高起泡性志賀氏菌菌株的制作方法

專利名稱：高起泡性志賀氏菌菌株的制作方法
技術領域：
本發明屬于抗志賀氏菌的免疫法領域。
背景技術：
志賀氏菌屬是革蘭氏陰性非運動性兼性厭氧菌，其可分為4種血清群痢疾志賀氏菌(S. dysenteriae)、福氏志賀氏菌(S. fIexneri)、鮑氏志賀氏菌(S. boydii)、宋內志賀氏菌(S. sonnei)。它們造成志賀氏菌痢(桿菌性痢疾)。臨床上志賀氏菌痢的標志是急性直腸結腸炎，其伴隨有發燒、惡心、食欲減退、脫 水、粘液膿性和血性腹瀉以及里急后重。志賀氏菌導致的痢疾是地方病，可在發展中國家中導致成百萬例的發病。例如，每年約有I. 65億例志賀氏菌痢，其中的99%發生在發展中國家，69%發生在5歲以下的兒童中。志賀氏菌痢造成的發病率和死亡率在發展中國家的兒童中尤其高。參考文獻I中對志賀氏菌疫苗的現有途徑進行了綜述，這些途徑基于活減毒菌株，其用于口服免疫法、與O糖偶聯用于注射、用于鼻內的蛋白體(連接有志賀氏菌LPS的腦膜炎球菌外膜囊泡)、用于鼻內的侵襲復合物(invaplexes,包含IpaB、IpaC和LPS的志賀氏菌屬亞細胞提取物)、以及由具有去毒LPS的msbB_ve菌株制得的核蛋白-核糖體復合物。雖然這些疫苗中的一些已在實地試驗中顯效，但是沒有一種疫苗可提供對抗多種志賀氏菌血清型的保護。本發明的一個目的是提供在志賀氏菌疫苗制備中進一步提供和改進有用組分，尤其是可提供對抗多種志賀氏菌血清型的保護的疫苗。

發明內容
由于細胞被膜的膨壓，志賀氏菌在生長期間自發地釋放外膜突泡(bleb)。如參考文獻2中所揭示，突泡的釋放高度依賴于細菌外膜的結構。本發明人已經采用志賀氏菌的突變株來干擾外膜的結構，該突變株中的Tol-Pal系統已被破壞。在正常生長期間，這些突變株將大量突泡釋放到其培養基中，這些突泡富含免疫原性外膜蛋白，因此這些突泡可被用作免疫原。由此，本發明提供了表達1'01六、1'018、1'010、1'011 和？&1蛋白中不多于4種蛋白質的志賀氏菌。因此，天然的五蛋白Tol-Pal系統中的至少一種蛋白質是缺失的，導致了細菌在培養基中的生長過程中，與表達全部五種Tol-Pal蛋白的相同細菌相比，將更多量的外膜突泡釋放到培養基中。優選TolR不表達，但可表達其它四種蛋白質。本發明還提供一種不表達TolR蛋白的志賀氏菌。本發明還提供一種志賀氏菌的AtolR 株,例如 Δ tolR Δ galU 菌株。本發明還提供一種志賀氏菌，其表達TolA、TolB, TolQ, TolR和Pal蛋白，其中所述TolA、TolQ、TolR和/或Pal蛋白(a)位于細菌的內膜或外膜內，且(b)包含一個或多個氨基酸序列突變，由此使得該細菌與不含所述突變的相同細菌相比，在培養基中生長時釋放更大量的外膜突泡。本發明還提供一種志賀氏菌，該細菌中的Tol-Pal系統中的一種或多種組分具有修飾，從而使得該細菌與缺乏修飾的相同細菌相比，在培養基中生長時將更大量的外膜突泡釋放到培養基中，并且該細菌不表達(i)天然志賀氏菌的脂多糖和/或(ii)志賀氏菌
的腸毒素。本發明還提供一種制備高起泡性志賀氏菌的方法，所述方法包括修飾編碼起始細菌(starting bacterium)的Tol-Pal系統一種或多種組分的基因的步驟,所述修飾得到所述細菌與起始細菌相比，在培養基中生長時將更大量的外膜突泡釋放到培養基中，且其中所述修飾涉及使得起始菌的tolA、tolB、tolQ、tolR和/或pal基因發生一種或多種突變。該突變步驟可為所述基因的缺失。該方法還可涉及編碼合成該菌的脂多糖或腸毒素所需的蛋白質的基因的修飾。 本發明還提供一種分離或獲自本發明的細菌的突泡。這些突泡可用作志賀氏菌疫苗的組分。本發明還提供一種制備志賀氏菌突泡的方法，所述方法包括從包含本發明細菌的培養基中分離所述突泡的步驟，其中本發明細菌已在允許該細菌將突泡釋放到所述培養基中的條件下生長。通過該方法制備的突泡可用作志賀氏菌疫苗的組分。本發明還提供一種包含本發明細菌的培養基，所述細菌已在允許該細菌將突泡釋放到所述培養基中的條件下生長。可從該培養基中純化所述突泡。本發明還提供一種包含突泡的組合物，所述突泡在本發明細菌的培養過程中釋放入培養基。該組合物不含任何活的和/或完整細菌。該組合物和/或其組分可用于志賀氏菌疫苗的制備。本發明還提供一種包含突泡的組合物，其中所述突泡存在于過濾液中，所述過濾液是將本發明細菌生長的培養基通過O. 22 μ m濾器后獲得的。該組合物和/或其組分可用于志賀氏菌疫苗的制備。本發明還提供一種志賀氏菌突泡，其包含以下的一種或多種(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、
34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60種)(a)由選自SEQ ID N0:8_67中的一種氨基酸序列組成的蛋白質；(b)包含與SEQID NO:8-67中的一種具有至少的相同性的氨基酸序列的蛋白質，其中j為50或更高(例如 60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99)和 / 或包含 SEQ IDNO :8-67中任一種中至少η個連續氨基酸的片段的蛋白質，其中η為7或更多(例如8、10、12、14、
16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多個)。優選的片段包含來自SEQ ID NO:8-67之一的抗原表位。其它優選的片段缺失所述SEQ ID NO:的C-末端的一個或多個氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個)和/或N-末端的一個或多個氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個)，但保留該SEQ IDNO:的至少一個表位。其它片段缺漏一個或多個蛋白質結構域，例如缺失信號肽等。已確認本發明的突泡中存在60種蛋白質，這些蛋白質對于抗所述突泡制備的血清具有免疫反應性。因此，從突泡分離出的、以純化形式存在的各種蛋白質可用作免疫原性組分。由此，本發明還提供包含突泡蛋白但不含突泡的免疫原性組合物，所述突泡蛋白包含(a)氨基酸序列SEQ ID NO :8-67中的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60 種)；(b)與SEQ ID NO:8-67之一具有至少j %相同性的氨基酸序列，其中j為50或更高(例如60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99)和 /或包含 SEQID NO:8_67 中任一種的至少η個連續氨基酸的片段，其中η為7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。優選的片段包含來自 SEQ ID NO:8-67之一的抗原表位，更優選的片段為免疫原性片段。其它優選的片段缺失SEQ ID NO:的C-末端的一個或多個氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個)和/或N-末端的一個或多個氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更 多個)，但保留該SEQIDNO:的至少一個抗原表位。其它片段缺漏一個或多個蛋白結構域，例如缺失跨膜結構域、信號妝等。本發明還提供一種志賀氏菌突泡，其包含以下的一種或多種(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、11I、112、113、114、115、116、117、I18、I19、120、121、122、123、124、125、126、127、128 或 129 種):(a)由選自SEQ ID N0:8_136中的一種氨基酸序列組成的蛋白質；(b)包含與SEQ IDN0:8-136中的一種具有至少j %的相同性的氨基酸序列的蛋白質，其中j為50或更高(例如 60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99)和 / 或包含 SEQ IDNO: 8-136中任一種中至少η個連續氨基酸的片段的蛋白質，其中η為7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多個)。優選的片段包含來自SEQ ID Ν0:8-136之一的抗原表位。其它優選的片段缺失所述SEQ ID NO:的C-末端的一個或多個氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個)和/或N-末端的一個或多個氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個)，但保留該SEQID NO:的至少一個抗原表位。其它片段缺漏一個或多個蛋白質結構域，例如缺失信號肽等。已確認本發明的突泡中存在129種蛋白質，這些蛋白質對于抗所述突泡制備的血清具有免疫反應性。因此，從突泡分離出的、以純化形式存在的各種蛋白質可用作免疫原性組分。由此，本發明還提供包含突泡蛋白但不含突泡的免疫原性組合物，所述突泡蛋白包含(a)氨基酸序列 SEQ ID NO :8-136 中的一種或多種(例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、I10、I11、I12、I13、I14、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128 或 129 種)；
(b)與SEQ ID N0:8_136之一具有至少j %相同性的氨基酸序列，其中j為50或更高(例如 60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99)和 / 或包含 SEQ IDNO:8-136中任一種的至少η個連續氨基酸的片段的氨基酸序列，其中η為7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。優選的片段包含來自SEQ ID Ν0:8-136之一的抗原表位，更優選的片段為免疫原性片段。其它優選的片段缺失SEQ ID NO:的C-末端的一個或多個氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個)和/或N-末端的一個或多個氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個)，但保留該SEQ ID NO:的至少一個抗原表位。其它片段缺漏一個或多個蛋白結構域，例如缺失跨膜結構域、信號肽等。在SEQ ID Ν0:8_136中，與福氏志賀氏菌相關的優選亞組是下表I的“亞組I”中所列的SEQ ID NO。在SEQ ID NO:8-136中，與宋內志賀氏菌相關的優選亞組是下表I的“亞組2”中所列的SEQ ID NO。Tol-Pal 系統與許多革蘭氏陰性菌類似，志賀氏菌天然具有由TolA、TolB、TolQ、TolR和Pal蛋白構成的Tol-Pal系統。根據本發明，天然Tol-Pal系統被破壞，從而導致細菌在細菌復制過程中將更大量的外膜突泡釋放到其培養基中。可進行各種破壞。在一些實施方式中，去除五種Tol-Pal蛋白中的至少一種，例如通過使得編碼該蛋白的基因缺失或失活。因此，細菌可表達TolA、TolB、TolQ、TolR和Pal蛋白中的0、1、2、3或4種蛋白質。去除五種蛋白質中的一種可能已足夠，在該情況下該細菌僅表達這些蛋白質中的四種。優選去除TolR蛋白，例如通過使得起始菌株的to lR基因失活。由此，該細胞可為 tolA+tolB+tolQ+TolR Pal+。在一些實施方式中，該細菌表達全部五種Tol-Pal蛋白，但至少一種蛋白質發生突變而導致高起泡性。例如，TolA、TolQ、TolR和/或Pal蛋白可發生突變，從而使得蛋白質保留其膜定位，但其與其它Tol-Pal系統成員的相互作用被破壞。由此，該細菌將把作為跨膜蛋白的TolA、TolQ和TolR保留在內膜中,把作為向周質(periplasm-facing)脂蛋白的Pal蛋白保留在外膜中，但TolA、TolQ、TolR和/或Pal蛋白中的至少一種是突變的。野生型志賀氏菌的TolA、TolB、TolQ、TolR和Pal蛋白的氨基酸序列的例子作為SEQ ID NO: 1-5示于序列表中。志賀氏菌本發明可采用痢疾志賀氏菌(S. dysenteriae)、福氏志賀氏菌(S. fIexneri)、鮑氏志賀氏菌(S. boydii)、宋內志賀氏菌(S. sonnei)的任何血清群。除了具有被破壞的Tol-Pal系統而使得細菌在細菌復制期間將更大量的外膜突泡釋放到其培養基中，本發明的志賀氏菌可有利地包含相對于野生型菌株而言的一種或多種其它改變。這些改變尤其可用于從該細菌中去除在人疫苗中可具有毒性或不為所需的組分。例如，細菌可不表達天然志賀氏菌的脂多糖(LPS)，因此內毒素活性降低。可進行各種修飾以避免天然LPS的合成，這些修飾可破壞天然脂質A的結構、寡糖核心或外膜O抗原。例如，參考文獻3報道了通過rfe和galU基因失活導致的LPS突變體，參考文獻4報道了通過yihE、galE、galK、galM和galT失活導致的突LPS突變體。類似地，參考文獻5報道了因rfc、rfaL或galU突變導致的LPS缺陷。參考文獻6報道了因msbBl和msbB2失活導致的LPS突變體，其減少了脂質A的酰化作用。如本文所示，可通過htrB的失活產生脂質A酰化減少的另一種LPS突變體[7，8]。優選缺少LPS中的O抗原，從而避免血清型特異性的應答。在宋內志賀氏菌中，當毒性質粒被去除時，則缺少O抗原(見下文)。galU基因編碼尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖)焦磷酸化酶，該基因的失活導致所合成的LPS不含附著的(attached) O抗原。galU的失活有利于提供不具有尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性的志賀氏菌。rfbF和/或rftG基因的失活可用于提供不具有鼠李糖基轉移酶活性的志賀氏菌。rfc的失 活可用于提供不具有O抗原聚合酶活性的志賀氏菌。rfbF、rfbG和rfc這三種基因都失活可提供有用的菌株。優選缺少LPS中的六-酰化脂質A。失去毒性質粒(見下文)自動導致失去msbB2基因，染色體的msbBl基因可被失活，從而去除肉豆蘧酰基轉移酶活性，并在LPS中提供五-酰化脂質A。HtrB月桂酰基轉移酶的失活可提供主要含四-酰化脂質A的志賀氏菌。優選的菌株具有五-或四-酰化LPS。優選菌株的galU和msbBl均失活，且還缺少毒性質粒，由此提供LPS為五-酰化且缺少附著的O抗原的菌株。一些有用的菌株具有五-或四-酰化LPS，所述LPS包含附著的O抗原。然而更常規而言，優選菌株具有具有五-或四-酰化LPS，所述LPS缺少附著的O抗原。具有to IR、rfbG和htrB敲除(以及任選的rfbF和/或rfc失活)的福氏志賀氏菌菌株是有用的。一種有用的宋內志賀氏菌菌株具有tolR突變且缺少毒性質粒。細菌可不表達腸毒素。例如，福氏志賀氏菌菌株(具體為2a菌株)可不表達全部的志賀氏菌腸毒素I(ShET-I)亞單位，例如可使得setlA和/或setlB基因失活。痢疾志賀氏菌菌株可不表達全部兩種志賀氏菌毒素亞單位，例如可使得StxA和/或StxB基因中的一種或兩種失活。志賀氏菌，尤其是宋內志賀氏菌或福氏志賀氏菌，可不表達腸毒素2 (ShET-2)，例如可使得ospD3基因失活，或缺少毒性質粒。優選的菌株不編碼ShET_l、ShET-2和志賀氏菌毒素。可通過常規的誘變技術，從野生型或其它起始菌株方便地制備本發明的志賀氏菌，例如參見參考文獻9-11。λ Red重組系統(lambda red recombination system)是用于志賀氏菌的尤為有利的系統。可采用各種途徑獲得基因失活，例如通過其啟動子的缺失或突變，通過其起始密碼子的缺失或突變，通過導入提早形成終止密碼子(prematurestopcodon)，通過缺失整個編碼區域，通過敲除等。優選等基因敲除突變體。在所得的志賀氏菌中，缺少編碼所需基因的mRNA和/或其翻譯被抑制(例如抑制為少于野生型水平的I % )。本發明的志賀氏菌可包含代替失活基因的標記物基因，例如抗生素抗性標記物。其可通過同源重組完成。然而優選使用未標記的缺失(即不引入標記物基因的缺失)。毒性志賀氏菌菌株具有220kb的質粒，該質粒介導毒性性質。已顯示該〃毒性質粒"編碼涉及志賀氏菌毒性的數個方面的基因，這些方面包括用于靶向上皮細胞的細菌細胞表面配基、侵襲質粒抗原、virF, VirG等。本發明的志賀氏菌可具有毒性質粒，但優選其不具有毒性質粒。缺少該質粒可使得菌株在工業化培養中穩定、通過去除毒性因素而減毒(從而提高生產安全性)、破壞脂多糖(O抗原的生物合成基因位于志賀氏菌中的質粒上)、避免存在ShET-2腸毒素(由質粒上的ospD3或sen基因編碼)，以及避免存在msbB2，該基因是負責脂質A酰化的msbB基因的第二拷貝。 本發明的志賀氏菌可表達一種或多種異源蛋白，例如志賀氏菌中天然不存在的蛋白質。如果該異源蛋白是外膜蛋白，則來自該菌株的突泡可用作將非志賀氏菌抗原遞呈到免疫系統的遞送系統。使志賀氏菌生長的培養條件是本領域中熟知的，例如參見參考文獻12-14。例如，它們的培養可采用有機氮源(例如氨基酸混合物，如包含Ala、Arg、Asn、Asp ;可使用酪蛋白氨基酸)，以丙三醇為碳源等等。在培養基中加入L-天冬氨酸尤為有利，其可同時作為氮源和碳源。可在限鐵(iron-limiting)條件下有利地培養本發明的志賀氏菌，已顯示這些條件可上調志賀氏菌屬中具有免疫原性且高度保守的鐵調蛋白。例如，可在諸如去鐵靈(desferal)或2，2’ -聯吡啶基或8_羥基喹啉的化合物存在下培養細菌。在這些條件下，細菌可提高蛋白質(例如F印A外膜受體、大腸桿菌素I受體(CirA)和/或鐵嗜鐵素受體 (FhuA))的表達。突泡和高起泡性本發明的志賀氏菌與其相應的野生型菌株相比，具有高起泡性，即它們把與野生型菌株相比更大量的突泡釋放到其培養基中。這些突泡可用作志賀氏菌疫苗的組分。由電子顯微鏡測得的突泡直徑通常為35-120nm，例如50nm的直徑。突泡在細菌培養過程中自發釋放，并可從該培養基中純化。理想的純化包括從活的和/或完整的志賀氏菌中分離突泡,例如通過采用過濾器(例如O. 22 μ m的過濾器)的基于大小的過濾，該過濾器允許突泡通過但不允許完整細菌通過，或通過使用低速離心使細胞沉淀而將突泡留在懸液中。因此，與培養基不同，本發明的含突泡組合物通常基本上不含活的或死的全菌。突泡的大小意味著它們可通過過濾(例如象通常用于過濾滅菌的過濾)簡便地與全菌分離。雖然突泡可濾過標準的O. 22 μ m過濾器，它們會很快被其它物質阻塞，因此在使用O. 22 μ m過濾器之前進行濾過一系列具有降低的孔徑的過濾器的過濾除菌循序步驟是有利的。之前過濾器的例子包括具有O. 8 μ m、0. 45 μ m等孔徑的過濾器。從培養基中分離自發釋放的突泡比涉及故意破壞外膜(例如通過去污劑除了處理或超聲作用)以形成外膜小囊泡的方法更為簡便。此外，它們基本上不含內膜和細胞質污染物。本發明的突泡包含脂質和蛋白質。已分析了突泡的蛋白質內容物，它們包括表I中所列和下文所討論的蛋白質。志賀氏菌外膜蛋白表I列出了本發明的志賀氏菌突泡中檢測到的129種蛋白質的GenBank名稱和GI號。這127種蛋白質可從突泡中分離、以純化的形式用作免疫原性成分。這129種蛋白質中的優選亞組是表中的前60種(“亞組3” )。可通過多種方式制備多肽，例如通過化學合成(至少部分合成)，通過用蛋白酶消化較長的多肽，通過RNA翻譯，通過從細胞培養物純化(例如從重組表達或從志賀氏菌培養物)等等。在大腸桿菌宿主中進行異源表達是優選的表達途徑。
本發明的多肽可附著于或固定于固相載體。本發明的多肽可包含可檢測標記物，例如放射性標記物、熒光標記物、或生物素標記物。這在免疫分析技術中尤為有用。多肽可以各種形式存在(例如天然的、融合的、糖基化的、非糖基化的、脂化的、具有_■硫橋等等)。多妝優選為志賀氏菌多妝。優選以基本上純或基本上分離的形式(即基本上不含其它志賀氏菌或宿主細胞多肽)或基本上分離的形式制備多肽。總體而言，所提供的多肽處于非自然存在環境，例如它們從其天然存在環境中分離。在某些實施方式中，對象肽存在于與對照相比富含該多肽的組合物中。由此，提供了純化的多肽，其中“純化的”是指該多肽存在于基本上不含其它表達的多肽的組合物中，且其中“基本上不含”是指該組合物的少于50%，通常少于30%，更通常少于10%是由其它表達的多肽構成的。術語“多肽”是指任何長度的氨基酸聚合物。該聚合物可為線性或分支的，其可包 含修飾的氨基酸，且其可被插入有非氨基酸。該術語還包括已被天然修飾或被干擾的氨基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、糖基化、脂化、酰化、磷酸化或其它操作或修飾，例如與標記組分偶聯。在該定義中還包括例如，含一個或多個氨基酸類似物(包括例如，非天然氨基酸等)以及本領域中已知的其它修飾的多肽。多肽可作為單鏈存在或作為相結合的鏈存在。藥物組合物本發明提供了一種藥物組合物，其包含(a)本發明的突泡；以及(b)藥學上可接受的載體。本發明還提供一種制備該組合物的方法，所述方法包括將本發明的突泡與藥學上可接受的載體混合的步驟。本發明還提供了一種藥物組合物，其包含(a)如上所定義的不含突泡的免疫原性組合物；以及(b)藥學上可接受的載體。免疫原性組合物可包含藥學上可接受的載體，所述載體可為本身不會誘導產生對接受該組合物的患者有害的抗體的任何物質，且在給予時不會產生過度的毒性。藥學上可接受的載體可包括液體，例如水、鹽水、丙三醇和乙醇。在此類載體中還可存在輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑，PH緩沖物質等。關于適合的載體的全面討論可參見參考文獻15。志賀氏菌感染可影響身體的各種區域，因此可將本發明的組合物制成各種形式。例如，可將該組合物制成作為液態溶液或懸浮液的可注射形式。還可制備適于在注射前溶于或懸浮于液體載劑中的固體形式。可將該組合物制成用于局部給藥，例如制成軟膏、乳膏或粉末。可將該組合物制成用于口服給藥，例如制成片劑或膠囊，或制成糖漿(任選經調味)。可將該組合物制成用于肺部給藥，例如制成吸入劑，使用細粉或噴霧器。可將該組合物制成栓劑或陰道栓。可將該組合物制成用于經鼻、經耳或經眼給藥，例如制成滴劑。優選該組合物是無菌的。優選其無熱原。優選其經緩沖，例如pH為6-8，通常為PH7左右。用于人時，本發明的組合物可為等滲組合物。免疫原性組合物包含免疫有效量的免疫原，以及所需的任何其它特定組分。“免疫有效量”是指將該量以單劑量或系列中的部分給予個體可有效治療或預防。該量的變化取決于待治療個體的健康和生理狀況、年齡、待治療個體的分類群(例如非人靈長類，靈長類等)、個體免疫系統對綜合抗體的容量、所需的保護程度、疫苗的制劑、治療醫師對醫療情況的評估、以及其它相關因素。預期該量的范圍較寬，該范圍可通過常規試驗確定。采用小囊泡疫苗(例如用于腦膜炎球菌)的早先工作為突泡給藥提供了藥學、劑量學和制劑指導。本發明組合物中突泡的濃度通常為10-500μ g/ml，優選25-200 μ g/ml，更優選約50 μ g/ml或約100 μ g/ml (就突泡中的總蛋白而言)。用于注射的劑量體積通常為 O. 5ml ο該組合物可與其它免疫調節劑聯合給藥。可用于本發明組合物(尤其是無突泡組合物)中的佐劑包括但不限于A.含無機物組合物適于用作本發明中的佐劑的含無機物組合物包括無機鹽，例如鋁鹽和鈣鹽。本發明包括無機鹽，例如氫氧化物(如氫氧化合物)、磷酸鹽(例如羥基磷酸鹽,正磷酸鹽)、硫酸鹽等[例如參見參考文獻19的第8和9章]，或不同無機化合物的混合物，其中化合物可為任何形式(例如凝膠、結晶、無定形等)，優選吸附。還可將含無機物組合物配制為金屬鹽顆粒。被稱為“氫氧化鋁”的佐劑是常規的氫氧化鋁氧化物的鹽，其通常至少部分結晶化。氫氧化鋁氧化物(可由式AlO(OH)表示)可通過紅外(IR)光譜與其它鋁化合物(例如氫氧化鋁Al (OH) 3)區分開，尤其可通過lOTOcnr1處的吸收帶和3090-3100( ^處的強肩峰的存在來區分[參考文獻19第9章]。半峰高處的衍射帶寬度(WHH)反映出氫氧化鋁佐劑 的結晶度，結晶差的顆粒由于具有較小的微晶尺寸而顯示出較大的譜線增寬。當WHH增加，表面積增加，具有較高WHH值的佐劑已顯示出具有較大的抗原吸附容量。氫氧化鋁佐劑通常呈纖維形態(fibrous morphology,例如在透射電子顯微照片中所見)。氫氧化招佐劑的Pl通常為11，即在生理pH下，該佐劑本身具有表面正電荷。已報道氫氧化鋁佐劑在pH7. 4時的吸附容量為I. 8-2. 6mg蛋白質/mgAl+++。稱為“磷酸鋁”的佐劑通常是羥基磷酸鋁，常還含有少量硫酸鹽(即羥基磷酸硫酸鋁)。其可通過沉淀獲得，沉淀期間的反應條件和濃度影響磷酸根取代所述鹽中羥基的程度。羥基磷酸鹽中P04/A1摩爾比通常在0.3-1. 2之間。羥基磷酸鹽因存在羥基而有別于嚴格的A1P04。例如，3164CHT1處的IR譜帶(例如在200° C)表明結構性羥基的存在[參考文獻19第9章]。磷酸鋁佐劑的P04/A13+摩爾比通常為0. 3-1. 2，優選為0. 8-1. 2，更優選為0.95±0.1。磷酸鋁通常是無定形的，尤其是羥基磷酸鹽。典型的佐劑是P04/A1摩爾比為0. 84-0. 92的無定形的羥基磷酸鋁，包含0. 6mg Al3+/ml。磷酸鋁通常是顆粒狀(如在透射電子顯微照片上觀察到的片狀形態)。在任何抗原吸附后，顆粒的典型直徑為0. 5-20 μ m(例如約5-10 μ m)。已報道氫氧化鋁佐劑在pH7. 4時的吸附容量為0. 7-1. 5mg蛋白質/mgAl+++。磷酸鋁的零電點(PZC)與磷酸根取代羥基的程度逆相關，這種取代程度可根據用于通過沉淀制備鹽的反應條件和反應物濃度而變化。也通過改變溶液中游離磷酸根離子的濃度(更多磷酸根=更酸性的PZC)或加入緩沖劑(如組氨酸緩沖劑)(使PZC堿性更強)改變PZC。本發明所用的磷酸鋁的PZC通常為4. 0-7. 0，更優選為5. 0-6. 5，例如約為5. 7。用于制備本發明組合物的鋁鹽懸浮液可以含有緩沖液(如磷酸鹽或組氨酸或Tris緩沖液)，但這并不一直是必需的。該懸浮液優選無菌且無熱原。懸浮液可含有游離的水性磷酸根離子，如存在濃度為I. 0-20mM，優選5-15mM，更優選約10mM。該懸浮液也可含有氯化鈉。在一個實施方式中，佐劑組分包括氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物。在該情況下，磷酸鋁的量多于氫氧化鋁，例如重量比至少為2:1，例如彡5: I、彡6: I、彡7: I、彡8: I、彡9:1等。給予患者的組合物中Al+++的濃度優選小于10mg/ml,例如，(5mg/ml>^ 4mg/ml、< 3mg/ml、< 2mg/ml、< lmg/ml 等。優選范圍是(λ 3-lmg/ml。優選最大值是〈0. 85mg/劑。B.油乳劑適用作本發明的佐劑的油 乳劑組合物包括鯊烯-水乳劑，例如MF59 [參考文獻19的第10章；還可參見參考文獻16] (5%鯊烯、O. 5%吐溫80、和O. 5%司盤85，用微流化床配制成亞微米顆粒)。也可以使用完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)。已知各種適合的水包油乳劑，它們通常包括至少一種油和至少一種表面活性劑，所述油和表面活性劑是可生物降解(可代謝)和生物相容的。乳劑中油滴的直徑通常小于
5μ m,優選乳劑包含具有亞微米直徑的油滴，通過微流化床實現這種小尺寸以提供穩定乳齊U。優選尺寸小于220nm的液滴，因為可對其進行過濾滅菌。本發明可使用油，例如來自動物(如魚)或植物來源的油。植物油的來源包括堅果、種籽和谷物。最常用的花生油、大豆油、椰子油和橄欖油是堅果油的示例。也可使用獲自(例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。種籽油包括紅花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物類中，最常用的是玉米油，但也可以使用其它谷類的油，如小麥、燕麥、黑麥、稻、畫眉草、黑小麥等。可從堅果和種籽油開始，通過水解、分離和酯化合適物質制備甘油和1，2_丙二醇的6-10碳脂肪酸酯，其不是種籽油中天然存在。來自哺乳動物乳汁的脂肪和油類是可代謝的，因此可以用于實施本發明。獲得動物來源純油所必需的分離、純化、皂化和其它方法的過程為本領域熟知。大多數魚類含有容易回收的可代謝油。例如，鱈魚肝油、鯊魚肝油和鯨油(例如鯨蠟)是可以用于本發明的幾種魚油的示例。通過生化途徑用5-碳異戊二烯單位合成許多支鏈油，其總稱為萜類。鯊魚肝油含有稱為鯊烯的支鏈不飽和萜類化合物，即2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯。其它優選油是生育酚(見下文)。包含鯊烯的水包油乳劑是特別優選的。可以使用油的混合物。可通過’ HLB’ (親水/親脂平衡)對表面活性劑分類。本發明優選的表面活性劑的HLB為至少10，優選至少15，更優選至少16。本發明可與表面活性劑一起使用，所述表面活性劑包括但不限于聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性劑(通常稱為吐溫)，特別是聚山梨酯20和聚山梨酯80 ;以商品名D0WFAXTM出售的環氧乙烷(EO)、環氧丙烷(PO)和/或環氧丁烷(BO)的共聚物，如直鏈EP/PO嵌段共聚物；重復的乙氧基(氧-1,2-乙二基)數量不同的辛苯聚醇，特別感興趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton)X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40);磷脂，如磷脂酰膽堿(卵磷脂)；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(稱為芐澤(Brij)表面活性劑)，如三乙二醇單月桂基醚(芐澤30);以及去水山梨糖醇酯(總稱為司盤(Span))，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盤85)和去水山梨糖醇單月桂酸酯。乳劑中包含的優選表面活性劑是吐溫80 (聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯)、司盤85 (脫水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。如上所述，吐溫80等去污劑可提供下文實施例所見的熱穩定性。可使用表面活性劑的混合物，如吐溫80/司盤85混合物。聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯，吐溫80)和辛苯聚醇(如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇，曲通x-100)的組合也適合。另一種有用的組合包含月桂醇聚醚-9 (Iaureth 9)加聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。表面活性劑的優選量(重量％)為聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐溫80)0. 01-1%，特別是約O. 1% ;辛基-或壬基-苯氧基聚氧乙醇(如曲通x-100或曲通系列的其它去污劑)O. 001-0. 1%，特別是O. 005-0. 02% ;聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0. 1-20%,優選O. 1_10%，特別是O. 1-1%或約O. 5%。可用于本發明的特定水包油乳劑佐劑包括但不限于 鯊烯、吐溫80和司盤85的亞微米乳劑。所述乳劑的體積組成可以是約5%鯊烯、約O. 5%聚山梨酯80和約O. 5%司盤85。以重量計，這些比例為4. 3%鯊烯、O. 5%聚山梨酯80和O. 48%司盤85。這種佐劑稱為‘MF59’ [16-18]，參考文獻19的第10章和參考文獻20的第12章更詳細地描述了該佐劑。MF59乳劑優選包含檸檬酸根離子，如IOmM檸檬酸鈉緩沖液。 包含鯊烯、α -生育酚和聚山梨酯80的乳劑。這些乳劑可含有2_10%鯊烯、2_10% 生育酚和O. 3-3%吐溫80，鯊烯生育酚的重量比優選彡I (例如O. 90)，因為這能使乳劑更穩定。鯊烯和吐溫80的體積比可以約為5:2，或者重量比約為11:5。可通過下述方法制備一種這樣的乳劑將吐溫80溶解于PBS得到2%溶液，然后將90ml該溶液與(5g DL- α -生育酚和5ml鯊烯)的混合物混合，然后使該混合物微流體化。所得乳劑可含有亞微米油滴，如平均直徑為100-250nm，優選約180nm的亞微米油滴。·鯊烯、生育酚和曲通去污劑(如曲通X-100)的乳劑。所述乳劑還可包含3d-MPL(見下文)。所述乳劑可包含磷酸鹽緩沖液。 含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污劑(如曲通X-100)和生育酚(如琥珀酸α-生育酚)的乳劑。所述乳劑可包含比例為75:11:10(例如750μ8/πι1聚山梨酯80，110 μ g/ml曲通X-100和100 μ g/ml的琥珀酸α -生育酚)的這三種成分，且這些濃度可包含由抗原中的這些組分做出的任何貢獻。所述乳劑還可包含鯊烯。所述乳劑還可包含3d-MPL(見下文)。水相可包含磷酸鹽緩沖液。 鯊烯、聚山梨酯80和泊洛沙姆401 ( “普朗尼克(Pluronic) L121”)的乳劑。所述乳劑可用PH 7. 4的磷酸鹽緩沖鹽水配制。該乳劑是一種有用的胞壁酰二肽遞送載體，且已與含蘇氨酰基-MDP —起在“SAF-1”佐劑中使用[21] (O. 05_l%Thr_MDP、5%鯊烷、2. 5%普朗尼克L121和O. 2%聚山梨酸酯80)。也可不與Thr-MDP —起使用，如在“AF”佐劑中[22](5%鯊烯、I. 25%普朗尼克L121和O. 2%聚山梨酸酯80)。優選進行微流體化。 含有鯊烯、水性溶劑、聚氧乙烯烷基醚親水性非離子表面活性劑(例如聚氧乙烯
(12)鯨蠟硬脂醚)和疏水性非離子表面活性劑(例如脫水山梨糖醇酯或二縮甘露醇酯，例如去水山梨糖醇單油酸酯或“司盤80”)。乳劑優選為熱可逆的和/或至少90%的油滴(以體積計)的尺寸小于200nm[23]。乳劑還可包含一種或多種如下物質醛糖醇；低溫防護劑(例如糖，如十二烷基麥芽糖苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷。可冷凍干燥該乳劑。 含有O. 5 50%油、O. I 10%磷脂和O. 05 5%非離子表面活性劑的乳劑。如參考文獻24所述，優選的磷脂組分是磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心肌磷脂。亞微米的微滴尺寸是有利的。·不可代謝的油(例如輕質礦物油)和至少一種表面活性劑(例如卵磷脂、吐溫80或司盤80)的亞微米水包油乳劑。可加入添加劑,例如阜樹A阜式(QuilA saponin)、膽固醇、皂甙-親脂性偶合物(例如GPI-0100，描述于參考文獻25，通過葡萄糖醛酸的羧基將脂族胺添加到脫乙酰基皂甙而產生)、溴化二甲基雙十八烷基銨和/或N，N-雙十八烷基-N，N-(2-羥乙基)丙二胺。 包含礦物油、非離子親脂性乙氧基化脂肪醇、非離子親水表面活性劑(例如乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳劑[26]。·包含礦物油、非離子親水性乙氧基化脂 肪醇、和非離子親脂性表面活性劑(例如乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳劑[26].·所含皂甙(例如QuilA或QS21)和固醇(例如膽固醇)結合成螺旋狀膠束的乳劑[27]。通常，在遞送給病人時，組合物中的抗原和佐劑是混合的。乳劑可以在生產過程中與抗原混合，或是在遞送時將該乳劑與抗原臨時混合。因此，在包裝或出售的疫苗中，該佐劑和抗原可分開保存，使用時配制成最終制劑。所述抗原通常是水性形式，從而最終通過混合兩種液體制備疫苗。用于混合的兩種液體的體積比是可變的(例如5:1至1:5)，但通常約為1:1。C.皂苷制劑「參考文獻19的第22章I皂苷制劑也可以用作本發明的佐劑。皂苷是在許多種類植物的樹皮、葉、莖干、根/甚至花中發現的留醇糖苷和三萜葡萄糖苷的異質群體。已廣泛研究了作為佐劑的得自皂皮樹(Quillaia saponaria Molina)樹皮的阜苷。阜苷也可商業化獲自麗花菝葜(Smilaxornata)(墨西哥菝葜)、滿天星(Gypsophilla paniculata)(婚紗花)和肥阜草(Saponariaofficianalis)(皂根)。皂苷佐劑制劑包括純化的制劑，如QS21，以及脂質制劑，如ISC0M。QS21以商標Stimulon 出售。已采用HPLC和RP-HPLC純化皂苷組合物。已鑒定了用這些技術純化的特定組分，包括037、0317、0318、0321、0!^、0!1-8和職-(。所述皂苷優選為QS21。制備QS21的方法參見參考文獻28。皂苷制劑也可包含留醇，如膽固醇[29]。皂苷和膽固醇的組合可用于形成稱為免疫刺激復合物(ISCOM)的獨特顆粒(參見參考文獻19的第23章；也可參見參考文獻30和31)。ISCOM通常還包含磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿。任何已知的皂苷均可用于ISCOM中。ISCOM優選包含QuilA、QHA和QHC中的一種或多種。任選地，ISCOM可不含其它去污劑[32]。關于基于皂苷的佐劑開發的綜述可參見參考文獻33和34。P.細菌或微牛物衍牛物適用于本發明的佐劑包括細菌或微生物衍生物，例如腸細菌脂多糖(LPS)的無毒衍生物、脂質A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物。LPS的無毒衍生物包括單磷酰脂質A (MPL)和3_0_脫酰基MPL (3dMPL)。3dMPL是3脫-O-酰基單磷酰脂質A與4、5或6條酰化鏈的混合物。3脫-O-酰基單磷酰脂質A的優選“小顆粒”形式見參考文獻35中所述。3dMPL的此類“小顆粒”小到足以在過濾除菌時通過0. 22 μ m的膜[35]。其它無毒LPS衍生物包括單磷酰脂質A模擬物，如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸鹽衍生物，例如RC-529[36，37]。脂質A衍生物包括大腸桿菌的脂質A衍生物，如0M-174。例如參考文獻38和39中描述了 0M-174。
適合用作本發明佐劑的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列(含有通過磷酸鍵與鳥苷連接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含回文結構或聚(dG)序列的雙鏈RNA和寡核苷酸也顯示具有免疫刺激作用。CpG可包含核苷酸修飾/類似物，如硫代磷酸酯修飾，可以是雙鏈或單鏈。參考文獻40、41和42公開了可能的類似取代，例如用2’ -脫氧-7-脫氮鳥苷取代鳥苷。參考文獻43-48中進一步討論了 CpG寡核苷酸的佐劑作用。CpG序列可能導向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT [49]。CpG序列可特異性誘導Thl免疫應答，例如CpG-A 0DN,或更特異地誘導B細胞應答，例如CpG_B0DN。參考文獻50-52 中討論了 CpG-A 和 CpG-B ODN。優選 CpG 為 CpG-A ODN。優選構建CpG寡核苷酸，從而使得5’末端易被受體識別。任選使兩個CpG寡核苷酸序列在3’末端連接以形成“免疫聚體(immunomer) ”。參見,例如參考文獻53-55。 基于免疫刺激性寡核苷酸的特別有用的佐劑被稱為IC-31 [56-58]。因此，本發明使用的佐劑可以包含(i)和(ii)的混合物(i)含有至少一個(優選多個)CpI基序(即胞嘧啶與肌苷相連形成二核苷酸)的寡核苷酸(例如15-40個核苷酸)，和(ii)聚陽離子聚合物，如含有至少一個(優選多個)Lys-Arg-Lys三肽序列的寡肽(如5_20個氨基酸)。所述寡核苷酸可以是包含26-聚體序列5’-(IC) 13-3’ (SEQ ID NO: 7)的脫氧核苷酸。聚陽離子聚合物可以是含有11-聚體氨基酸序列KLKLLLLLKLK的肽(SEQ ID N0:6)。SEQ IDNO:6和7的組合提供了 IC-31 佐劑。細菌ADP-核糖基化毒素及其去毒衍生物可以用作本發明的佐劑。優選所述蛋白質衍生自大腸桿菌(大腸桿菌不耐熱腸毒素“LT”)、霍亂菌(“CT”)或百日咳菌(“PT”)。參考文獻59中描述了將脫毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐劑,參考文獻60中描述了將其用作胃腸道外佐劑。所述毒素和類毒素優選全毒素形式，包含A和B亞單位。A亞單位優選含有脫毒突變亞單位優選不突變。所述佐劑優選為脫毒的LT突變體，如LT-K63、LT-R72和LT-G192。參考文獻61-68中描述了將ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72用作佐劑。一種有用的CT突變體是CT_E29H[69]。氨基酸取代的編號優選基于參考文獻70中提出的ADP-核糖基化毒素的A和B亞單位的比對,該參考文獻的全部內容特別納入本文作為參考E.人免疫調節劑適合用作本發明佐劑的人免疫調節劑包括細胞因子，如白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL_6、IL_7、IL-12 [71]等)[72]、干擾素(例如干擾素-Y )、巨噬細胞集落刺激因子和腫瘤壞死因子。優選的免疫調節劑是IL-12。F.生物粘著劑和粘膜粘著劑生物粘著劑和粘膜粘著劑也可以用作本發明的佐劑。合適的生物粘著劑包括酯化透明質酸微球[73]或粘膜粘著劑，如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纖維素、聚(丙烯酸)的交聯衍生物。殼聚糖及其衍生物也可用作本發明的佐劑[74]。G.微粒微粒也可以用作本發明的佐劑。微粒(即直徑為 IOOnm至 150 μ m，更優選直徑 200nm至 30 μ m,最優選直徑 500nm至 10 μ m的顆粒)由生物可降解的無毒材料(例如，聚(α-羥酸)、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己內酯等)形成，優選聚丙交酯乙交酯共聚物，并任選經處理而具有帶負電表面(例如用SDS處理)或帶正電表面(例如用陽離子去污劑如CTAB處理)。H.脂質體(參考文獻19的第13和14章)適于用作佐劑的脂質體制劑的例子見參考文獻75-77所述。
I.咪嗶并暗諾酮(Imidazoauinolone)化合物適合用作本發明佐劑的咪唑并喹諾酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系物(例如，〃瑞喹莫德3M")，見參考文獻78和79所述。本發明也可包含以上說明的一種或多種佐劑各方面的組合。例如，可將以下佐劑組合物用于本發明(1)皂苷和水包油乳劑[80] ；(2)皂苷(如QS21) +無毒LPS衍生物(如3dMPL) [81] ； (3)皂苷(如QS21) +無毒LPS衍生物(如3dMPL) +膽固醇；(4)皂苷(如QS21)+3dMPL+IL12(任選+固醇)[82] ; (5) 3dMPL與(例如)QS21和/或水包油乳劑的組合； (6) SAF,含有10%鯊烯、O. 4%吐溫80 、5%普朗尼克-嵌段聚合物L121和thr_MDP，微流體化成為亞微米乳劑或渦旋振蕩產生粒度較大的乳劑；(7) Ribi 佐劑系統(RAS)(瑞比免疫化學公司(Ribi Immunochem))，含有2%鯊烯、O. 2%吐溫80和一種或多種細菌細胞壁組分，所述組分選自單磷酰脂質A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)或細胞壁骨架(CWS)，優選MPL+CWS(Detox );和(8) —種或多種無機鹽(如鋁鹽)+LPS的無毒衍生物(如3dMPL)。用作免疫刺激劑的其它物質可參見參考文獻19的第7章。可用氫氧化鋁佐劑，抗原通常吸附在該鹽上。還優選包含鯊烯的水包油乳液，其具有亞微米油滴，尤其是在年長者中。有用的佐劑組合包括Thl和Th2佐劑的組合，如CpG和鋁鹽，或瑞喹莫德和鋁鹽。可使用鋁鹽和3dMPL的組合。免疫法除提供上述免疫原性組合物外，本發明還提供一種在哺乳動物中引起抗體應答的方法，包括將本發明的免疫原性組合物給予所述哺乳動物。所述抗體應答優選地為保護性抗體應答。本發明還提供用于這類方法中的本發明組合物。本發明還提供了一種保護哺乳動物免受志賀氏菌感染和/或疾病(例如志賀氏菌痢、賴特綜合征和/或溶血性尿毒癥綜合征)的方法，包含將本發明中的免疫原性組合物給予所述哺乳動物。本發明提供用作藥物(例如，用作免疫原性組合物或疫苗)的本發明組合物。本發明還提供本發明的囊泡在制備防止哺乳動物中志賀氏菌感染的藥物中的應用，例如用于預防志賀氏菌痢、賴特綜合征和/或溶血性尿毒癥綜合征。還提供本發明的突泡蛋白(如前所述)在制備防止哺乳動物中志賀氏菌感染的無突泡藥物中的應用，例如用于預防志賀氏菌痢。哺乳動物優選為人。所述人可以是成人，或優選是兒童。當預防性使用疫苗時，人優選為兒童(如幼童或嬰兒)；當疫苗用于治療用途時，人優選為成人。準備給予兒童的疫苗也可給予成年人，例如用以評估安全性、劑量、免疫原性等。所述用途和方法特別適用于預防/治療疾病，這些疾病包括但并不限于志賀氏菌痢、賴特綜合征和/或溶血性尿毒癥綜合征。治療性措施的功效可以通過在給予本發明中的組合物后對志賀氏菌感染進行監測來測試。可通過監測在施用組合物后針對突泡中免疫原性蛋白或其它抗原的免疫應答來測試預防性治療的效力。本發明組合物的免疫原性可通過以下方法測定將其給予受試對象(如12-16個月大的兒童)，然后測定標準血清學參數。這些免疫應答通常在給予該組合物后約4周測定，并與給予該組合物之前測定的值作比較。當給予一劑以上的組合物時，可以進行一次以上的給藥后測定。本發明的組合物通常直接給予患者。可以通過胃腸外注射(例如，皮下、腹膜內、靜脈內、肌肉內或給予到組織間隙)，或通過直腸、口服、陰道、局部、透皮、鼻內、眼部、耳部、肺部或其它粘膜給藥途徑完成直接遞送。優選在大腿或上臂進行肌肉內給藥。注射可以通過針頭(例如皮下針頭)進行，但也可以采用無針注射。通常的肌肉內劑量約為O. 5ml。本發明可用來引發全身和/或粘膜免疫。劑量治療可采用單劑量方案或多劑量方案。多劑量可以用于初次免疫方案和/或加強免疫方案。初次給藥方案之后，可以進行加強給藥方案。可以常規地確定初次劑量之 間(例如4-16周)以及初次和加強劑量之間的適當時機。概述術語“包含”涵蓋“含有”以及“由……組成”，例如“包含” X的組合物可僅由X組成或可含有其它物質，例如X+Y。與數值X相關的術語“約”是任選的，其表示(例如)x±10%。詞語“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的組合物可能完全不含Y。在必要時，詞語“基本上”可從本發明的定義中省略。兩條氨基酸序列間的序列相同性百分數表示進行比對時，所比較的兩條序列中相同氨基酸的百分數。利用本領域所知軟件程序，例如參考文獻84的7. 7. 18部分所描述的軟件程序，可進行比對并確定同源性百分數或序列相同性百分數。優選通過史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)同源性搜索算法進行比對,該算法使用仿射缺口搜索(affine gapsearch)，其中缺口開放罰12分，缺口延伸罰2分，BLOSUM矩陣計62分。參考文獻85中公開了史密斯-沃特曼同源性搜索算法。上文使用“GI”編號。GI號或者“基因信息識別號”(GenInfo Identifier)是NCBI將序列加入其數據庫時，連續對每一序列記錄指定的一串數字。GI編號與序列記錄登錄號沒有相似之處。序列更新(如糾正或加入更多注釋或信息)后，將接受新GI編號。因此與給定GI編號相關的序列是不變的。當本發明涉及“表位”時，該表位可以是B細胞表位和/或T細胞表位。可憑經驗鑒定此類表位(如使用PEPSCAN[86，87]或相似方法)，或可對其進行預測(如使用詹姆森-沃爾夫抗原性指數(Jameson-Wolf antigenic index) [88]、基于矩陣的方法[89]、MAPIT0PE[90]、TEPIT0PE[91,92]、神經網絡[93]、OptiMer 和 EpiMer [94，95]、ADEPT [96]、T位點[97]、親水性[98]、抗原性指數[99]或參考文獻100-101中公開的方法等)。表位是抗體或T細胞受體的抗原結合位點識別并結合的抗原的某部分，它們也稱作“抗原決定簇”。附圖
簡述圖I顯示了從培養基中純化的本發明突泡的電子顯微鏡照片。圖2顯示了來自宋內志賀氏菌AtolRAgalU的突泡的2D SDS-PAGE。圖3顯示了不同所示菌株突泡的LPS (用抗核心抗體染色)。
圖4顯示了用被免疫小鼠的血清2D分離的突泡蛋白質的免疫斑點印跡。圖5顯示了不同條件下生長的細菌的SDS-PAGE。圖6顯示了突泡中的吸附蛋白。從左到右的泳道為1)蛋白質分子量標記物，2)Ss OMB 10 μ g, 3) Ss OMB 2μ g,4)吸附在明礬上 I 個月的 Ss OMB 10 μ g。圖7顯示了所示菌株的FACS數據。本發明的
具體實施例方式宋內志賀氏菌突變體的制備采用λ Red系統，使得野生型宋內志賀氏菌53G的tolR基因缺失[11，102]。制備用λ Red質粒轉化的感受態細胞，然后通過同源重組，用設計以抗生素抗性基因替換tolR基因的線性片段轉化。通過對抗生素的抗性選擇已整合該片段的克隆，通過PCR或其它技 術驗證tolR的缺失。然后可通過在37° C培養新克隆，去除溫度敏感性λ Red質粒。已確證了在該AtolR突變體中TolR表達的缺少，與原先的野生型分離物相比，已驗證該突變體在生長過程中將更多的突泡釋放到培養基中。用類似的途徑使得galU基因缺失，以提供AgalU單突變體和AtolR AgalU雙突變體。經驗證突變體釋放的突泡具有缺少O抗原的缺陷型LPS。用相同的方法制備帶有修飾LPS的Λ tolR AmsbB雙突變株。還從AtolR和AtolRAmsbB菌株中去除了毒性質粒。福氏志賀氏菌突變體的制備如上針對宋內志賀氏菌所述，采用λ Red系統使得福氏志賀氏菌的tolR基因缺失。福氏志賀氏菌中O抗原的生物合成通過包含部分rfbF和rfc以及完整rfbG基因的染色體片段的缺失(該缺失導致這三種基因全部失活)而被徹底破壞。采用λ Red系統產生缺失，并縮寫為ArfbG。以相同的方式產生AtolR Λ rfbG雙突變體。以相同的方式產生包含修飾的LPS的AtolR Λ htrB雙突變體。已從這些菌株中去除了毒性質粒。突泡的純化在以下條件下進行雙突變體AtolR AgalU菌株的發酵pH 7. 1,37° C，通過受控的攪拌和設置最大充氣量將溶氧保持在30%的飽和度。通過加入4M氫氧化銨控制pH。通過在發酵過程中加入10% PPG控制泡沫。培養基由以下組分組成KH2P045g/l，K2HP0420g/I和酵母提取物30g/l。采用高壓滅菌對培養基進行滅菌后，加入甘油15g/l和MgS042mM，然后進行接種。培養接種物為發酵罐體積的5%。發酵過程進行約13個小時，以600nm下的光學密度確定細胞濃度。采用以下所定義的培養基進行宋內志賀氏菌AtolRAmsbB雙突變株的發酵過程甘油 30g/l，KH2PO413. 3g/l，(NH4)2HP044g/l，MgSO4 · 7H20 (IM) 2ml，檸檬酸 I. 7g/l，CoCl2 · 6H20 2. 5mg/l，MnCl2 · 4H20 15mg/l，CuCl2 · 2H20 I. 5mg/l，H3B033mg/l，Na2Mo04 · 2H202. 5mg/l，Zn (CH3COO) 2 · 2H20 13mg/l，檸檬酸鐵 2 μ M，硫胺素 50mg/l，煙酸 10mg/l，L-天冬氨酸 2. 5g/l。采用兩個連續TFF(正切流動過濾)步驟純化在發酵液中產生的小囊泡以O. 22 μ m進行微過濾，然后以O. I μ m進行第二次微過濾。在第一次過濾步驟中，通過經O. 22 μ m孔徑過濾盒的TFF從生物質中分離出小囊泡。先將該生物質濃縮4倍，用PBS進行5次透析過濾步驟后，在過濾液中收集小囊泡。在第二次過濾步驟中，使得從O. 22ymTFF獲得的過濾液進一步經O. Iym截留過濾盒進行微過濾，以從溶解蛋白質中純化小囊泡。小囊泡不能通過過濾盒。經過5次透析過濾步驟后，收集含有小囊泡的保留物。用TEM觀察最終純化產物(圖I)。突泡具有約50nm直徑的均一尺寸。在與培養宋內志賀氏菌AtolRAgalU相同的酵母提取物培養基中培養各種菌株，然后以相同的方式純化來自福氏志賀氏菌突變體的突泡。突泡的表征通過蛋白質組方法證實了突泡為基本上純的外膜。與通過破壞外膜獲得的常規外膜囊泡(OMV)不同，所述突泡保留親脂蛋白且基本上不含細胞質和內膜組分，.用去污劑使得來自宋內志賀氏菌和福氏志賀氏菌菌株的突泡變性，并用LC-MS/MS 方法鑒別蛋白質。或者，用SDS PAGE電泳或2D凝膠電泳分離突泡(圖2)。從凝膠上切取可見條帶和斑點，通過蛋白質質量指紋分析鑒定蛋白質。用密度計分析SDA-PAGE條帶或來自2D凝膠的斑點研究不同蛋白質的相對量。圖3顯示了 AgalU突變株與野生型志賀氏菌和大腸桿菌(所有菌株均為AtolR背景)相比的LPS遷移率的改變。采用基于表面消化的第二蛋白質組方法來表征膜蛋白的暴露部分。鑒定了與經突泡免疫的小鼠的血清反應的一系列蛋白質，已發現其中有多種蛋白質在許多菌株中是保守的。對于大部分完整外膜蛋白所知甚少。如下研究突泡的表在蛋白質組(surfome):用蛋白酶處理，回收，然后通過LC-MS/MS鑒定釋放的肽。由于突泡應代表了活的整菌細胞的表面，該圖譜可代表宋內志賀氏菌表面上暴露的蛋白質。通過這些方法和其它方法，在突泡中發現了表I中所列的129種蛋白質。突泡的免疫原性如圖4所示，用來自AtolR AgalU菌株的突泡免疫的小鼠產生的血清與該突泡的2D凝膠發生反應。因此，該突泡具有免疫原性。小鼠接受2yg或IOyg宋內志賀氏菌AtolRAgalU突泡(以總蛋白質為基準測定)，加或不加佐劑(氫氧化鋁或完全弗氏佐劑)。進行經典的ELISA方法以分析獲自免疫研究的血清中的IgG的生產。所有小鼠組的血清均顯示突泡特異性IgG的高水平生產。單獨使用突泡或與佐劑聯用時，未檢測到IgG生產中的顯著差異。用2μ g的低劑量免疫的組與用IOyg免疫的組顯示出相同的突泡特異性IgG水平，這表明可采用低劑量疫苗，即每美元更多劑量。來自其它宋內志賀氏菌和福氏志賀氏菌菌株的突泡也類似地具有免疫原性。測定抗突泡產生的血清與三種不同菌的反應性宋內志賀氏菌G53、福氏志賀氏菌2a 2457T或福氏志賀氏菌5M90T。然后用標記的二抗對樣品進行染色，并通過流式細胞法進行分析。如圖7中所示，宋內志賀氏菌和福氏志賀氏菌菌株與血清發生交叉反應。因此，該突泡方法在產生有效的低成本疫苗中具有很大的潛力，且可擴展到不同志賀氏菌菌株以產生廣譜疫苗。突泡吸附將突泡與氫氧化鋁(2mg/ml)組合進行吸附。將吸附材料儲存在4° C下I天、I周或I個月。I天后突泡完全吸附，且甚至在I個月后都未顯現出解吸附跡象(圖6)。
限鐵生長圖5顯示在不同條件下生長的志賀氏菌表達的蛋白質。在第4泳道中，細菌在200 μ MFeSO4的存在下生長，在第5泳道中，培養物包含200 μ M聯吡啶(dypiridyl)。插入的小圖顯示在限鐵條件下三種蛋白質上調。這三種蛋白質鑒定為F印A外膜受體(GI74311118)、大腸桿菌素I受體(GI 74312677)和推定鐵嗜鐵素受體(GI 74313972)。這些蛋白質在志賀氏菌屬和腸桿菌科中非常保守，并具有潛在的高免疫原性。因此，在限鐵條件下生長的志賀氏菌能導致突泡的釋放，該突泡與正常生長條件下產生的突泡相比富含這些蛋白質。
應理解，僅以舉例的方式描述了本發明，可對之進行修改而仍在本發明的范圍和構思內。表I
SEQ
ID GI基因名稱定義NO:
856480244tolC 外膜通道蛋白[福氏志賀氏菌2a菌株301]
974312736ompC 外膜孔蛋白C丨宋內志賀氏菌Ss0461__
1074311514ompA 外膜蛋內八丨宋內志賀氏菌35046丨 ._
11110807342SFV一3519假宙帶白SF.V 3519丨福氐志賀氏蘭5菌株84011
_J256479734__omp^——處膜蛋 &躍氏..H2禮株3Q.1].......__
1324113033SlyB 推定外膜蛋白[福氏志賀氏菌2a菌株301]_
1424112608Io舊外膜脂蛋白Lo舊丨福氏志賀氏菌2a菌株3011_
1524111612yaeT 外膜蛋白組裝因子丫 aeT[福氏志賀氏菌2a菌株301]
16187733369 :——外騰蛋白 『鮑氏志賀氏抑屮
_JZ2!113066 LPP.....胞孽質脂蛋白[福氏志賀氐菌2a菌株301]_
1856479690 pal 肽葡零響相苯的外應脂蛋白___[福氏志費氏隹f2a—·13011_
1924115506 ecnB 腸素(entericidin)B膜脂蛋閂f福氏忐賀氏菌2a菌株3011
___3—__ye _假定蛋 aS2Q6Z[福■■■■■R;志■賀-氏廣 2a 蔚獅 I]_
30064374假定蛋QS3269丨福氐志賀氏菌2a菌株2457η
2230065519 yjel 假定蛋白S4565『福氐志賀氏菌2a菌株2457T1
2324111837 ybaY 假定蛋白SF0398丨福氏志賀氏菌2a齒株3011
2424113773 SF2485 假宙蛋白.SF2485[福氐志賀氐痕2a·株301]
2574313380 SSON_296 假定蛋白 SSON_2966[宋內志賀氏菌 Ss046]
__6 _二_
.......—26— .—.. 30063856.............................nlpB^脂蛋由獵忐臟無■株化丌
27145294038 exc 進入排斥蛋白2〖宋內志賀氏菌Ss0461_
2882775909 ripB LPS-組裝脂蛋白聊[癒疾志賀氐ltSd 1—97]............................
2974311310 ybhC I推定果膠酶丨宋內忐賀氏齒SS0461_
權利要求
1.一種志賀氏菌，其表達TolA、TolB、TolQ、TolR和Pal蛋白中的不超過4種蛋白質。
2.如權利要求I所述的細菌，其特征在于，所述細菌表達所述蛋白質中的4種，而不表達 TolR。
3.一種志賀氏菌，其不表達TolR蛋白。
4.一種細菌，其為志賀氏菌的AtolR菌株。
5.如前述任一項權利要求所述的細菌，其特征在于，所述細菌不表達天然志賀氏菌的脂多糖。
6.如權利要求5所述的細菌，其特征在于，所述細菌不表達天然志賀氏菌O抗原。
7.如權利要求4所述的細菌，其特征在于，所述菌株是AtolRAgalU菌株。
8.如前述任一項權利要求所述的細菌，其特征在于，StxA和/或StxB基因是失活的。
9.一種表達TolA、TolB, TolQ, TolR和Pal蛋白的志賀氏菌，其特征在于，所述TolA、1'019、1'011 和/或？&1蛋白(a)位于該細菌的內膜或外膜，且(b)包括一個或多個氨基酸序列突變，從而使得與不含所述突變的相同細菌相比，所述細菌在培養基中生長的過程中，釋放更大量的外膜突泡。
10.一種志賀氏菌，其Tol-Pal系統中的一種或多種組分具有修飾，從而使得所述細菌與不含所述修飾的相同細菌相比，所述細菌在培養基中生長的過程中，將更大量的外膜突泡釋放到培養基中，所述細菌不表達(i)天然志賀氏菌多糖和/或(ii)志賀氏菌腸毒素。
11.一種制備志賀氏菌突泡的方法，所述方法包括從包含如權利要求1-10中任一項所述的細菌的培養基中分離所述突泡的步驟，所述細菌已在允許該細菌將突泡釋放到所述培養基中的條件下生長。
12.如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述細菌已在限鐵條件下生長。
13.一種制備高起泡性志賀氏菌的方法，所述方法包括如下步驟對編碼起始細菌Tol-Pal系統的一種或多種組分的基因進行修飾，從而使得該修飾導致所述細菌與起始細菌相比，在培養基中生長時，將更大量的外膜突泡釋放到培養基中，且其中所述修飾包括使得所述起始細菌的tolA、tolB、tolQ、tolR和/或pal基因中的一種或多種發生突變。
14.一種突泡，其從如權利要求1-10中任一項所述的細菌中分離或獲得、或從用如權利要求13所述的方法獲得的細菌中分離或獲得、或通過如權利要求11或12所述的方法分離或獲得。
15.一種包含突泡的組合物，在培養如權利要求1-10中任一項所述的細菌的過程中或通過如權利要求13的方法獲得突泡的過程中，所述突泡被釋放到培養基中。
16.如權利要求15所述的組合物，其不含任何活菌和/或全菌。
17.一種包含突泡的組合物，其中所述突泡存在于經O. 22 μ m過濾器過濾培養基而獲得的濾出液中，其中如權利要求1-10中任一項所述的細菌或通過權利要求13所述的方法獲得的細菌已在所述培養基中生長。
18.—種培養基，其包含如權利要求1-10中所述的細菌或包含通過如權利要求13所述的方法獲得的細菌，所述細菌已在允許所述細菌將突泡釋放到所述培養基中的條件下生長。
19.一種志賀氏菌菌株，其不表達功能性HtrB酶。
20.如權利要求19所述的志賀氏菌菌株，其敲除了htrB。
21.—種志賀氏菌突泡，其包含以下的一種或多種(a)由選自SEQ ID N0:8_67的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)包含與SEQ ID N0:8-67之一具有至少85%相同性的氨基酸序列的蛋白質和/或包含SEQ ID N0:8-67中任一種的至少7個連續氨基酸片段的蛋白質，其中所述片段包含表位。
22.—種包含蛋白質的無突泡免疫原性組合物，所述蛋白質包括(a)SEQ IDNO:8-136的氨基酸序列；(b)與SEQ ID N0:8-136之一具有至少85%相同性的氨基酸序列和/或包含SEQ ID N0:8-136中任一種的至少7個連續氨基酸片段的氨基酸序列，且包含來自SEQID NO:8-136之一的表位。
23.—種培養志賀氏菌的方法，其特征在于，鐵的供應受限制。
全文摘要
通過破壞Tol-pal系統的一種或多種組分產生高起泡性志賀氏菌菌株。源自這些菌株的突泡是疫苗中有用的免疫原。在這些突泡中存在的單獨的蛋白質也可用作免疫原。
文檔編號C12N9/12GK102906245SQ201080052643
公開日2013年1月30日 申請日期2010年9月28日 優先權日2009年9月28日
發明者C·杰科, F·博蘭達斯科薩, A·索爾, L·馬格奧 申請人:全球健康諾華疫苗學院有限公司