20劑、利妥昔單抗(MabThera;Rituxan)、氨甲喋呤、任何皮質類固醇衍生物和用于治療、預防、改善、減輕或推遲免疫相關病癥的任何其他抗炎劑。應注意的是，此類附加抗炎劑可以是通過任何途徑(除了抗肽-6抗體所包 括的涉及誘導IL-10的途徑的機制以外)來誘導抗炎應答的試劑。因此，本發明特別涉及至少一種分離且純化的人源化抗體或其任何抗原結合片段與至少一種抗炎劑的加成性組合和協同性組合，所述抗炎劑選自由以下物質組成的組甲基強的松(MPS)、抗TNF劑、依那西普(Enbrel)、英夫利昔單抗(Remicade)、阿達木單抗(Humira)和賽妥珠單抗(certolizumab pegol) (Cimzia)、抗 IL-6 劑、托珠單抗(Actemra)、抗IL-I受體劑、kineret (阿那白滯素)、CTLA_4_Ig、阿巴西普(Orencia)、抗CD20劑、利妥昔單抗(MabThera;Rituxan)、氨甲喋呤、任何皮質類固醇衍生物和誘導不同于抗肽_6途徑的任何信號傳導途徑的任何抗炎劑，由此這些加成性組合和協同性組合可用于治療患有免疫相關病癥(例如，關節炎、IBD、銀屑病或糖尿病)的受試對象。本發明的加成性和協同性組合還可以用于治療呈現出此類病癥的癥狀或體征的受試對象。協同性組合的意思是，所述分離且純化的人源化抗體或其任何抗原結合片段與至少一種選自由甲基強的松(MPS)、抗TNF劑、依那西普(Enbrel)、英夫利昔單抗(Remicade)、阿達木單抗(Humira)和賽妥珠單抗(Cimzia)、抗IL-6劑、托珠單抗(Actemra)、抗IL-1受體劑、kineret (阿那白滯素)、CTLA-4-Ig、阿巴西普(Orencia)、抗CD20劑、利妥昔單抗(MabThera; Rituxan)、氨甲喋呤、任何皮質類固醇衍生物和任何其他抗炎劑組成的組的抗炎劑的組合效果大于將這些化合物中的任一種作為唯一療法單獨施用的治療效果的總和。更具體而言，額外的抗炎劑可以誘導與抗肽-6抗體所誘導的途徑(例如，參與IL-10誘導的任何途徑)不同的途徑。本發明的聯用化合物(combined compound)通常以包含本發明的上述兩種化合物以及藥學上可接受的載劑或稀釋劑的藥物組合物形式來施用。然而，根據一些實施方式，這兩種化合物可以單獨施用。因此，本發明所用的化合物可以以試劑盒形式單獨施用，或者以任何常規的口服或粘膜劑型一起施用。更特別而言，由于本發明涉及用可以單獨施用的活性成分的組合來治療疾病和病況，因此本發明的另一方面還涉及將單獨的藥物組合物以試劑盒形式組合到一起。所述試劑盒包含至少兩種單獨的藥物組合物(i)分離且純化的人源化抗體或其任何抗原結合片段，特別是任何一種本發明的人源化抗體，其可選地為第一劑型；和(ii)至少一種抗炎劑，所述抗炎劑選自由甲基強的松(MPS)、抗TNF劑、依那西普(Enbrel)、英夫利昔單抗(Remicade)、阿達木單抗(Humira)和賽妥珠單抗(Cimzia)、抗IL-6劑、托珠單抗(Actemra)、抗 IL-I 受體劑、kineret (阿那白滯素)、CTLA-4-Ig、阿巴西普(Orencia)、抗CD20劑、利妥昔單抗(MabThera;Rituxan)、氨甲喋呤、任何皮質類固醇衍生物和誘導不同于抗肽-6途徑的任何其他途徑的任何抗炎劑組成的組，其可選地為第二劑型。本發明的試劑盒還可以包含(iii)用于容納所述第一劑型和第二劑型的容器。更具體而言，所述試劑盒包含用于同時容納兩種單獨的組合物的容器，例如分隔型瓶(divided bottle)或分隔型箔材包(foil packet)。然而,還可以將單獨的組合物容納在單一的未分隔的容器中。通常，所述試劑盒包含用于施用所述單獨的組合物的說明書。在單獨的成分優選以不同的劑型(例如，胃腸外)施用、以不同的劑量間隔施用時，或者在開處方的醫師需要對組合中的單個成分進行滴定時，試劑盒形式具有特別的優勢。取得療效是指，例如，在試劑盒是旨在用于治療特定病癥的情況下，療效可以是例如延緩被治療的病況的進展。應了解的是，可以同時施用試劑盒的全部兩種成分，即分離且純化的本發明的人源化抗體，其可選地為第一劑型；和至少一種抗炎劑，所述抗炎劑選自由以下物質組成的組甲基強的松(MPS)、抗TNF劑、依那西普(Enbrel)、英夫利昔單抗(Remicade)、阿達 木單抗(Humira)和賽妥珠單抗(Cimzia)、抗IL-6劑、托珠單抗(Actemra)、抗IL-1受體劑、kineret (阿那白滯素)、CTLA-4-Ig、阿巴西普(Orencia)、抗CD20劑、利妥昔單抗(MabThera;Rituxan)、氨甲喋呤、任何皮質類固醇衍生物和誘導不同于抗肽_6途徑的任何其他途徑的任何抗炎劑，其可選地為第二劑型。作為另一選擇，所述第一化合物或第一劑型和所述第二化合物或第二劑型以任意順序依次施用。可以施用包含該人源化抗體或其任何組合、混合物或混合劑的組合物以用于預防性和/或治療性治療。在治療性應用中，向已經患有免疫相關病癥(例如，關節炎、IBD、銀屑病、MS和糖尿病)的患者施用足以治愈或至少部分遏制該病況及其并發癥的量的組合物。將足以實現此效果的量定義為“治療有效劑量”。對此用途有效的量將取決于病況的嚴重程度和患者自身免疫系統的整體狀況，但通常為每劑量約0. 01mg/kg 約100mg/kg的人源化抗體，而0. I 50mg/kg體重和I 10mg/kg體重的劑量則更為常用。更具體而言，所述有效劑量為約0. 01 約100mg/Kg人源化抗體、約0. I 約90mg/Kg、約0. 3 約8mg/Kg、約 0. 4 約 70mg/Kg、約 0. 5 約 60mg/Kg、約 0. 7 約 50mg/Kg、約 0. 8 約 40mg/Kg、約0. 9 約30mg/Kg、約I 約20mg/Kg、特別是約I 約10mg/Kg。用治療醫師所選定的劑量水平和模式，可以依計劃在每日、每周兩次、每周、每幾周或每月進行單次或多次施用。在預防性應用中，向有發展疾病狀況風險的患者施用包含人源化抗體或其任何組合、混合物或混合劑的組合物以增強該患者的抵抗力。將這種量定義為“預防有效劑量”。在此應用中，精確的量同樣取決于患者的健康狀況和免疫力的整體水平，但通常為0. I IOOmg/劑量，特別是I 10mg/kg體重。更具體而言，所述有效劑量為約0. 01 約IOOmg/Kg人源化抗體、約0. I 約90mg/Kg、約0. 3 約8mg/Kg、約0. 4 約70mg/Kg、約0. 5 約60mg/Kg、約 0. 7 約 50mg/Kg、約 0. 8 約 40mg/Kg、約 0. 9 約 30mg/Kg、約 I 約 20mg/Kg、特別是約I 約10mg/Kg。根據患者所需和所能耐受的劑量和頻率來進行組合物的單次或多次施用。在任何情況下，組合物都應當提供充足量的本發明的人源化抗體，來有效地治療患者。優選的是，期望單次施用，其中劑量僅施用一次。然而，在多數情況下，周期性地施用劑量，直到實現治療并將維持療效，或直到副作用有必要使治療中止。通常，該劑量足以治療或改善疾病的癥狀或體征且不對患者產生不可接受的毒性。可以將本發明的免疫偶聯物組合物的控釋型胃腸外制劑制成植入物、油性注射物或微粒系統。微粒系統包括微球體、微顆粒、微膠囊、納米膠囊、納米球體和納米顆粒。微膠囊包含治療蛋白來作為中心核。在微球體中，治療物分散在整個顆粒中。小于約Ium的顆粒、微球體和微膠囊通常分別稱作納米顆粒、納米球體和納米膠囊。毛細血管的直徑為約5 u m,因此僅靜脈內施用納米顆粒。微顆粒的直徑通常為約100 ym，并且對其進行皮下施用或肌肉內施用。可以將聚合物用于本發明的人源化抗肽-6抗體組合物的離子控釋。用于控制型藥物遞送的各種可降解的和不可降解的聚合物基質在本領域中是已知的。在另一個實施方式中，使用脂質體來實現脂質所包裹的藥物的控釋和藥物靶向作 用。本發明的另一方面涉及用編碼本發明的人源化抗體的表達載體轉化或轉染的宿主細胞系。在一個特定實施方式中，該表達載體編碼了重鏈可變區鏈和輕鏈可變區鏈。在某些實施方式中，所述細胞系表達具有包含SEQ ID NO:21所表示的氨基酸序列的重鏈可變區和包含SEQ ID NO:26所表示的氨基酸序列的輕鏈可變區的人源化抗體。在一個特定實施方式中，本發明的細胞系在實施例23 26中有所描述，并且保藏號為 CNCM 1-4356。本文所用的“宿主細胞”是指能夠被用重組DNA技術構建的載體重組轉化的細胞。藥物抗性或其他可選擇的標志物的部分目的是促進對轉化體的選擇。此外，選擇性標志物(例如藥物抗性標志物)的存在可以用于防止污染性微生物在培養基中倍增。通過在需要所誘導的表型才能存活的條件下培養細胞，將獲得上述經轉化的宿主細胞的純培養物。“細胞”、“宿主細胞”或“重組細胞”在本文中是可以互換使用的術語。應理解的是，這些術語不僅指特定的受試對象細胞，也指此類細胞的后代或潛在后代。由于在傳代中因突變或環境影響可能出現一些修飾，因此，所述后代實際上可能與親代細胞不完全一樣，但是仍將其包含在本文所用的該術語的范圍內。本文所用的術語“轉染”是指，通過由核酸介導的基因轉移，將核酸(例如表達載體)導入受體細胞中。本文所用的“轉化”是指下述過程其中，由于細胞攝取了外源DNA或RNA，細胞的基因型發生了變化。本發明還提供用于表達人源化抗體的表達載體，所述人源化抗體同時具有包含SEQ ID NO:21所表示的氨基酸序列的重鏈可變區和包含SEQ ID NO:26所表示的氨基酸序列的輕鏈可變區。在具體實施方式
中，本發明提供用于表達人源化重鏈可變區的表達載體，所述人源化重鏈可變區包含SEQ ID NO:21所表示的氨基酸序列。此類載體的實例是圖2和實施例2所示的pANTVhGl/4載體。在其他實施方式中，本發明提供用于表達人源化輕鏈可變區的表達載體，所述人源化輕鏈可變區包含SEQ ID NO:26所表示的氨基酸序列。此類載體的實例是圖2和實施例2所示的pANTVK載體。最優選的是，本發明提供用于表達人源化抗體的表達載體，所述人源化抗體同時具有包含SEQ ID NO: 21所表示的氨基酸序列的重鏈可變區和包含SEQ ID NO: 26所表示的氨基酸序列的輕鏈可變區。此類載體的實例是圖26和實施例22所示的pPR014載體。—個特別優選的表達載體可以是圖26所示的哺乳動物表達質粒pPR014。其他優選的表達載體是圖2所示的哺乳動物表達載體pANTVK和pANTVhGl/4。表達載體通常是自我復制的DNA或RNA構建體，其包含所需的基因或其片段以及可操作性地連接的遺傳控制元件，這些遺傳控制元件在適合的宿主細胞中得到識別并實現所需基因的表達。這些控制元件能夠在適合的宿主內實現表達。通常，遺傳控制元件可以包含原核生物啟動子系統或真核生物啟動子表達控制系統。這通常包括轉錄啟動子，用來控制轉錄起始的可選的操縱基因，用來提高RNA表達水平的轉錄增強子，編碼適合的核糖體結合位點的序列，RNA剪接點，以及使轉錄和翻譯終止的序列，等等。表達載體通常包含復制起點，復制起點允許載體不依賴宿主細胞而進行復制。載體還可以包含適當的限制性位點、抗生素抗性標志物或用于選擇含載體細胞的、其他標志物基因。質粒是最常用的載體形式，但是具有同等功能且在本領域中已知或正在被知曉的其他載體形式也適合在本發明中使用。參見例如Pouwels等,Cloning Vectors:aLaboratory Manual (1985 及補充資料)，Elsevier, N. Y.;和 Rodriquez 等(編)Vectors:aSurvey of Molecular Cloning Vectors and their Uses, Buttersworth, Boston, Mass(1988)，并通過引用將它們并入本文。應注意的是，本發明還涵蓋SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11所編碼的嵌合抗肽-6抗體。這些抗體具有重鏈可變區SEQ ID NO: I和輕鏈可變區SEQ IDN0:2。應注意的是，這些抗體攜帶小鼠可變區和人恒定區，并且還被稱為參照抗體或親本抗體。根據某些實施方式，本發明的小鼠抗肽-6抗體、嵌合抗體或人源化抗體包含本文所述的重鏈可變區和輕鏈可變區，條件是所述抗體與美國專利第7，488，476號中的名為MF9的鼠單克隆抗體不同即可。可以使用本領域中已知的重組DNA技術來制造嵌合抗體。例如，用限制性酶消化編碼鼠類(或其他物種)單克隆抗體分子的Fe恒定區的基因，從而除去編碼鼠Fe的區域，并且用編碼人Fe恒定區的基因的等效部分進行置換。因此，根據另一方面，本發明提供特異性地結合包含SEQ ID NO: 15的多肽的嵌合鼠類單克隆抗體，其中，所述抗體包含人免疫球蛋白恒定區和鼠免疫球蛋白可變區，所述可變區包含具有SEQ ID NO: 2所表示的氨基酸序列的輕鏈可變區，和具有SEQID NO: I所表示的氨基酸序列的重鏈可變區。根據一些實施方式，本發明提供包含有效量的至少一種分離且純化的本發明的嵌合單克隆抗體作為活性成分的組合物，所述嵌合單克隆抗體特異性地結合含有SEQIDNO: 15的多肽。根據更具體的實施方式，本發明提供用于治療、預防、改善或推遲免疫相關病癥的發作的藥物組合物，其中，所述組合物包含治療有效量的至少一種分離且純化的本發明的嵌合單克隆抗體作為活性成分，所述嵌合單克隆抗體特異性地結合含有SEQID NO: 15的多肽。本發明還涵蓋用于治療、預防、改善或推遲免疫相關病癥的發作的方法，所述方法包括向有需要的受試對象施用治療有效量的至少一種分離且純化的本發明的嵌合單克隆抗體的步驟，所述嵌合單克隆抗體特異性地結合含有SEQ ID NO: 15的多肽。根據其他實施方式，本發明提供聯合組合物，所述聯合組合物包含特異性地結合含有SEQ ID NO: 15的多肽的至少一種分離且純化的本發明的嵌合單克隆抗體；和至少一種抗炎劑，所述抗炎劑選自由以下物質組成的組甲基強的松(MPS)、抗TNF劑、依那西普(Enbrel)、英夫利昔單抗(Remicade)、阿達木單抗(Humira)和賽妥珠單抗(Cimzia)、抗IL-6劑、托珠單抗(Actemra)、抗IL-1受體劑、kineret (阿那白滯素)、CTLA-4-Ig、阿巴西普(Orencia)、抗CD20劑、利妥昔單抗(MabThera;Rituxan)、氨甲喋呤、任何皮質類固醇衍生物和誘導任何信號傳導途徑(特別是不同于抗肽-6所誘導的途徑(例如，參與IL-10誘導的任何途徑)的途徑)的任何抗炎劑。根據特定實施方式，本發明涉及治療有效量的至少一種分離且純化的本發明的嵌合單克隆抗體在制備用于治療、預防、推遲發作或改善免疫相關病癥的組合物中的應用，所述嵌合單克隆抗體特異性地結合含有SEQ ID NO: 15的多肽。此外，本發明提供本文所述的嵌合抗體在試劑盒以及診斷應用中的用途。 本發明人之前證明了類風濕性關節炎患者的血清抗肽-6抗體滴度顯著低于健康受試對象。因此，發明人設想了血清抗肽-6作為類風濕性關節炎(或實際上一般為炎性病癥)標志物的應用。因此，在另一方面，本發明提供用于檢測和監視哺乳動物受試對象的免疫病癥(尤其是免疫相關病癥，包括涉及抗炎細胞因子表達特別是IL-10表達的下降的那些病癥)的診斷試劑盒和方法。此類免疫相關病癥包括關節炎、IBD(例如，克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎)、銀屑病、糖尿病和MS。更具體而言，本發明提供的診斷方法和試劑盒使用被測生物樣品中的抗肽-6抗體水平來作為免疫相關病癥的標志。被測樣品中的抗肽-6抗體水平相對于健康對照中的水平的下降表明該樣品屬于患有免疫相關病癥的受試對象。應了解的是，通過鑒定出患有特定炎性疾病且可能從人源化抗肽-6抗體治療中獲益的受試對象，本發明的診斷試劑盒和方法還提供了實現“定制”療法或個人針對性療法的工具。應了解的是，本發明提供的診斷方法和試劑盒構成競爭性抗體結合測定，其中，包含在目的樣品(具體為血清樣品)中的抗肽-6抗體的量是通過以下方式確定的將所述樣品與已知量的分離且純化的肽-6溫育，隨后將同一肽6與已知量的本發明的人源化抗肽-6抗體溫育，其中所述人源化抗肽-6抗體可選地標記有可檢測部分或標記。因此，所述目的樣品中的抗肽-6抗體的量與結合有肽-6的帶標記的抗肽-6抗體的減少成比例。根據一個實施方式，本發明提供用于檢測或監視哺乳動物受試對象的免疫病癥的診斷方法，其中所述免疫病癥可能對人源化抗肽-6抗體治療有應答性，所述方法包括下述步驟(a)使被測樣品與預定量的分離的肽_6(SEQ ID NO: 15)在使得所述肽可以與抗肽-6抗體結合的適合條件下接觸；(b)向(a)中的樣品-肽6混合物中添加預定量的本發明的人源化抗肽-6抗體，其中所述人源化抗肽-6抗體可選地標記有可檢測標記。應了解的是，步驟(a)和步驟(b)可以依次執行或同時執行；(C)用適合的手段確定在所述樣品中所述人源化抗肽-6抗體與肽-6的結合；由于所述樣品中的抗肽-6抗體與本發明的人源化抗肽-6抗體競爭與肽-6的結合，所述樣品中的抗肽-6抗體對所述人源化抗肽-6抗體的替換(displacement)由肽_6與人源化抗體的結合的減少反映；(d)從標準曲線外推來估算出被測樣品中的抗肽-6抗體的量，其中所述標準曲線是通過用抗肽-6抗體的梯度稀釋液替換肽-6與帶標記的本發明的人源化抗體的梯度稀釋液而建立的。被測樣品中的抗肽-6抗體的減少的量表明該樣品屬于患有免疫相關病癥且可能從使用人源化抗肽-6抗體進行治療中獲益的受試對象。根據一個具體實施方式
，將樣品與預定量的附著在固相載體上的分離的肽-6溫育，隨后添加預定量的標記有可檢測標記的本發明的人源化抗肽-6抗體。本說明書和權利要求書中的術語“樣品”的含義包括生物樣品。生物樣品可以從哺乳動物(特別是人)受試對象獲得，包括流體、固體(例如，糞便)或組織。術語“樣品”還可以包括體液,例如血清、尿、血液、乳、腦脊髓液、從清洗體腔獲得的清洗液、痰、膿。可以使一些事先不是液體的樣品與緩沖液體接觸，隨后按本發明的診斷方法使用。生物樣品可以從所有的各種家畜科和未馴服動物或野生動物獲得，包括但不限于有蹄類動物，熊，魚，兔形目動物，嚙齒類動物，等等。優選的是，該樣品是液體，特別是體 液樣品，最優選為源自哺乳動物特別是人的血清樣品。本發明還提供用于檢測和監視哺乳動物受試對象的免疫病癥的試劑盒。本發明的試劑盒還可以提供關于受檢查患者對用本發明的抗肽-6抗體進行的治療作出應答的潛在應答性的信息。本發明的試劑盒可以包含(a)用于從被測受試對象獲取生物樣品的器件(means) ； (b)標記有可檢測部分的人源化抗肽_6抗體；(c)分離的肽_6，可選地附著在固相載體上；(d)用于檢測帶標記的人源化抗肽-6抗體與附著在固相載體上的肽-6之間形成的免疫復合物的量的器件；(e)通過用未標記的抗肽-6抗體的梯度稀釋液替換肽-6與帶標記的本發明的人源化抗體的梯度稀釋液而建立的標準曲線；(f)用于實施以下內容的操作說明檢測所述樣品中抗肽-6抗體的存在和量，并優選使用上文所述的本發明的方法。應理解的是，可以適合用于本發明的試劑盒中的所述固相載體通常基本不溶于液相。本發明的固相載體不限于特定類型的載體。相反，對本領域的普通技術人員而言，存在大量的可以獲得的已知載體。因此，可用的固相載體包括固體基質，例如氣凝膠和水凝膠，樹脂，珠，生物芯片(包括被覆薄膜的生物芯片)，微流體芯片，硅芯片，優選的是多孔平板(亦稱為微孔平板或微孔板)。應注意的是，為實施本文所述的診斷應用，本發明的人源化抗體可以與可檢測標記偶聯。能夠使本發明的抗體帶有可檢測標記的一種方法是將所述抗體連接到酶上并在酶免疫測定(EIA)中使用。隨即，該酶會在隨后暴露于適合的底物時與該底物反應，其反應方式使得可以產生能夠使用例如分光光度法、熒光測定法或目視裝置而檢測到的化學部分。能夠用來使抗體帶有可檢測標記的酶包括但不限于蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、6 -5-類固醇異構酶、酵母醇脫氫酶、a -甘油磷酸脫氫酶、磷酸丙糖異構酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、3 -半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。檢測可以通過比色方法來完成，所述方法采用針對酶的生色底物。檢測還可以通過將底物與以類似方式制備的標準物的酶促反應程度進行目視比較來完成。檢測可以通過使用各種其他免疫測定中的任何一種來完成。例如，通過對本發明的抗體或抗體片段進行放射性標記，可以通過使用放射免疫測定(RIA)來檢測樣品中的抗肽-6抗體水平。通過例如使用Y計數器或閃爍記數器等手段或者通過自動射線照相術，可以檢測到放射性同位素。作為另一選擇，還可以用熒光化合物、熒光發射金屬、化學發光化合物或生物發光化合物來標記本發明的抗體。應了解的是，本發明的診斷和方法都可選地使用適合的緩沖液和溶液，以用于本發明的抗體和被測樣品中所含的抗體與肽6的相互作用，和用于這兩種抗體的競爭性結合測定。所述緩沖液還可以用于在根據本發明的方法進行樣品分析前溶解固體或半固體樣品。本發明的診斷試劑盒和方法中的本發明的抗體與存在于目的樣品中的抗體的競 爭性結合通常要求保持特定的PH和摩爾滲透壓濃度條件。一些去垢劑和溶劑的存在與否同樣會改變結合效率。該pH通常保持在相對中性的水平，例如約6 約9，而在一些實施方式中，約7。摩爾滲透壓濃度通常是通過添加鹽(例如氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂和其他鹽)來調整的。可以用于調整結合條件的去垢劑和溶劑的一些非限制性實例包括Tween-20、Triton X100、PEG、DMSO和Nonidet P-40，等等。可以用來保持所需的pH和摩爾滲透壓濃度的生物相容性緩沖液的一些非限制性實例包括硼酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、2-(N-嗎啉)乙烷磺酸(“MES”)、三羥甲基氨基甲烷(“Tris”)、檸檬酸鹽緩沖液，等等。除非另有說明，本文所用的所有科技術語都具有本領域中常用的意義。本文提供的定義是為了便于理解本文中常用的某些術語，并不意在限制本公開的范圍。現將基于以下實施例對本發明作更詳細的描述，這些實施例僅是說明性的而不以任何方式限制本發明。基于本文的教導，可以對本發明做出很多修改和變形。因此應理解的是，在所附權利要求的范圍內，可以以具體描述的方式以外的方式實施本發明。對于所公開和描述的，應理解的是，本發明并不限于本文所公開的特定的實施例、方法步驟和組合物，因為這些方法步驟和組合物可以發生一些變化。還應理解的是，由于本發明的范圍僅受所附權利要求及其等價概念的限制，所以本文所用的術語僅是用來實現描述特定實施方式的目的，并非試圖進行限制。必須注意的是，除非內容另有明確界定，本說明書和所附權利要求中所用的單數形式“一個”、“一種”和“所述”包含復數的所指代物。在整個本說明和實施例及隨后的權利要求中，除非上下文另有要求，詞語“包含”及諸如“含有”和“包括”等變形應理解為包涵了所敘述的整體或步驟或者整體或步驟的組，但并不排除任何其他整體或步驟或者整體或步驟的組。以下實施例代表了本發明人在實施本發明的各個方面時所采用的技術。應認識到的是，雖然這些技術是用于實行本發明的優選實施方式的典型，但本領域的技術人員基于本公開內容將認識到可以做出多種修改而不脫離本發明的主旨和所指示范圍。實施例實驗程序在不另作詳細描述的情況下，相信本領域的技術人員應該能夠使用之前的說明最大限度地利用本發明。因此，應將下文的優選具體實施方式
解讀為僅是說明性的，而非以任何方式限制所要求保護的發明。本領域已知的標準分子生物學操作規程并不在本文中作具體描述，其通常主要如以下書籍中所述Sambrook 等，((Molecular cloning:A laboratory manual)), ColdSprings Harbor Laboratory, New-York (1989, 1992),和 Ausubel 等，《Current Protocolsin Molecular Biology》，John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1988)。本領域已知的標準有機合成操作規程并不在本文中作具體描述，其通常主要如以下書籍中所述((Organic syntheses))第1-79卷，多個編者，J. Wiley, NewYork, (1941-2003) ;Gewert 等，《Organic synthesis workbook)), ffiley-VCH, Weinheim(2000) ;Smith和March,《Advanced Organic Chemistry》, Wiley-Interscience,第 5版，(2001)。本領域已知的標準藥物化學方法并不在本文中作具體描述，其通常主要如以下書籍中所述《Comprehensive Medicinal Chemistry》系列，由多個作者和編者著，由Pergamon Press 出版。在不另作詳細描述的情況下，相信本領域的技術人員使用之前的說明應該能夠最大限度地利用本發明。因此，應將下文的優選具體實施方式
解讀為僅是說明性的，而非以任何方式限制所要求保護的發明。本領域已知的標準分子生物學操作規程并不在本文中作具體描述，其通常主要如以下文獻中所述Vanderkerken K The 5T2MM murine model of multiplemyeloma:maintenance and analysis, [Methods MoI. Med. 113:191-205(2005) ；EpsteinJ. The SCID-hu myeloma model. Methods Mol. Med. 113:183-90(2005)]。抗體*小鼠抗肽-6抗體是通過雜交瘤技術從肽-6免疫化的Balb/C小鼠開發出的小鼠單克隆抗體，并且屬于IgM同型。*嵌合抗肽_6IgGl小鼠抗體是由Antitope Ltd.使用實施例I所述的嵌合技術開發的。所得的嵌合抗體由小鼠抗體的小鼠可變區(如SEQ ID N0:1和2以及圖IA和IB所示)和人IgGl同型的恒定區構成。*基于小鼠參照抗體的人源化抗肽-6抗體是由Antitope Ltd.使用復合人抗體 技術(在WO 2006/082406中有所描述)而制得的，如實施例2所述。將帶FITC標記的人源化抗體用于FACS分析。在一些實施方式中，術語Proximab可以用來描述針對MT HSP65的肽_6表位的單克隆抗體。* 抗 CD14-PE (Sigma)* 抗 CD14-APC(Miltenyi Biotech)*帶HRP標記的小鼠抗人K輕鏈(Sigma,目錄號A7164)*山羊抗小鼠IgM過氧化物酶(Sigma，目錄號A8786)*山羊抗人IgG過氧化物酶(Sigma,目錄號A7164)細胞系*CH0 dhfr- (ECACC,目錄號 94060607，批號 05G020)*THP-1 (ATCC 號 TIB-202)單核細胞*RAW鼠類巨噬細胞*NS0 細胞(ECACC 85 110503，Porton，英國)、
限制性酶*BssH II (New England Biolabs 目錄號 R0199)
*BamH I (New England Biolabs 目錄號 R0136)*Mlu I (New England Biolabs 目錄號 R0198)*Hind III (New England Biolabs 目錄號 R0140)*SspI (New England Biolabs 目錄號 R0132)培養基和補充劑 *CD DG44 (Invitrogen,目錄號 12610-010)*Glutamax (Invitrogen,目錄號 35050)*DMEM(Invitrogen,目錄號 41966)* 透析的 FBS(Invitrogen,目錄號 26400)*H/T (Invitrogen,目錄號 11067)*CD-0ptiCH0 (Invitrogen,目錄號 12681-029)*FBS (超低 IgG,目錄號 16250-078Invitrogen, Paisley,英國)* 青霉素 / 鏈霉素(Invitrogen, Paisley,英國)*DMS0 (Sigma,目錄號 D2650)*氨甲喋呤(Sigma,目錄號A6770)試劑和試劑盒^Lipofectamine 2000 (Invitrogen,目錄號 11668027)*TMB 底物(Invitrogen,目錄號 00-2023)或(Sigma,目錄號 T0440)*Minerva Biolabs Venor GeM 支原體檢測試劑盒(目錄號 11-1050)*蛋白A瓊脂糖凝膠柱(GE Healthcare,目錄號110034-93)*針對人IgGl/ K或IgG4/ K標準樣(Sigma目錄號15154和14631)的Fe捕捉/K 鏈檢測 ELISA (Sigma 目錄號 16260 和 A7164)設備^Binder CB150 培育箱*Dynex Technologies MRX TC II 平板讀取儀*Vi-CELLTM XR 計數器(Beckman Coulter)*6孔組織培養板(Corning,目錄號3516)*MaxiSorp 96 孔平底微孔板(Fisher，目錄號 DIS-971-030J)* 愛倫美氏燒瓶(Erlenmeyer flask) (Corning,目錄號 431407)動物*為獲得佐劑誘導性關節炎模型，向6 8周齡雌性近交Lewis大鼠(HarlanLaboratories,以色列)的尾基部皮內注射含有Img結核分枝桿菌(MT)H37Ra(Difco, Detroit, Ml)的 CFA(Difco)。*為獲得膠原誘導性關節炎模型，使用了 9周齡的雄性DBA/1小鼠(HarlanLaboratories,以色列)。向小鼠尾基部皮下注射200 ii g乳化在CFA(Difco)中的II型膠原。三周后，用同樣濃度的II型膠原對小鼠進行皮下注射加強。*為獲得TNBS結腸炎模型，用在50%乙醇中的160 U I濃度為2. 5%的半抗原化試劑 TNBS(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)通過皮膚涂抹來敏化 Balb/C 小鼠。* 用鏈脲霉素(70mg/kg)處理購自 Harlan-Israel 研究室的 Sprague-Dawley (SD)雄性大鼠，以用作I型糖尿病模型。*向8周齡雌性C57BL/6小鼠的左側腰區中皮下注射125 U g髓磷脂少突細胞糖蛋白35 55肽(M0G35-55)(該肽乳化在含有5mg/ml熱殺滅的結核分歧桿菌的完全弗氏佐劑(CFA)中)，以用作MS模型。Capl 的克隆用引物CaplbamF(GCGTAGTC GGA TCC ATG GCT GAC ATG CAA AAT CTG G, SEQ IDNO:99)和 capIxhoyeshstopR(GCGTAGTC CTC GAG TTA TCC AGC AATTTC TGT CAC TGT GGTGAC C，SEQ ID NO: 100)從 THP-1 cDNA PCR 擴增 Capl。將得到的約 1400bp 的 PCR 產物插A PGEMT載體(Promega)中，從而使Capl在PGEMT中帶有終止密碼子(測序結果顯示序列完整)。接下來，用BamHI和XhoI將Capl從pGEMT載體中切出。將1400bp條帶連接到用同樣的酶切開的經修改的Pet22b載體(Novagen)中，從而得到N端側接有6 X HIS且基因 末端帶有終止密碼子的Capl。產生小鼠抗肽-6的雜交瘤的制備用IOOii g懸浮在完全弗氏佐劑(CFA)中的肽_6 (GPKGRNVVLEKKWGAP，如SEQ IDNO: 15所示)對六周齡的雌性Balb/c小鼠或Lewis大鼠進行皮下注射。以三周為間隔，用含有該肽的不完全弗氏佐劑(IFA)再注射動物兩次。收集血清，以用于通過ELISA來測量抗肽-6抗體的水平，向該水平最高的動物連續2次腹膜內注射含有50 ii g肽的PBS。次日，使脾細胞與BALB/c Ig-非分泌型骨髓瘤NSO細胞融合。通過特異性ELISA在上清液中檢測到了特異性地識別肽-6 (SEQ ID NO: 15)的抗體的存在，并擴增陽性克隆。從雜交瘤細胞的上清液中純化出抗肽-6抗體。通過巰基吸附和隨后的蛋白G色譜(Adar Biotech，以色列)來進行純化。用SDS-PAGE來確定抗體的純度。人源化抗肽-6抗體的F (bb) 2片段的制備使用F(ab)2制備試劑盒基于胃蛋白酶消化(Pierce ;按照制造商的操作說明)來產生人源化VH2/VK3抗肽-6抗體的F(ab)2片段。使用Dylight 抗體標記試劑盒(Pierce ；按照制造商的操作說明)用FITC標記F(ab)2片段。人外周血單個核細胞(PBMC)的制備從健康捐獻者采集人靜脈血，并在Ficol梯度上使之分層，從而分離并富集白細胞級分。離心(1800rpm，30分鐘)后，收集單個核細胞的層，并將其轉移到新管中，用20ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)清洗，并在IlOOrpm下離心10分鐘。將細胞在24孔細胞培養板上鋪平板，濃度為I. 5 X IO6個細胞/每孔，所述細胞在Iml RPMI中，該RPMI補充有2mM谷氨酰月安、IOOii g/ml鏈霉素、100U/ml青霉素(以上試劑來自Biological Industries,以色列)和10%人血清(Sigma)。熒光激活細胞分選(FACS)分析將IO6個PBMC細胞置于^pendorff管中(每100 y I含有1%BSA和1%山羊血清(Sigma)的PBS中，有IO6個細胞)。隨后，在4°C下，將細胞僅與抗⑶14抗體溫育I小時，或者與抗⑶14抗體和人源化完整抗肽-6抗體或其F(ab)2 —起溫育I小時。隨后用PBS清洗細胞，并通過LSRII流式細胞儀(BD)確定染色。使用FCS express 3程序(De novo)來分析數據。
ELISA——變體復合抗體與肽_6的結合在黑暗中于室溫用含5%戍二醒的PBS (每孔100 U I)預處理Immulon MaxiSorp96孔平底微孔板(Fisher,目錄號DIS-971-030J)過夜，隨后用含有10 u g/ml肽-6 (SEQIDNO: 15)的PBS于4°C進行過夜包被。用PBS/0. 05%Tween 20清洗平板，隨后用2%BSA/PBS封閉I小時。將抗體在2%BSA/PBS中稀釋到IOOii g/ml的起始濃度。在平板上進行二倍稀釋，隨后將平板在室溫下溫育I小時。每個ELISA平板都包括嵌合抗肽_6抗體作為陽性對照。清洗平板，向每個孔添加100 u I PBS/0. 05%Tween 20 (其中以1:1000稀釋有山羊抗人IgG k過氧化物酶偶聯物(Sigma,目錄號A7164))。于室溫溫育I小時后，清洗平板，通過每孔添加100 u I TMB底物(Simga，目錄號T0440)顯色而進行測定。每孔添加50 3M HCl來使反應停止。在450nm處讀取吸光度(Dynex MRX TCII平板讀取儀)，并用該吸光度對抗體濃度作圖。ELISA——對細胞因子水平的評估 使用來自R&D SYSTEMS, Minneapolis MN USA的特定試劑盒(按照制造商的操作說明)來對細胞培養物或動物血清中的細胞因子水平進行評估。對佐劑誘導性關節炎的誘導和臨床評價向6 8周齡雌性近交Lewis大鼠(Harlan Laboratories,以色列)的尾基部皮內注射含有Img結核分枝桿菌(MT)H37Ra(Difco, Detroit, MI)的CFA(Difco)。每隔一天由單盲觀察者(blinded observer)對關節炎的嚴重程度(關節炎指數)作下述評價0，無關節炎；1，關節發紅；2，關節發紅并腫脹。對每只爪的踝關節和跗骨-跖骨關節進行評分。可以獲得最聞16的評分。佐劑誘導性關節炎中的組織病理學評價將大鼠無痛處死，將后肢移除并在福爾馬林中進行固定。用蘇木紫和曙紅(H&E)對關節進行染色，并由專業的獸醫病理學家來作出評價。對膠原誘導性關節炎的誘導和臨床評價向9周齡雄性DBA/1小鼠(Harlan Laboratories,以色列)的尾基部皮下注射200 ii g乳化在CFA(Difco)中的II型膠原。三周后，用同樣濃度的II型膠原對小鼠進行皮下注射而加強。每天由單盲觀察者用卡尺測量后足和前爪的直徑，由此來評價關節炎的嚴重程度。作為對照，發明人測量了年齡大致相同的4只未注射膠原的小鼠。將健康小鼠的平均值作為“截斷”度量。從加強注射后第5天開始，將評分值高于健康小鼠均值(一只或多只爪中的值)的每只小鼠都分配到某個治療組中。對半抗原介導性(TNBS)關節炎的誘導和臨床評價用160 ii I 含有 2. 5% 的半抗原化試劑 TNBS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)的 50%乙醇通過皮膚涂抹來敏化Balb/C小鼠。一周后，經由3. 5-French導管直腸內施用120 yl含1%TNBS的50%乙醇。直腸內施用TNBS之后3天，處死小鼠。在敏化時、直腸內施用時和之后每天，都對動物進行稱重，直至處死。通過評估體重損失和死后結腸組織的組織病理學來進行臨床評價。在TNBS關節炎中的組織病理學評價在含4%福爾馬林的磷酸鹽緩沖鹽水中固定組織，并將其包埋在石蠟中。用蘇木紫和曙紅對切片(5 u m)進行染色。由單盲病理學家使用以下0 4的評分系統來評價炎癥程度0，無炎癥跡象；1，低水平的白細胞浸潤；2，中等水平的白細胞浸潤；3，高水平的白細胞浸潤、高血管密度、腸壁增厚；4，透壁浸潤、杯狀細胞損失、高血管密度、強烈的腸壁增厚、水腫。在皮下和腹膜內施用后對血清人源化抗肽-6的藥代動力學分析將18只雄性DBA/1小鼠(7 8周齡)分為兩組，每組9只小鼠。用500 ii gVH2/VK3以腹膜內途徑處理第一組，用500y gVH2/VK3以皮下途徑處理第二組，都在第0天進行。將每組分為3個子組，每個子組3只小鼠，對于每個子組的所有小鼠，在施用抗體后的同一天從眼部抽血。子組I在第O、第3和第8天抽血，子組2在第I、第4和第10天抽血，子組3在第2和第11天抽血。在實驗結束時，將小鼠處死，抽血，收獲器官(心、脾、腎、肺和肝)置于4%福爾馬林中溫育24小時，隨后移至80%乙醇(其最適合用于免疫熒光載片制備)中。收集血清并保存在_20°C，以用于確定IL-10和VH2/VK3的含量。MS的EAE模型——向8周齡雌性C57BL/6小鼠的左側腰區中皮下注射125 y g髓 磷脂少突細胞糖蛋白35 55肽(M0G35-55)(該肽乳化在含有5mg/ml熱殺滅的結核分歧桿菌的完全弗氏佐劑(CFA)中)，從而誘導EAE。之后立即向小鼠腹膜內接種0. 5ml百日咳毒素(400ng),并在48小時時再次向小鼠腹膜內接種0. 5ml百日咳毒素(400ng)。7天后，通過向右側腰區中額外注射含M0G35 - 55肽的CFA來進一步激發小鼠。用所示的本發明的人源化抗肽-6抗體、利妥昔單抗(Rituximab)或載質(PBS)來處理小鼠。EAE臨床評分按如下作出評估0-無臨床疾病；I-尾部虛弱；2-后肢虛弱，足以損害翻正(righting)；3-單肢癱瘓；4-下身癱瘓，且前肢虛弱；5-四肢癱瘓；6-死亡。實施例I嵌合抗肽-6抗體的產生作為產生抗肽-6人源化抗體的第一步，構建了其中重鏈可變區和輕鏈可變區(VH和VL)序列源自小鼠抗肽-6單克隆抗體的嵌合抗體。已確定了小鼠抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區(VH和VL)序列，并已產生了包含小鼠可變區和人IgGl或IgG4/K恒定區的嵌合抗肽-6抗體。簡言之，從冷凍的小瓶中成功地使小鼠細胞復蘇，并使用mRNA抽提試劑盒按制造商的操作說明(Promega，目錄號Z5400)從雜交瘤細胞中抽提出mRNA。使用小鼠信號序列的簡并引物池和單一恒定區引物來執行RT-PCR。使用含有6個簡并引物池的組(5’引物MuIgVH5’ -A至F ;3’引物:MuIgMVH3’ -I和MuIgGVH3’ -2，如表I所示)擴增了重鏈可變區mRNA，并使用含有8個簡并引物池的組(5，引物MuIG k八5’ -A至k G，和MuIG X八5’-A ;3’引物MuIg K八3’-I和MuIg X八3’-I，如表I所示)擴增了輕鏈可變區mRNA。50 反應混合物包含36. 25 U I PCR級水、5 ii IlOXNovaTaq緩沖液、5. 25 U I dNTP (最終濃度為0. 2mM) ,2. 5 U I 引物(10pmol/u I)和 I U 1(1. 25U)NovaTaq DNA 聚合酶(目錄號 7103-3)。反應條件為30 40個循環94°C下變性I分鐘，50°C下退火I分鐘，72°C下延伸2分鐘，72°C下最終延伸6分鐘。擴增產物是用重鏈和K輕鏈引物池而非從\引物池獲得的。因此，在每個情況中，輕鏈都來自K簇。應注意的是，出于克隆目的，使用設計用來工程化引A 5’ MIuI和3’ HindIII限制性酶切位點的引物來通過PCR擴增VH區基因。使用設計用來工程化引入BssHII和BamHI限制性內切酶位點的引物來擴增VL區。
表I :用于進行嵌合抗體克隆的引物
權利要求
1.一種特異性地結合包含SEQ ID NO: 15的多肽的人源化抗體或其任何抗原結合片段，所述人源化抗體包含 a)重鏈可變區，所述重鏈可變區包含位于H22位的Cys、位于H23位的Ser、位于H26位的Gly、位于H27位的Phe、位于H28位的Ser、位于H29位的Leu、位于H30位的Ser、位于H31位的Thr、位于H32位的Ser、位于H33位的Asn、位于H34位的Met、位于H35位的Gly、位于H35A位的Val、位于H35B位的Gly、位于H48位的Leu、位于H50位的His、位于H51位的He、位于H52位的Leu、位于H53位的Trp、位于H54位的Asn、位于H55位的Asp、位于H56位的Ser、位于H57位的Lys、位于H58位的Tyr、位于H59位的Tyr、位于H60位的Asn、位于H61位的Pro、位于H62位的Ala、位于H63位的Leu、位于H64位的Lys、位于H65位的Ser、位于H92位的Cys、位于H95位的Met、位于H96位的Gly、位于H97位的Gly、位于H98位的Tyr、位于H99位的Tyr、位于HlOO位的Gly、位于H100A位的Asn、位于H100B位的Tyr、位于H100C位的Gly、位于H100D位的Tyr、位于H100E位的Tyr、位于H100F位的Ala、位于H100G位的Met、位于HlOl位的Asp和位于H102位的Tyr，且可選地包含位于H49位的Leu、位于H74位的Tyr、位于Hll位的lie、位于H41位的Ser和位于H108位的Ser中的至少一個；和 b)輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含位于LI位的Gin、位于L23位的Cys、位于L24位的Thr、位于L25位的Ala、位于L26位的Ser、位于L27位的Ser、位于L27A位的Ser、位于L28位的Val、位于L29位的Ser、位于L30位的Ser、位于L31位的Ser、位于L32位的Tyr、位于L33位的Leu、位于L34位的His、位于L47位的Trp、位于L50位的Ser、位于L51位的Thr、位于L52位的Ser、位于L53位的Asn、位于L54位的Leu、位于L55位的Ala、位于L56位的Ser、位于L71位的Tyr、位于L88位的Cys、位于L89位的His、位于L90位的Gin、位于L91位的Tyr、位于L92位的His、位于L93位的Arg、位于L94位的Ser、位于L95位的Pro、位于L96位的Pro和位于L97位的Thr，且可選地包含位于L21位的Met、位于LlO位的Ile和位于L80位的Ala中的至少一個；其中，所述位置是根據Kabat編號系統確定的。
2.如權利要求I所述的人源化抗體,所述人源化抗體包含 a)重鏈可變區，所述重鏈可變區與SEQID NO: I具有至少約70%同一性；和 b)輕鏈可變區，所述輕鏈可變區與SEQID NO:2具有至少約70%同一性。
3.如權利要求2所述的人源化抗體，其中，所述重鏈可變區在選自由H10、HlI、H12、H13、H15、H19、H41、H49、H74、H75、H79、H81、H82、H82A、H82C、H84、H85 和 H108 組成的組的至少一個位置上包含置換，且其中，所述輕鏈可變區在選自由L10、L11、L13、L15、L19、L21、L22、L42、L43、L60、L70、L72、L78、L79、L80、L83 和 LlOO 組成的組的至少一個位置上包含置換，其中所述位置是根據Kabat編號系統確定的。
4.如權利要求3所述的人源化抗體，所述人源化抗體特異性地結合包含SEQIDN0:15的多肽，所述人源化抗體包含 a)SEQ ID NO: I所示的重鏈可變區，不同之處在于HlO是Ala，Hll是Ile或Leu，H12是 Val，H13 是 Lys，H15 是 Thr，H19 是 Thr，H41 是 Ser 或 Ala，H49 是 Leu 或 Ala，H74 是Tyr 或 Ser，H75 是 Lys，H79 是 Val，H81 是 Thr，H82 是 Met，H82A 是 Thr，H82C 是 Met，H84是 Pro，H85 是 Val，且 H108 是 Ser 或 Leu ;和b)SEQID NO:2所示的輕鏈可變區，不同之處在于LlO是Ile或Thr，Lll是Leu，L13是 Leu, L15 是 Pro, L19 是 Ala, L21 是 Met 或 Leu, L22 是 Ser, L42 是 Lys, L43 是 Ala, L60是 Ser，L70 是 Asp，L72 是 Thr，L78 是 Leu，L79 是 Gln，L80 是 Ala 或 Pro，L83 是 Phe，且LlOO是Gln ;其中，所述位置是根據Kabat編號系統確定的。
5.如權利要求4所述的人源化抗體，其中，所述抗體包含 a)重鏈可變區，所述重鏈可變區包含SEQ ID N0:21、SEQ ID NO:22,SEQ IDN0:23和SEQID NO:20中的任何一個或者它們的任何變體的氨基酸序列，其中，所述變體在選自由H10、Hll、H12、H13、H15、H19、H41、H49、H74、H75、H79、H81、H82、H82A、H82C、H84、H85 和 H108 組成的組的至少一個位置上包含置換；和 b)輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含SEQID NO:26,SEQ ID N0:24和SEQ IDN0:25中的任何一個或者它們的任何變體的氨基酸序列，其中，所述變體在選自由L10、LlU L13、L15、L19、L21、L22、L42、L43、L60、L70、L72、L78、L79、L80、L83 和 LlOO 組成的組的至少一個位 置上包含置換；其中所述位置是根據Kabat編號系統確定的。
6.如權利要求5所述的人源化抗體，其中，所述重鏈可變區選自由SEQIDNO:21, SEQID NO:22、SEQ ID NO:23 和 SEQ ID NO:20 組成的組。
7.如權利要求5所述的人源化抗體，其中，所述輕鏈可變區選自由SEQIDNO:26, SEQID NO:24 和 SEQ ID NO:25 組成的組。
8.如權利要求6或7所述的人源化抗體，其中，所述重鏈可變區為SEQID N0:21，所述輕鏈可變區選自由SEQ ID NO :26, SEQ ID N0:24和SEQ ID N0:25組成的組。
9.如權利要求8所述的人源化抗體，其中，所述重鏈可變區為SEQID N0:21且所述輕鏈可變區為SEQ ID NO:26。
10.如權利要求8所述的人源化抗體，其中，所述重鏈可變區為SEQID NO: 21且所述輕鏈可變區為SEQ ID NO:25。
11.如權利要求8所述的人源化抗體，其中，所述重鏈可變區為SEQID N0:21且所述輕鏈可變區為SEQ ID NO:24。
12.如權利要求6或7所述的人源化抗體，其中，所述重鏈可變區為SEQIDN0:22，所述輕鏈可變區選自由SEQ ID NO :24, SEQ ID N0:25和SEQ ID N0:26組成的組。
13.如權利要求12所述的人源化抗體，其中，所述重鏈可變區為SEQID N0:22且所述輕鏈可變區為SEQ ID N0:25。
14.一種組合物，所述組合物包含有效量的至少一種分離且純化的人源化抗體作為活性成分，所述人源化抗體特異性地結合包含SEQ ID NO: 15的多肽，所述人源化抗體包含 a)重鏈可變區，所述重鏈可變區包含位于H22位的Cys、位于H23位的Ser、位于H26位的Gly、位于H27位的Phe、位于H28位的Ser、位于H29位的Leu、位于H30位的Ser、位于H31位的Thr、位于H32位的Ser、位于H33位的Asn、位于H34位的Met、位于H35位的Gly、位于H35A位的Val、位于H35B位的Gly、位于H48位的Leu、位于H50位的His、位于H51位的He、位于H52位的Leu、位于H53位的Trp、位于H54位的Asn、位于H55位的Asp、位于H56位的Ser、位于H57位的Lys、位于H58位的Tyr、位于H59位的Tyr、位于H60位的Asn、位于H61位的Pro、位于H62位的Ala、位于H63位的Leu、位于H64位的Lys、位于H65位的Ser、位于H92位的Cys、位于H95位的Met、位于H96位的Gly、位于H97位的Gly、位于H98位的Tyr、位于H99位的Tyr、位于HlOO位的Gly、位于H100A位的Asn、位于H100B位的Tyr、位于HlOOC位的Gly、位于H100D位的Tyr、位于H100E位的Tyr、位于H100F位的Ala、位于H100G位的Met、位于HlOl位的Asp和位于H102位的Tyr，且可選地包含位于H49位的Leu、位于H74位的Tyr、位于Hll位的lie、位于H41位的Ser和位于H108位的Ser中的至少一個；和 b)輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含 位于LI位的Gin、位于L23位的Cys、位于L24位的Thr、位于L25位的Ala、位于L26位的Se r、位于L27位的Ser、位于L27A位的Ser、位于L28位的Val、位于L29位的Ser、位于L30 位的Ser、位于L31位的Ser、位于L32位的Tyr、位于L33位的Leu、位于L34位的His、位于L47位的Trp、位于L50位的Ser、位于L51位的Thr、位于L52位的Ser、位于L53位的Asn、位于L54位的Leu、位于L55位的Ala、位于L56位的Ser、位于L71位的Tyr、位于L88位的Cys、位于L89位的His、位于L90位的Gin、位于L91位的Tyr、位于L92位的His、位于L93位的Arg、位于L94位的Ser、位于L95位的Pro、位于L96位的Pro和位于L97位的Thr，且可選地包含位于L21位的Met、位于LlO位的Ile和位于L80位的Ala中的至少一個；其中，所述位置是根據Kabat編號系統確定的，所述組合物還包含藥學上可接受的載劑、賦形劑或稀釋劑。
15.一種用于治療或改善免疫相關病癥的藥物組合物,其中,所述組合物包含治療有效量的至少一種分離且純化的人源化抗體作為活性成分，所述人源化抗體特異性地結合包含SEQ ID NO: 15的多肽，所述人源化抗體包含 a)重鏈可變區，所述重鏈可變區包含位于H22位的Cys、位于H23位的Ser、位于H26位的Gly、位于H27位的Phe、位于H28位的Ser、位于H29位的Leu、位于H30位的Ser、位于H31位的Thr、位于H32位的Ser、位于H33位的Asn、位于H34位的Met、位于H35位的Gly、位于H35A位的Val、位于H35B位的Gly、位于H48位的Leu、位于H50位的His、位于H51位的He、位于H52位的Leu、位于H53位的Trp、位于H54位的Asn、位于H55位的Asp、位于H56位的Ser、位于H57位的Lys、位于H58位的Tyr、位于H59位的Tyr、位于H60位的Asn、位于H61位的Pro、位于H62位的Ala、位于H63位的Leu、位于H64位的Lys、位于H65位的Ser、位于H92位的Cys、位于H95位的Met、位于H96位的Gly、位于H97位的Gly、位于H98位的Tyr、位于H99位的Tyr、位于HlOO位的Gly、位于H100A位的Asn、位于H100B位的Tyr、位于H100C位的Gly、位于H100D位的Tyr、位于H100E位的Tyr、位于H100F位的Ala、位于H100G位的Met、位于HlOl位的Asp和位于H102位的Tyr，且可選地包含位于H49位的Leu、位于H74位的Tyr、位于Hll位的lie、位于H41位的Ser和位于H108位的Ser中的至少一個；和 b)輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含位于LI位的Gin、位于L23位的Cys、位于L24位的Thr、位于L25位的Ala、位于L26位的Ser、位于L27位的Ser、位于L27A位的Ser、位于L28位的Val、位于L29位的Ser、位于L30位的Ser、位于L31位的Ser、位于L32位的Tyr、位于L33位的Leu、位于L34位的His、位于L47位的Trp、位于L50位的Ser、位于L51位的Thr、位于L52位的Ser、位于L53位的Asn、位于L54位的Leu、位于L55位的Ala、位于L56位的Ser、位于L71位的Tyr、位于L88位的Cys、位于L89位的His、位于L90位的Gin、位于L91位的Tyr、位于L92位的His、位于L93位的Arg、位于L94位的Ser、位于L95位的Pro、位于L96位的Pro和位于L97位的Thr，且可選地包含位于L21位的Met、位于LlO位的Ile和位于L80位的Ala中的至少一個；其中，所述位置是根據Kabat編號系統確定的，所述組合物還包含藥學上可接受的載劑、賦形劑或稀釋劑。
16.一種用于治療或改善免疫相關病癥的方法，所述方法包括下述步驟向有需要的受試對象施用治療有效量的至少一種分離且純化的人源化抗體或含有所述人源化抗體的組合物，所述人源化抗體特異性地結合包含SEQ ID N0:15的多肽，其中，所述人源化抗體包含 a)重鏈可變區，所述重鏈可變區包含位于H22位的078、位于1123位的Ser、位于H26位的Gly、位于H27位的Phe、位于H28位的Ser、位于H29位的Leu、位于H30位的Ser、位于H31位的Thr、位于H32位的Ser、位于H33位的Asn、位于H34位的Met、位于H35位的Gly、位于H35A位的Val、位于H35B位的Gly、位于H48位的Leu、位于H50位的His、位于H51位的He、位于H52位的Leu、位于H53位的Trp、位于H54位的Asn、位于H55位的Asp、位于H56位的Ser、位于H57位的Lys、位于H58位的Tyr、位于H59位的Tyr、位于H60位的Asn、位于H61位的Pro、位于H62位的Ala、位于H63位的Leu、位于H64位的Lys、位于H65位的 Ser、位于H92位的Cys、位于H95位的Met、位于H96位的Gly、位于H97位的Gly、位于H98位的Tyr、位于H99位的Tyr、位于HlOO位的Gly、位于H100A位的Asn、位于H100B位的Tyr、位于H100C位的Gly、位于H100D位的Tyr、位于H100E位的Tyr、位于H100F位的Ala、位于H100G位的Met、位于HlOl位的Asp和位于H102位的Tyr，且可選地包含位于H49位的Leu、位于H74位的Tyr、位于Hll位的lie、位于H41位的Ser和位于H108位的Ser中的至少一個；和 b)輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含位于LI位的Gin、位于L23位的Cys、位于L24位的Thr、位于L25位的Ala、位于L26位的Ser、位于L27位的Ser、位于L27A位的Ser、位于L28位的Val、位于L29位的Ser、位于L30位的Ser、位于L31位的Ser、位于L32位的Tyr、位于L33位的Leu、位于L34位的His、位于L47位的Trp、位于L50位的Ser、位于L51位的Thr、位于L52位的Ser、位于L53位的Asn、位于L54位的Leu、位于L55位的Ala、位于L56位的Ser、位于L71位的Tyr、位于L88位的Cys、位于L89位的His、位于L90位的Gin、位于L91位的Tyr、位于L92位的His、位于L93位的Arg、位于L94位的Ser、位于L95位的Pro、位于L96位的Pro和位于L97位的Thr，且可選地包含位于L21位的Met、位于LlO位的Ile和位于L80位的Ala中的至少一個；其中，所述位置是根據Kabat編號系統確定的。
17.如權利要求16所述的方法，其中，所述免疫相關病癥是自身免疫病癥或炎性病癥。
18.如權利要求17所述的方法，其中，所述炎性病癥是炎性關節炎。
19.如權利要求17所述的方法，其中，所述炎性病癥是炎性腸病(IBD)。
20.如權利要求17所述的方法，其中，所述自身免疫病癥是銀屑病。
21.如權利要求17所述的方法，其中，所述自身免疫病癥是糖尿病。
22.一種使有需要的受試對象中的IL-10的表達和水平增加的方法，所述方法包括下述步驟向所述受試對象施用治療有效量的至少一種分離且純化的人源化抗體或含有所述人源化抗體的組合物，所述人源化抗體特異性地結合包含SEQ ID NO: 15的多肽其中，所述人源化抗體包含 a)重鏈可變區，所述重鏈可變區包含位于H22位的Cys、位于H23位的Ser、位于H26位的Gly、位于H27位的Phe、位于H28位的Ser、位于H29位的Leu、位于H30位的Ser、位于H31位的Thr、位于H32位的Ser、位于H33位的Asn、位于H34位的Met、位于H35位的Gly、位于H35A位的Val、位于H35B位的Gly、位于H48位的Leu、位于H50位的His、位于H51位的He、位于H52位的Leu、位于H53位的Trp、位于H54位的Asn、位于H55位的Asp、位于H56位的Ser、位于H57位的Lys、位于H58位的Tyr、位于H59位的Tyr、位于H60位的Asn、位于H61位的Pro、位于H62位的Ala、位于H63位的Leu、位于H64位的Lys、位于H65位的Ser、位于H92位的Cys、位于H95位的Met、位于H96位的Gly、位于H97位的Gly、位于H98位的Tyr、位于H99位的Tyr、位于HlOO位的Gly、位于H100A位的Asn、位于H100B位的Tyr、位于H100C位的Gly、位于H100D位的Tyr、位于H100E位的Tyr、位于H100F位的Ala、位于H100G位的Met、位于HlOl位的Asp和位于H102位的Tyr，且可選地包含位于H49位的Leu、位于H74位的Tyr、位于Hll位的lie、位于H41位的Ser和位于H108位的Ser中的至少一個；和 b)輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含位于LI位的Gin、位于L23位的Cys、位于L24位的Thr、位于L25位的Ala、位于L26位的Ser、位于L27位的Ser、位于L27A位的Ser、位于L28位的Val、位于L29位的Ser、位于L30位的Ser、位于L31位的Ser、位于L32位的Tyr、位于L33位的Leu、位于L34位的His、位于L47位的Trp、位于L50位的Ser、位于L51位的Thr、位于L52位的Ser、位于L53位的Asn、位于L54位的Leu、位于L55位的Ala、位于L56位的Ser、位于L71位的Tyr、位于L88位的Cys、位于L89位的His、位于L90位的Gin、位于L91位的Tyr、位于L92位的His、位于L93位的Arg、位于L94位的Ser、位于L95位的Pro、位于L96位的Pro和位于L97位的Thr，且可選地包含位于L21位的Met、位于LlO位的Ile和位于L80位的Ala中的至少一個；其中，所述位置是根據Kabat編號系統確定的。
23.一種聯合組合物，所述聯合組合物包含至少一種分離且純化的人源化抗體和至少一種抗炎劑，其中所述人源化抗體特異性地結合包含SEQ ID NO: 15的多肽，所述人源化抗體包含 a)重鏈可變區，所述重鏈可變區包含位于H22位的Cys、位于H23位的Ser、位于H26位的Gly、位于H27位的Phe、位于H28位的Ser、位于H29位的Leu、位于H30位的Ser、位于H31位的Thr、位于H32位的Ser、位于H33位的Asn、位于H34位的Met、位于H35位的Gly、位于H35A位的Val、位于H35B位的Gly、位于H48位的Leu、位于H50位的His、位于H51位的He、位于H52位的Leu、位于H53位的Trp、位于H54位的Asn、位于H55位的Asp、位于H56位的Ser、位于H57位的Lys、位于H58位的Tyr、位于H59位的Tyr、位于H60位的Asn、位于H61位的Pro、位于H62位的Ala、位于H63位的Leu、位于H64位的Lys、位于H65位的Ser、位于H92位的Cys、位于H95位的Met、位于H96位的Gly、位于H97位的Gly、位于H98位的Tyr、位于H99位的Tyr、位于HlOO位的Gly、位于H100A位的Asn、位于H100B位的Tyr、位于H100C位的Gly、位于H100D位的Tyr、位于H100E位的Tyr、位于H100F位的Ala、位于H100G位的Met、位于HlOl位的Asp和位于H102位的Tyr，且可選地包含位于H49位的Leu、位于H74位的Tyr、位于Hll位的lie、位于H41位的Ser和位于H108位的Ser中的至少一個；和 b)輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含位于LI位的Gin、位于L23位的Cys、位于L24位的Thr、位于L25位的Ala、位于L26位的Ser、位于L27位的Ser、位于L27A位的Ser、位于L28位的Val、位于L29位的Ser、位于L30位的Ser、位于L31位的Ser、位于L32位的Tyr、位于L33位的Leu、位于L34位的His、位于L47位的Trp、位于L50位的Ser、位于L51位的Thr、位于L52位的Ser、位于L53位的Asn、位于L54位的Leu、位于L55位的Ala、位于L56位的Ser、位于L71位的Tyr、位于L88位的Cys、位于L89位的His、位于L90位的Gin、位于L91位的Tyr、位于L92位的His、位于L93位的Arg、位于L94位的Ser、位于L95位的Pro、位于L96位的Pro和位于L97位的Thr，且可選地包含位于L21位的Met、位于LlO位的Ile和位于L80位的Ala中的至少一個；其中，所述位置是根據Kabat編號系統確定的。
24.如權利要求23所述的聯合組合物，其中，所述抗炎劑選自由以下物質組成的組甲基強的松(MPS)、抗TNF劑、依那西普(Enbrel)、英夫利昔單抗(Remicade)、阿達木單抗(Humira)和賽妥珠單抗(Cimzia)、抗IL-6劑、托珠單抗(Actemra)、抗IL-1受體劑、kineret (阿那白滯素)、CTLA-4-Ig、阿巴西普(Orencia)、抗CD20劑、利妥昔單抗(MabThera; Rituxan)、氨甲喋呤、任何皮質類固醇衍生物和誘導任何信號傳導途徑的任何抗炎劑。
25.一種用于在患有免疫相關病癥的受試對象中獲得療效的試劑盒，所述試劑盒包含 i.至少一種分離且純化的人源化抗體或其任何抗原結合片段或其藥學上可接受的衍生物，和藥學上可接受的載劑或稀釋劑，上述物可選地為第一單位劑型； ii.至少一種抗炎劑，和藥學上可接受的載劑或稀釋劑，上述物可選地為第二單位劑型；和 iii.用于容納所述第一劑型和第二劑型的容器裝置；其中所述人源化抗體特異性地結合包含SEQ ID NO: 15的多肽，所述人源化抗體包含 a)重鏈可變區，所述重鏈可變區包含位于H22位的Cys、位于H23位的Ser、位于H26位的Gly、位于H27位的Phe、位于H28位的Ser、位于H29位的Leu、位于H30位的Ser、位于H31位的Thr、位于H32位的Ser、位于H33位的Asn、位于H34位的Met、位于H35位的Gly、位于H35A位的Val、位于H35B位的Gly、位于H48位的Leu、位于H50位的His、位于H51位的He、位于H52位的Leu、位于H53位的Trp、位于H54位的Asn、位于H55位的Asp、位于H56位的Ser、位于H57位的Lys、位于H58位的Tyr、位于H59位的Tyr、位于H60位的Asn、位于H61位的Pro、位于H62位的Ala、位于H63位的Leu、位于H64位的Lys、位于H65位的Ser、位于H92位的Cys、位于H95位的Met、位于H96位的Gly、位于H97位的Gly、位于H98位的Tyr、位于H99位的Tyr、位于HlOO位的Gly、位于HlOOA位的Asn、位于H100B位的Tyr、位于H100C位的Gly、位于H100D位的Tyr、位于H100E位的Tyr、位于H100F位的Ala、位于H100G位的Met、位于HlOl位的Asp和位于H102位的Tyr，且可選地包含位于H49位的Leu、位于H74位的Tyr、位于Hll位的lie、位于H41位的Ser和位于H108位的Ser中的至少一個；和 b)輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含位于LI位的Gin、位于L23位的Cys、位于L24位的Thr、位于L25位的Ala、位于L26位的Ser、位于L27位的Ser、位于L27A位的Ser、位于L28位的Val、位于L29位的Ser、位于L30位的Ser、位于L31位的Ser、位于L32位的Tyr、位于L33位的Leu、位于L34位的His、位于L47位的Trp、位于L50位的Ser、位于L51位的Thr、位于L52位的Ser、位于L53位的Asn、位于L54位的Leu、位于L55位的Ala、位于L56位的Ser、位于L71位的Tyr、位于L88位的Cys、位于L89位的His、位于L90位的Gin、位于L91位的Tyr、位于L92位的His、位于L93位的Arg、位于L94位的Ser、位于L95位的Pro、位于L96位的Pro和位于L97位的Thr，且可選地包含位于L21位的Met、位于LlO位的Ile和位于L80位的Ala中的至少一個；其中，所述位置是根據Kabat編號系統確定的。
26.如權利要求25所述的試劑盒，其中，所述抗炎劑選自由以下物質組成的組甲基強的松(MPS)、抗TNF劑、依那西普(Enbrel)、英夫利昔單抗(Remicade)、阿達木單抗(Humira)和賽妥珠單抗(Cimzia)、抗IL-6劑、托珠單抗(Actemra)、抗IL-I受體劑、kineret (阿那白滯素)、CTLA-4-Ig、阿巴西普(Orencia)、抗CD20劑、利妥昔單抗(MabThera;Rituxan)、氨甲喋呤、任何皮質類固醇衍生物和誘導任何信號傳導途徑的任何抗炎劑。
27.一種用編碼權利要求I所述的人源化抗體的表達載體轉化或轉染的宿主細胞系。
28.如權利要求27所述的宿主細胞系，其中，所述細胞系表達人源化抗體，所述人源化抗體具有包含由SEQ ID NO:21所表示的氨基酸序列的重鏈可變區和包含由SEQ ID NO:26所表示的氨基酸序列的輕鏈可變區。
29.一種嵌合單克隆抗體，所述嵌合單克隆抗體特異性地結合包含SEQ ID NO: 15的多肽，其中，所述抗體包含人免疫球蛋白恒定區和鼠類免疫球蛋白可變區，所述可變區包含具有由SEQ ID NO: 2所表示的氨基酸序列的輕鏈可變區，和具有由SEQ IDN0:1所表示的氨基酸序列的重鏈可變區。
全文摘要
本發明涉及人源化抗體，所述人源化抗體特異性結合包含由SEQ ID NO:15所表示的肽-6的多肽，所述肽-6是源自HSP65的肽。更具體而言，本發明涉及用于治療免疫相關病癥的人源化抗肽-6抗體、組合物、方法及其用途，所述免疫相關病癥具體為炎性病癥，例如關節炎、IBD、銀屑病、糖尿病和MS。本發明還提供組合了本發明的人源化抗體和至少一種抗炎劑的聯合組合物和試劑盒，以及所述人源化抗體在診斷試劑盒和方法中的應用。
文檔編號C12P21/08GK102740877SQ201080050177
公開日2012年10月17日 申請日期2010年9月6日 優先權日2009年9月6日
發明者S·亞伊爾, 雅各布·納帕斯塔克 申請人:普羅塔布有限公司