與Cry1Ca組合的Cry1Da用于管理抗性昆蟲的用途的制作方法

專利名稱：與Cry1Ca組合的Cry1Da用于管理抗性昆蟲的用途的制作方法
與CryICa組合的Cryl Da用于管理抗性昆蟲的用途
背景技術：
人類種植玉米以供食物和能量應用。人類還種植許多其它作物，包括大豆和棉花。昆蟲食用并損害植物，并且由此削弱這些人類努力。每年花費數十億美元來控制昆蟲有害生物，并且它們造成的損害損失額外的數十億。合成的有機化學殺蟲劑已經是用于控制昆蟲有害生物的主要工具，但是生物學殺蟲劑，諸如自蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis, Bt)衍生的殺蟲蛋白(insecticidal protein)已經在一些領域中發揮重要作用。經由用Bt殺蟲蛋白基因轉化生成昆蟲抗性植物的能力已經使現代農業發生革命，而且提高殺蟲蛋白及其基因的重要性和價值。已經使用幾種Bt蛋白來創建至今已經成功登記并商業化的昆蟲抗性轉基因植物。這些包括玉米中的CryIAb、CryIAc、CryIF和Cry3Bb、棉花中的CrylAc和Cry2Ab、和馬鈴薯中的Cry3A。 除了在2種蛋白質的組合殺蟲譜是期望的(例如，玉米中的CryIAb和Cry3Bb組合以分別提供對鱗翅目有害生物和根蟲的抗性)或蛋白質的獨立作用使它們可用作用于延遲易感昆蟲群中抗性形成的工具(例如，棉花中的CrylAc和Cry2Ab組合以提供煙草蚜蟲的抗性管理)的情況中外，表達這些蛋白質的商業產品表達單一蛋白質。還可見美國專利申請公開文本No. 2009/0313717，其涉及Cry2蛋白及Vip3Aa、CrylF、或CrylA以控制玉米夜蛾(Helicoverpa zea)或棉鈴實夜蛾(armigerain)。WO 2009 132850 涉及 CrylF或CrylA和Vip3Aa以控制草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)。美國專利申請公開文本No. 2008/0311096 部分涉及 CrylAb 以控制 CrylF 抗性 ECB。也就是說，已經導致此技術的快速且普遍采用的昆蟲抗性轉基因植物的一些質量(quality)還引起如下的憂慮，即有害生物群體會形成對由這些植物生成的殺蟲蛋白的抗性。已經提示了保留基于Bt的昆蟲抗性性狀的效用的幾種策略，其包括與避難所所(refuge)組合以及與不同毒素交替、或在不同毒素共部署中部署(deploy)高劑量的蛋白質(McGaughey 等(1998)，“B. t. Resistance Management, ”NatureBiotechnol. 16:144-146)。為了在昆蟲抗性管理(IRM)疊加中使用而選定的蛋白質需要獨立地施加其殺蟲效果，使得對一種蛋白質形成的抗性未賦予對第二種蛋白質的抗性(即，沒有對蛋白質的交叉抗性)。如果例如在對“蛋白質A”有抗性的有害生物群對“蛋白質B”敏感，那么會推斷沒有交叉抗性，并且蛋白質A和蛋白質B的組合會有效延遲對單獨的蛋白質A的抗性。在沒有抗性昆蟲群的情況中，可以基于假設與作用機制和交叉抗性潛力相關的其它特征做出評估。已經提示了受體介導的結合在鑒定有可能不展現出交叉抗性的殺蟲蛋白中的效用(van Mellaert等1999)。缺乏此方法中固有的交叉抗性的關鍵預測物(predictor)是殺蟲蛋白在敏感的昆蟲物種中不競爭受體。在兩種Bt毒素競爭相同受體的情況中，則若所述受體在所述昆蟲中突變，使得毒素之一不再結合所述受體，并且如此針對昆蟲不再是殺蟲性的，則情況可能是昆蟲也會對第二種毒素(其競爭性結合相同受體)有抗性。也就是說，昆蟲被說成與這兩種Bt毒素有交叉抗性。然而，若兩種毒素結合兩種不同受體，則這可以是如下的指示，即昆蟲不會對那兩種毒素同時有抗性。例如，CrylFa蛋白可用于控制許多鱗翅目有害生物物種，包括歐洲玉米螟(European corn borer) (ECB ;玉米螟(Ostrinia nubilalis) (Hiibner))和秋粘蟲(fallarmyworm) (FAff ;草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)),并且針對甘鹿螟(sugarcaneborer) (SCB ;小鹿螟(Diatraea saccharalis))是有活性的。CrylFa蛋白(如在含有事件TC1507的轉基因玉米植物中生成的)負責供FAW控制用的行業領先的昆蟲抗性性狀。CrylFa 在 Herculex 、Smart Stax 、和 WideStrike 產品中進一步部署。其它Cry毒素列于官方B. t.命名委員會的站點(Crickmore等；lifesci. sussex.ac. uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。目前有幾乎 60 個“Cry”毒素大類(Cryl_Cry59)，及其它Cyt毒素和VIP毒素等。許多數字組各自具有大寫字母亞組，而大寫字母亞組具有小寫字母亞-亞組。(例如，Cryl具有A-L,而CrylA具有a_i)。
發明詳述本發明部分涉及令人驚訝的發現，CrylDa和CrylCa在秋粘蟲(FAW ;草地夜蛾)的腸中不彼此競爭結合。如此，可以在轉基因玉米(和其它植物，例如，例如棉花和大豆)中與CrylCa蛋白組合使用CrylDa蛋白以延遲或阻止FAW形成對單獨的這些蛋白質之任一的抗性。主題蛋白質對可以有效保護植物(諸如玉米植物和/或大豆植物)免于Cry抗性秋粘蟲的損害。也就是說，使用本發明來保護玉米和其它經濟上重要的植物物種免于由可以形成對CrylDa或CrylCa的抗性的秋粘蟲群體引起的損害和產量損失。如此，本發明教導了昆蟲抗性管理(IRM)疊加，其包含CrylDa和CrylCa以阻止或減輕FAW形成對這些蛋白質之任一或兩者的抗性。本發明提供了用于控制鱗翅目有害生物的組合物，其包含生成CrylDa殺蟲蛋白和CrylCa殺蟲蛋白的細胞。本發明進一步包含經轉化以生成CrylDa殺蟲蛋白和CrylCa殺蟲蛋白兩者的宿主，其中所述宿主是微生物或植物細胞。優選地，主題多核苷酸在遺傳構建體中在非蘇云金芽孢桿菌啟動子的控制下。主題多核苷酸可以包含用于在植物中增強表達的密碼子選擇。另外，意圖本發明提供控制鱗翅目有害生物的方法，包括接觸所述有害生物或所述有害生物的環境與有效量的組合物，該組合物含有含CrylDa核心毒素的蛋白質，而且進一步含有含CrylCa核心毒素的蛋白質。本發明的一個實施方案包括玉米植物和此類植物的種子，所述植物包含植物可表達的編碼CrylCa殺蟲蛋白的基因和植物可表達的編碼CrylDa殺蟲蛋白的基因。本發明的又一個實施方案包括玉米植物和此類植物的種子，其中植物可表達的編碼CrylCa殺蟲蛋白的基因和植物可表達的編碼CrylDa殺蟲蛋白的基因已經基因滲入所述玉米植物中。如實施例中所描述的，使用放射性標記的CrylDa蛋白的競爭性受體結合研究顯示了 CrylCa蛋白在CrylDa結合的FAW組織中不競爭結合。這些結果還指示CrylDa和CrylCa蛋白的組合可以是減輕FAW群體中形成對這些蛋白質之任一的抗性的有效手段。如此，部分基于本文中所描述的數據，認為可以使用CrylCa和CrylDa蛋白的共生成(疊加)來為FAW生成高劑量IRM疊加。
可以將其它蛋白質添加至此對。例如，本發明還部分涉及三種(或更多種)毒素的三重疊加或“金字塔”，其中CrylDa和CrylCa是基礎對(base pair)。在一些優選的金字塔實施方案中，選定的毒素具有針對FAW的三種不同作用位點。一些優選的“三種作用位點”金字塔組合包括蛋白質的主題基礎對及CrylFa、Vip3Ab、CrylBe、或CrylE作為用于靶向FAW的第三蛋白。“不同作用位點”意指任何給定的蛋白質彼此不引起交叉抗性。依照本發明，這些具體的三重疊加會有利地且令人驚訝地提供了針對FAW的三種作用位點。這可以幫助降低或消除對避難所所土地面積的需要。也可以依照本發明添加其它毒素/基因。例如，若CrylFa或CrylBe與主題蛋白質對(CrylFa和CrylBe兩者針對FAW和歐洲玉米螟(ECB)都是有活性的)疊加，則對此三重疊加添加兩種額外的蛋白質(其中兩種添加的蛋白質靶向ECB)會提供針對FAW的三種作用位點，和針對ECB的三種作用位點。這兩種添加的蛋白質(第四和第五蛋白)可以選自 下組0724、0711、016-3(見美國專利申請流水號61/284，278(2009年12月16日提交)和US 2010 00269223)、和Cry lAb。這會導致具有針對兩種昆蟲(ECB和FAW)的三種作用位點的5蛋白質疊加。如此，一種部署選項是與第三毒素/基因組合使用主題蛋白質對，并且使用此三重疊加以減輕FAW中形成對這些毒素之任一的抗性。因而，本發明還部分涉及三種(或更多種)毒素的三重疊加或“金字塔”。在一些優選的金字塔實施方案中，選定的毒素具有針對FAW的三種不同作用位點。本發明的部署選項中包括的會是在FAW可以形成抗性群體的作物生長區使用本發明的兩種、三種、或更多種蛋白質。對于使用CrylFa及CrylC，見美國專利申請流水號61/284，281 (2009年12月16日提交)，其顯示了 CrylC針對CrylF抗性FAW有活性。對于使用CrylFa及Cry 1D，見美國專利申請流水號61/284，252(2009年12月16日提交)，其顯示了 CrylD針對CrylF抗性FAW有活性。這兩種應用還顯示了 CrylC在FAW膜制備物中不與CrylF競爭結合，并且CrylD在FAW膜制備物中不與CrylF競爭結合。在CrylFa針對FAW和ECB有活性的情況中，依照本發明，CrylDa及CrylCa及CrylFa會有利地且令人驚訝地提供針對FAW的三種作用位點。這可以幫助降低或消除對避難所所土地面積的需要。CrylFa 在 Hei'Culex 、Smart Stax 、和 WidesStrike 產品中部署。諸如基因對(CrylDa和CrylCa)可以組合入例如CrylFa產品諸如Herculex 、Smart Stax 、和WideStrike 中。因而，主題蛋白質對可以顯著降低對這些和其它蛋白質的選擇壓力。如此，主題蛋白質對可以與在三種基因組合中一樣用于玉米和其它植物(例如，棉花和大豆)。如上文所討論的，也可以依照本發明添加其它毒素/基因。對于使用CrylE(用于控制FAW)，見美國專利申請流水號61/284，278 (2009年12月16日提交)。對于使用CrylAb (用于控制ECB)，見美國專利申請公開文本No. 2008/0311096。生成蛋白質的任何主題組合的植物(和種植有此類植物的土地面積)包括在本發明的范圍內。還可以添加其它毒素/基因，但是上文所討論的特定疊加有利地且令人驚訝地提供了針對FAW和/或ECB的多個作用位點。這可以幫助降低或消除對避難所所土地面積的需要。如此，超過10英畝如此種植的田地包括在本發明內。也可以使用那些GENBANK來獲得本文中公開的或提及的任何基因和蛋白質的序列。見下文附錄A。相關序列在專利中也可獲得。例如，美國專利No. 5，188，960和美國專利No. 5，827，514描述了適用于用于實施本發明的含有CrylFa核心毒素的蛋白質。美國專利No. 6，218，188描述了編碼適合于用于本發明的含有CrylFa核心毒素的蛋白質的經植物優化的DNA序列。可以使用本文中描述的蛋白質組合來控制鱗翅目有害生物。成年鱗翅目，例如蝴蝶和蛾主要以花蜜為食，并且是傳粉的重要實現物(effector)。幾乎所有鱗翅目幼蟲，即毛蟲以植物為食，并且許多是嚴重的有害生物。毛蟲在葉上或內部進食或者以植物的根或莖為食，對植物剝奪營養物，而且經常破壞植物的物理支持結構。另外，毛蟲以果實、織物、和貯存的谷物和面粉為食，毀壞出售的這些產品或者嚴重降低其價值。如本文中所使用的，提及鱗翅目有害生物指有害生物的各個生命階段，包括幼蟲階段。本發明的一些嵌合毒素包括Bt毒素的完整N端核心毒素部分，并且在超出核心毒素部分末端的某個點處，蛋白質具有向異源原毒素(protoxin)序列的過渡。Bt毒素的N端 殺蟲活性的毒素部分稱為“核心”毒素。自核心毒素區段至異源原毒素區段的過渡可以大致在毒素/原毒素連接處發生或者，在備選中，可以保留天然原毒素的部分(超出核心毒素部分延伸)，其中在下游發生向異源原毒素部分的過渡。舉例而言，本發明的一個嵌合毒素是CrylDa的完整核心毒素部分(大致為前600個氨基酸)和/或異源原毒素(剩余的C端氨基酸)。在一個優選的實施方案中，嵌合毒素中包含原毒素的部分源自CrylAb蛋白毒素。在一個優選的實施方案中，嵌合毒素中包含原毒素的部分源自CrylAb蛋白毒素。本領域技術人員會領會，Bt毒素(即使在某個種類諸如CrylCa內)在長度和核心毒素部分向原毒素部分過渡的精確位置上會以一定程度有所變化。通常，CrylCa毒素的長度是約1150至約1200個氨基酸。自核心毒素部分至原毒素部分的過渡通常會在全長毒素的約50%-約60%發生。本發明的嵌合毒素會包括整段(full expanse)的此N端核心毒素部分。如此，嵌合毒素會包含Cryl Bt毒素蛋白的全長的至少約50%。這通常會是至少約590個氨基酸。關于原毒素部分，整段的Cryl Ab原毒素部分自核心毒素部分末端延伸至分子的C端。基因和毒素。依照本發明有用的基因和毒素不僅包括公開的全長序列，而且還包括保留本文中明確例示的毒素的特征性殺蟲(pesticidal)活性的這些序列、變體、突變體、和融合蛋白的片段。如本文中所使用的，術語基因的“變體”或“變異”指編碼相同毒素或編碼具有殺蟲活性的等同毒素的核苷酸序列。如本文中所使用的，術語“等同毒素”指與要求保護的毒素具有相同或基本上相同的針對靶有害生物的生物學活性的毒素。如本文中所使用的，按照“Revision of the Nomenclature for the Bacillusthuringiensis Pesticidal Crystal Proteins, ^N. Crickmore, D. R. Zeigler, J.Feitelson, E.Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum 和 D. H. Dean. Microbiology andMolecular Biology Reviews (1998)第 62 卷807-813,邊界代表約 95% (Cry IDa 和 Cry I Ca)、78%(CryID和CrylC)、和45%(Cryl)序列同一性。這些截留也可以僅僅應用于核心毒素。對于本領域技術人員應當顯而易見的是，可以經由幾種手段鑒定并獲得編碼活性毒素的基因。可以自保藏于培養物保藏所的分離物獲得本文中例示的特定基因或基因部分。也可以例如通過使用基因合成儀以合成方式構建這些基因或其部分或變體。可以使用用于生成點突變的標準技術來容易地構建基因的變異。還有，可以使用商品化的外切核酸酶或內切核酸酶依照標準的規程來生成這些基因的片段。例如，可以使用酶諸如Bal31或定點誘變自這些基因的末端系統性剪斷核苷酸。也可以使用多種限制酶來獲得編碼活性片段的基因。可以使用蛋白酶來直接獲得這些蛋白質毒素的活性片段。保留例示的毒素的殺蟲活性的片段和等同物會在本發明的范圍內。還有，由于遺傳密碼的冗余，多種不同DNA序列可以編碼本文中公開的氨基酸序列。完全在本領域技術人員的技術內的是創建編碼相同的，或基本上相同的毒素的這些備選DNA序列。這些變體DNA序列在本發明的范圍內。如本文中所使用的，提及“基本上相同的”序列指具有沒有實質性影響殺蟲活性的氨基酸取代、缺失、添加、或插入的序列。編碼保留殺蟲活性的蛋白質的基因的片段也包括在此定義中。用于鑒定依照本發明有用的編碼毒素的基因和基因部分的又一種方法是經由使用寡核苷酸探針。這些探針是可檢測的核苷酸序列。這些序列憑借合適的標記物可以是可 檢出的或者可以以固有熒光生成，如記載于國際申請NO.W093/16094的。如本領域中公知的，若探針分子和核酸樣品通過形成兩種分子間強烈的鍵來雜交，則可以合理地假設探針和樣品具有實質的同源性。優選地，通過本領域中公知的技術在嚴格條件下進行雜交，如記載于例如 Keller, G. H.，Μ. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N. Y.,第169-170頁的。鹽濃度和溫度組合的一些例子如下(以嚴格性升高的次序)2X SSPE或SSC于室溫；IX SSPE 或 SSC 于 42° C ;(λ IX SSPE 或 SSC 于 42° C ;(λ IX SSPE 或 SSC 于 65° C。探針的檢測提供了一種用于以已知的方式測定雜交是否已經發生的手段。此類探針分析提供一種用于鑒定本發明的毒素編碼基因的快速方法。可以使用DNA合成儀和標準的規程來合成依照本發明作為探針使用的核苷酸區段。也可以使用這些核苷酸序列作為PCR引物以擴增本發明的基因。變體毒素。已經在本文中明確例示本發明的某些毒素。因為這些毒素僅是本發明的毒素例示性的，所以應當容易顯而易見的是，本發明包括具有例示毒素的相同或相似殺蟲活性的變體或等同毒素(和編碼等同毒素的核苷酸序列)。等同毒素與例示的毒素會具有氨基酸同源性。此氨基酸同源性通常會大于75%,優選大于90%,且最優選大于95%。氨基酸同源性在毒素中負責生物學活性或者牽涉決定最終負責生物學活性的三維構型的至關重要的區域中會是最高的。在這點上，某些氨基酸取代是可接受的，并且若這些取代在對于活性不是至關重要的區域中或者是不影響分子的三維構型的保守氨基酸取代，則可以是預期的。例如，氨基酸可以放入以下種類非極性、不帶電荷的極性、堿性、和酸性。其中的一類氨基酸用相同類型的另一種氨基酸替換的保守取代落入本發明的范圍內，只要取代不實質性改變化合物的生物學活性。下文是屬于每類的氨基酸的例子的列表。
氨基酸的種類氨基酸的例子
非極性Ala，Val, Leu, He, Pro, Met, Phe，Trp
不帶電荷的極性Gly，Ser，Thr，Cys，Tyr，Asn, Gln酸性Asp, Glu
堿性Lys，Arg, His在一些情況中，也可以進行非保守取代。至關重要的因素是這些取代必須不顯著降低毒素的生物學活性。重組宿主。可以將編碼本發明的毒素的基因導入極其多種微生物或植物宿主中。毒素基因的表達直接或間接導致殺蟲劑(pesticide)的胞內生成和維持。可以使用接合轉移和重組轉移來創建表達本發明的兩種毒素的Bt菌株。也可以用一種或兩種毒素基因轉化其它宿主生物體，所述毒素基因然后用于實現協同效應。憑借合適的微生物宿主，例如假單胞菌屬(Pseudomonas)，可以將微生物應用于有害生物的位置，在那里它們會增殖并被攝取。結果是對有害生物的控制。或者，可以在延長毒素的活性并且穩定細胞的條件下處理為毒素基因做宿主的微生物。然后，可以將經處理的細胞(其保留毒性活性)應用于靶有 害生物的環境。在經由合適的載體將Bt毒素基因導入微生物宿主中，且將所述宿主應用于生活狀態的環境的情況中，使用某些宿主微生物是必要的。選擇如下的微生物宿主，已知所述微生物宿主占據一種或多種感興趣作物的“植物圈”(葉面(phylloplane)、葉圈、根際、和/或根面)。這些微生物選擇為使得能夠在特定環境(作物和其它昆蟲生境)中與野生型微生物成功競爭，提供表達多肽殺蟲劑的基因的穩定維持和表達，且期望地，提供改善的保護殺蟲劑免于環境降解和滅活。已知大量微生物駐留于極其多種重要的作物的葉面(植物葉的表面)和/或根際(植物根周圍的土壤)。這些微生物包括細菌、藻類和真菌。特別感興趣的是微生物，諸如細菌，例如假單胞菌屬、歐文氏菌屬(Erwinia)、沙雷氏菌屬(Serratia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、根瘤菌屬(Rhizobium)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、嗜甲基菌屬(Methylophilius)、土壤桿菌屬(Agrobactenum)、醋桿菌屬(Acetobacter)、乳酸菌屬(Lactobacillus)、節桿菌屬(Arthrobacter)、固氮菌屬(Azotobacter)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、和產喊菌屬(Alcaligenes);真菌,特別是酵母,例如屬酵母菌屬(Saccharomyces)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、擲抱酵母屬(Sporobolomyces)、紅酵母屬(Rhodotorula)、和短梗霉屬(Aureobasidium)。特別感興趣的是植物圈細菌物種,諸如丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)、突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)、木醋桿菌(Acetobacter xylinum)、根癌土壤桿菌(Agrobactenium tumefaciens)、類球紅細胞(Rhodopseudomonas spheroids)、野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)、苜猜中華根瘤菌(Rhizobium melioti)、真養產喊菌(Alcaligenes entrophus)、和維捏蘭德固氮菌(Azotobacter vinlandii);和植物圈真菌物種，諸如深紅類酵母菌(Rhodotorula rubra)、膠紅類酵母菌(R. glutinis)、海濱紅酵母(R. marina)、澄黃紅酵母菌(R. aurantiaca)、白色隱球菌(Cryptococcus albidus)、液化隱球菌(C. diffluens)、勞倫梯氏隱球菌(C. Iaurentii)、羅氏酵母(Saccharomyces rosei)、
S.pretoriensis、釀酒酵母(S. cerevisiae)、玫紅擲抱酵母(Sporobolomyces roseus)、香氣擲孢酵母(S. odorus)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces veronae)、和出芽短梗霉菌(Aureobasidium pollulans)。特別感興趣的是色素性微生物。極其多種方法可用于在容許基因的穩定維持和表達的條件下將編碼毒素的Bt基因導入微生物宿主中。這些方法是本領域技術人員公知的，并且記載于例如美國專利No. 5135867，通過提及而將其收入本文。細胞的處理。可以處理表達Bt毒素的蘇云金芽孢桿菌或重組細胞以延長毒素活性并穩定細胞。形成的殺蟲劑微囊體包含在已經穩定化的細胞結構內的一種或多種Bt毒素，并且在將微囊體應用于靶有害生物的環境時會保護毒素。合適的宿主細胞可以包括原核生物或真核生物，通常不限于那些不生成對于高等生物體，諸如哺乳動物有毒性的物質的細胞。然而，可以使用生成對于高等生物體有毒性的物質的生物體，其中毒性物質是不穩定的或應用水平充分降低，從而避免對哺乳動物宿主的毒性的任何可能性。作為宿主，特別感興趣的會是原核生物和低等真核生物，諸如真菌。
細胞通常會是完整的，并且在處理時基本上為增殖形式，而不是為孢子形式，盡管在一些情況中可以采用孢子。可以通過化學或物理手段，或者通過化學和/或物理手段的組合來處理微生物細胞，例如含有一種或多種B. t.毒素基因的微生物，只要所述技術沒有不利地影響毒素的特性，也不降低保護毒性的細胞性能。化學試劑的例子是鹵化劑，特別是原子數17-80的鹵素。更特別地，可以將碘在溫和(mild)條件下且持續足夠的時間使用，使得實現期望的結果。其它合適的技術包括用醛，諸如戊二醛；抗感染藥，諸如氯化芐烷銨(zephiranchloride)和西卩比氯銨(cetylpyridinium chloride);醇，諸如異丙基和乙醇；各種組織固定劑，諸如Lugol碘、Bouin氏固定劑、各種酸和Helly氏固定劑(見Humason, GretchenL. , Animal Tissue Techniques, ff. H. Freeman and Company, 1967);或在對宿主環境施用細胞時保留并延長細胞中生成的毒素的活性的物理(熱)和化學劑的組合處理。物理手段的例子是短波長輻射，諸如ga_a-輻射和X-輻射、冷凍、UV照射、凍干等。用于處理微生物細胞的方法披露于美國專利No. 4，695，455和4，695，462，通過提及而將其收入本文。細胞一般會具有增強的結構穩定性，這會增強對環境條件的抗性。在殺蟲劑為原型(proform)的情況中，細胞處理的方法應當選擇為使得不抑制祀有害生物病原體將原型加工成殺蟲劑的成熟形式。例如，甲醛會交聯蛋白質，而且可以抑制對多肽殺蟲劑的原型的加工。處理方法應當至少保留毒素的生物利用度或生物活性的實質性部分。出于生成目的選擇宿主細胞中特別感興趣的特征包括容易將一種或多種B. t.基因導入宿主中、表達系統的利用度、表達效率、殺蟲劑在宿主中的穩定性、和輔助遺傳性能的存在。作為殺蟲劑微囊體使用的感興趣特征包括殺蟲劑的保護質量，諸如厚的細胞壁、色素沉著、和包含體的胞內包裝或形成；在水性環境中存活；缺乏哺乳動物毒性；對攝食的有害生物的吸引力；在不損害毒素的情況中容易殺死和固定；等等。其它考慮因素包括容易配制和處理、經濟、貯存穩定性，等等。細胞生長。可以將含有一種或多種B. t.殺蟲基因的細胞宿主在任何便利的營養培養基中培養，其中DNA構建體提供選擇優勢，提供選擇培養基，使得基本上所有或所有細胞保留B.t.基因。然后，可以依照常規的方式收獲這些細胞。或者，可以在收獲前處理細胞。
可以使用標準技術培養基和發酵技術來培養生成本發明的毒素的B.t.細胞。在完成發酵周期后，可以如下收獲細菌，即首先通過本領域中公知的手段自發酵培養基分離B.t.孢子和晶體。可以通過添加表面活性劑、分散劑、惰性載體和其它組分將回收的B. t.孢子和晶體配制成可濕的粉末、液體濃縮物、顆粒劑或其它配制劑以便于針對特定的靶有害生物的處理和應用。這些配制劑和應用規程是本領域中公知的。配制劑。可以將含有弓I誘劑和B. t.隔離群、或包含自本文中公開的B. t.隔離群可獲得的基因的重組微生物的孢子、晶體、和毒素的配制的誘餌顆粒劑應用于土壤。也可以將配制的產物以種子涂層材料或根處理或總體植物處理在作物周期的后期階段應用。B. t.細胞的植物和土壤處理可以以可濕的粉末、顆粒或粉塵采用，其通過混合各種惰性材料，諸如無機礦物質(葉娃酸鹽(phyllosilicate)、碳酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等)或植物材料(粉狀玉米穗軸、稻殼、胡桃殼等)來實現。配制劑可以包含展著劑-粘著劑(spreader-sticker)佐劑、穩定劑、其它殺蟲添加劑、或表面活性劑。液體配制劑可以是基于水性的或非水性的，并且以泡沫、凝膠、懸浮液、可乳化的濃縮物等采用。成分可以包括流變劑、表面活性劑、乳化劑、分散劑、或聚合物。
如本領域技術人員會領會的，殺蟲濃度會隨特定配制劑的性質，特別是它是濃縮物還是要直接使用而廣泛變化。殺蟲劑會以至少1%(按重量計)存在，并且可以是100%(按重量計)。干配制劑會具有約1-95%(按重量計)的殺蟲劑，而液體配制劑一般會是液相中約1-60%(按重量計)的固體。配制劑一般會具有約IO2至約IO4個細胞/mg。這些配制劑會以每公頃約50mg(液體或干的)至Ikg或更多施用。可以通過噴霧、噴粉、噴灑等將配制劑應用于鱗翅目有害生物的環境，例如葉或土壤。植物轉化。一種用于生成本發明的殺蟲蛋白的優選的重組宿主是經轉化的植物。可以使用本領域中公知的多種技術來將如本文中所公開的編碼Bt毒素蛋白的基因插入植物細胞中。例如，包含大腸桿菌(Escherichia coli)中的復制系統和容許選擇經轉化的細胞的標志物的大量克隆載體可用于準備好將外來基因插入高等植物中。例如，載體包括pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184,等等。因而，可以將具有編碼Bt毒素蛋白的序列的DNA片段在合適的限制性位點插入載體中。可以使用所得的質粒對大腸桿菌轉化將大腸桿菌細胞在合適的營養培養基中培養，然后收獲并裂解。將質粒回收。序列分析、限制性分析、電泳、和其它生物化學-分子生物學方法一般作為分析方法實施。在每次操作后，可以將使用的DNA序列切割，并與下一 DNA序列連接。可以在同一或其它質粒中克隆每個質粒序列。根據將期望的基因插入植物中的方法，其它DNA序列可以是必要的。如果例如使用Ti或Ri質粒轉化植物細胞，那么至少Ti或Ri質粒T-DNA的右側邊界，但是經常是右側和左側邊界必須作為要插入的基因的側翼區連接。T-DNA轉化植物細胞的用途已經透徹研究，并且充分記載于 EP 120 516，Lee 和 Gelvin (2008) ,Hoekema (1985) ,Fraley 等，(1986)，及An等，(1985)，而且是本領域中完善建立的。一旦將插入的DNA在植物基因組中整合，它便是相對穩定的。轉化載體通常含有選擇標志，其對經轉化的植物細胞賦予對抗微生物劑或抗生素諸如Bialaphos、卡那霉素、G418、博來霉素、或潮霉素等的抗性。因而，個別采用的標志物應當容許選擇經轉化的細胞，而不是不含插入的DNA的細胞。
大量技術可用于將DNA插入植物宿主細胞中。那些技術包括使用根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或毛根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes)作為轉化劑用T-DNA的轉化、融合、注射、生物射彈(微粒轟擊)、或電穿孔以及其它可能的方法。若使用土壤桿菌進行轉化，則必須將要插入的DNA克隆入特殊的質粒中，即克隆入中間載體中或克隆入二元載體中。可以通過由于與T-DNA中的序列同源的序列所致的同源重組將中間載體整合入Ti或Ri質粒中。Ti或Ri質粒還包含轉移T-DNA必需的vir區。中間載體不能在土壤桿菌中自身復制。 可以依靠輔助質粒將中間載體轉移入根癌土壤桿菌中(接合)。二元載體在大腸桿菌和土壤桿菌中都能自身復制。它們包含選擇標志基因和接頭或多接頭，其以右側和左側T-DNA邊界區為框。可以將它們直接轉化入土壤桿菌中(Holsters等，1978)。用作宿主細胞的土壤桿菌包含攜帶vir區的質粒。vir區是將T-DNA轉移入植物細胞中必需的。可以含有別的T-DNA。使用如此轉化的細菌來轉化植物細胞。有利地，可以將植物外植體與根癌土壤桿菌或毛根土壤桿菌一起培養以將DNA轉移入植物細胞中。然后，可以在可含有供選擇用的抗生素或抗微生物劑的選擇培養基中自感染的植物材料(例如，葉塊、柄(stalk)段、根，而且還有原生質體或懸浮培養的細胞)再生全植物。然后，可以對如此獲得的植物測試插入的DNA的存在。在注射和電穿孔的情況中質粒沒有特殊需要。有可能使用普通的質粒，諸如例如PUC衍生物。經轉化的細胞以常見的方式在植物內部生長。它們可以形成生殖細胞，并且將轉化的性狀傳遞給后代植物。可以將此類植物以正常的方式培養，并且與具有相同轉化遺傳因子或其它遺傳因子的植物雜交。所得的雜種個體具有相應的表型特性。在本發明的一個優選的實施方案中，會用基因轉化植物，其中已經對植物優化密碼子選擇。見例如美國專利No. 5380831，在此通過提及而將其收錄。雖然在本文中例示了一些截短的毒素，但是Bt領域中公知的是，130kDa型(全長)毒素具有作為核心毒素的N端半部分和作為原毒素“尾部”的C端半部分。如此，合適的“尾部”可以與本發明的截短的/核心毒素一起使用。見例如美國專利No. 6218188和美國專利No. 6673990。另外，用于創建用于植物的合成Bt基因的方法是本領域中已知的(Stewart和Burgin, 2007)。優選的轉化植物的一個非限制性例子是能育的玉米植物，其包含編碼CrylDa蛋白的植物可表達基因，而且進一步包含編碼CryICa蛋白的第二植物可表達基因。 可以通過輪回選擇育種，例如通過回交來實現CrylDa-和CrylCa決定性狀對近交玉米系的轉移(或基因滲入。在此情況中，首先將期望的輪回親本與攜帶適合于CrylD-和CrylC-決定性狀的基因的供體近交物(非輪回親本)雜交。然后，將此雜交的后代與輪回親本回交(mate back)，接著在所得的后代中選擇要自非輪回親本轉移的期望的性狀。在與輪回親本回交及選擇期望的性狀的3個，優選地4個，更優選地5個或更多個世代后，后代在控制所轉移的性狀的基因座方面會是雜合的，但是在大多數或幾乎所有其它基因方面會與輪回親本一樣(見例如Poehlman和Sleper (1995)Breeding Field Crops,第4 版，172-175;Fehr(1987)Principles of Cultivar Development,第 I 卷Theory andTechnique, 360-376)。昆蟲抗件管理(IRM)策略。例如，Roush等概述了 2毒素策略，又稱作“金字塔化(pyramiding) ” 或“疊加”,用于管理殺蟲轉基因作物。(The Royal Society. Phil. Trans.R. Soc. Lond. B. (1998) 353，1777-1786)。
在其網站上，美國環境保護局(epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006. htm)公布了提供與生成針對祀有害生物有活性的單一 Bt蛋白的轉基因作物一起使用的非轉基因(即，非B. t.)避難所所(非Bt作物/玉米的部分)的下列要求。“玉米螟防護的Bt (CrylAb或CrylF)玉米產品的特定結構化需要如下結構化避難所所玉米帶中20%非鱗翅目Bt玉米避難所所；棉花帶中50%非鱗翅目Bt避難所所區組 內部(SP，在Bt田內)外部(B卩，在1/2英里(若可能的話，1/4英里)Bt田內的不同田地以使隨機雜交最大化)田間條(Strip)條必須寬至少4行(優選地6行)以降低幼蟲運動的效果”另外，國家玉米種植者協會(National Corn Growers Association),在其網站上(ncga. com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn)還提供關于避難所所需要的類似指導。例如“玉米螟IRM的要求-以避難所雜種種植至少20%的玉米地-在棉花生產區中，避難所所必須是50%-必須在1/2英里的避難所雜種內種植-避難所所可以在Bt田內以條種植；避難所條必須寬至少4行-只有當對靶昆蟲達到經濟閾值時，可以用常規的殺蟲劑處理避難所所-基于Bt的可噴射的殺蟲劑不能對避難所玉米使用-必須在有Bt玉米的每個農場種植合適的避難所所”如由Roush等(例如第1780和1784右欄)所述，各自針對靶有害生物有效的且具有很少或沒有交叉抗性的兩種不同蛋白質的疊加或金字塔化可以容許使用更小的避難所所。Roush提示，對于成功的疊加，小于10%避難所所的避難所所大小可以提供與單一(非金字塔化)性狀的約50%避難所所相當的抗性管理。對于目前可用的金字塔化Bt玉米產品，美國環境保護局要求比對于單一性狀產品(一般為20%)顯著更少(一般為5%)的非Bt玉米的結構化避難所所。存在有提供避難所所的IRM效果的多種方式，包括田間的各種幾何種植樣式(如上文所提及的)和袋中種子混合物，如由Roush等(見上文)及美國專利No. 6，551，962進一步討論的。可以對主題雙重或三重疊加或金字塔使用上述百分比、或類似的避難所所比率。對于具有針對單一靶有害生物的三種作用位點的三重疊加，目的會是O避難所所(或例如小于5%避難所所)。這特別適用于商業面積一例如超過10英畝的。本文中提及或引用的所有專利、專利申請、臨時申請、和出版物通過提及以它們與本說明書的明確教導不矛盾的程度完整收錄。
如本文中所使用的，除非明確指示或暗示，術語“一個”、“一種”、和“該/所述”表示“至少一個/種”。以下是例示用于實施本發明的規程的實施例。這些實施例不應解釋為限制性的。除非另有記錄，所有百分比是按重量計，而所有溶劑混合物比例是按體積計。所有溫度以攝氏度計。
實施例實施例I :Cry蛋白的125I標記Cry毒素的碘化。使用碘珠(Iodo-Bead)或Iodo-gen (Pierce)來碘化純化的截短的Cry毒素。簡言之，將兩個碘珠用500 μ L磷酸鹽緩沖鹽水PBS (20mM磷酸鈉、O. 15MNaCl, pH7. 5)清洗兩次，并放入具有100 μ L PBS的I. 5mL離心管中。添加O. 5mCi經125I標記的碘化鈉，容許組分于室溫反應5分鐘，然后將I μ g CrylDa核心毒素蛋白添加至 溶液，并容許再反應3至5分鐘。通過自碘化珠移出溶液來終止反應，并將其應用于在50mM CAPS, ρΗΙΟ. O、ImM DTT ( 二硫蘇糖醇)、ImM EDTAjP 5% 甘油中平衡的 Zeba 旋轉柱(Invitrogen) 0將碘化珠用IOyL PBS清洗兩次，并也將清洗緩沖液應用于Zeba 脫鹽柱。通過以1，OOOx g離心2分鐘將放射性溶液洗脫通過旋轉柱。然后，將經125I放射性標記的CrylDa 核心毒素蛋白針對 50mM CAPS, ρΗΙΟ. O、ImM DTT、ImMEDTA、和 5% 甘油透析。將兩個碘珠用500 μ I磷酸鹽緩沖鹽水PBS(20mM磷酸鈉、O. 15M NaCl,pH 7. 5)清洗兩次，并放入鉛屏蔽后面的I. 5ml離心管中。對此添加100 μ I PBS。在防護帽(hood)中并且經由使用合適的放射性處理技術，將0. 5mCi Na125I (17. 4Ci/mg, Lot 0114, Amersham)添加至具有碘珠的PBS溶液。容許組分于室溫反應5分鐘，然后將2-25 μ g高度純的經截短的Cry蛋白添加至溶液，并容許再反應3-5分鐘。通過將溶液除去碘珠，并將其應用于PBS中平衡的0. 5ml脫鹽Zeba旋轉柱(InVitrogen)來終止反應。將碘珠各用10 μ I PBS清洗兩次，并也將清洗溶液應用于脫鹽柱。通過以1，OOOx g離心2分鐘將放射性溶液洗脫通過脫鹽柱。在CrylDa的情況中，使用Iodo-gen法來進行放射性標記方法。使用此方法，首先將IOOmM磷酸鹽緩沖液(pH 8)中的cry毒素清除脂多糖(LPS)，這通過將其多次通過小的
0.5ml 多粘菌素柱來進行。對 iodo-gen 管(PierceChem. Co.)添加 20 μ g 無 LPS 的 CrylDa毒素，然后是0.5mCi Na125I。將反應混合物于25° C搖動15分鐘。自管取出溶液，并添加50 μ I 0. 2Μ非放射性標記的NaI以淬滅反應。用3次緩沖液交換針對PBS透析蛋白質以除去任何未結合的125I。通過SDS-PAGE、磷光成像(phosphorimaging)和gamma計數測定碘化的Cry蛋白的放射性純度。簡言之，通過SDS-PAGE分離2 μ I放射性蛋白質。分離后，使用BioRad凝膠干燥裝置遵循制造商的用法說明書干燥凝膠。通過將干燥的凝膠在Mylar膜(厚12μπι)中包裹，并將它們在Molecular Dynamics儲存憐光體屏(storage phosphor screen) (35cmX 43cm)下暴露I小時來對它們成像。使用Molecular Dynamics Storm 820磷光成像儀(phosphorimager)顯現板,并使用ImageQuant 軟件分析圖像。使用剃刀刀片自凝膠切出放射性條帶以及剛剛在該條帶上方和下方的區域，并在ga_a計數器中計數。僅在Cry蛋白條帶中及在條帶下方的區域中檢出放射性。在條帶上方沒有檢出放射性，指示所有放射性污染物由比截短的Cry蛋白小的蛋白質組分組成。這些組分最有可能代表降解產物。
實施例2 =BBMV制備方案溶解的BBMV的制備和分級。將末齡草地夜蛾、玉米螟、或玉米夜蛾(Heleothis.Zea)幼蟲禁食過夜，然后在早晨在冰上冷凍15分鐘后解剖。自體腔取出中腸組織，留下附著于體壁的后腸。將中腸在9X體積的冰冷均質化緩沖液(300mM甘露醇、5mM EGTA,17mM tris.堿，pH7. 5)(其補充有如供應商推薦的那樣稀釋的蛋白酶抑制劑混合物11 (Sigma-Aldrich P-2714))中放置。用玻璃組織勻漿器的15次撞擊(stroke)將組織均質化。通過Wolfersberger (1993)的MgCl2沉淀法制備BBMV。簡言之，將300mM甘露醇中的等體積24mM MgCl2溶液與中腸均漿混合，攪動5分鐘，并容許在冰上豎立15分鐘。將溶液于4°以2，500x g離心15分鐘。將上清液保留，并將團粒懸浮到初始體積的O. 5X稀釋的均質化緩沖液中，并再次離心。將兩種上清液組合，并于4°以27，OOOx g離心30分鐘以形成BBMV級分。將團粒懸浮到IOml均質化(homogienization)緩沖液中，并補充蛋白酶抑制劑，并以27，OOOx g于4° C再離-1混合物組分的終濃度(以μ M計)是AEBSF (500)、EDTA (250mM)、苯丁抑制素(Bestatin) (32)、Ε_64(0· 35)、亮抑酶肽(Leupeptin) (0. 25)和抑肽酶(0. 075)。心 30 分鐘 以清洗BBMV。將所得的團粒以約3mg/mL蛋白質濃度懸浮到BBMV貯存緩沖液(IOmM HEPES,130mM KC1、10%甘油，pH7. 4)中。通過使用Bradford法(1976)用牛血清清蛋白(BSA)作為標準品測定蛋白質濃度。使用Sigma測定法遵循制造商的用法說明書在冷凍樣品前進行堿性磷酸酶測定。BBMV級分中的此標志物酶的比活通常比存在于中腸均漿級分中的比活升高7倍。將BBMV等分取樣到250 μ L樣品中，在液氮中速凍，并于-80°貯存。實施例3 :測量125I Cry蛋白結合BBMV蛋白的方法125I Cry蛋白對BBMV的結合。為了測定BBMV蛋白用于結合測定法的最佳量，產生飽和曲線。將125I放射性標記的Cry蛋白(0. 5ηΜ)于28° C與多個量的BBMV蛋白(范圍為在結合緩沖液(8mM NaHPO4,2mM KH2PO4U50mM NaCl,0. 1%牛血清清蛋白，pH 7.4)中的
0-500 μ g/ml) 一起溫育I小時。總體積是0. 5ml。通過將150 μ I反應混合物一式三份從
I.5ml離心管取樣到500 μ I離心管中，并以14，OOOx g將樣品于室溫離心6分鐘來分開結合的125I Cry蛋白與未結合的。溫和地除去上清液，并且將團粒用冰冷的結合緩沖液溫和清洗三次。切出含有團粒的離心管底部，并將其放入13x 75-mm玻璃培養管中。將樣品各自在gamma計數器中計數5分鐘。自背景計數(沒有任何蛋白質的反應)扣除樣品中含有的計數，并相對于BBMV蛋白質濃度繪圖。使用的蛋白質的最佳濃度測定為0. 15mg/ml BBMV蛋白。為了測定結合動力學，產生飽和曲線。簡言之，將BBMV(150 μ g/ml)于28° C與增加濃度的125I Cry毒素(范圍為0. 01至IOnM) —起溫育I小時。通過一式三份取樣150 μ I各個濃度，離心樣品，并計數來測定總體結合，如上文所描述的。以相同的方式測定非特異性結合，其中對反應混合物添加1，OOOnM同源的經胰蛋白酶處理的非放射性Cry毒素以飽和所有非特異性受體結合位點。特異性結合以總體結合和非特異性結合間的差異計算。使用150 μ g/ml BBMV蛋白和0. 5nM125I放射性標記的Cry蛋白進行同源和異源競爭結合測定法。對反應混合物添加的競爭性非放射性標記的Cry毒素的濃度在0. 045至1，OOOnM的范圍內，并且與放射性配體同時添加，以確保實際的結合競爭。于28° C實施溫育I小時，并如上文所描述的，扣除非特異性結合測量與其受體毒素結合的125I Cry蛋白的量。在沒有任何競爭物配體的情況中測定100%總體結合。將結果在半對數圖上以百分比總體同源性結合對添加的競爭性配體的濃度繪圖。實施例4 結果的匯總圖I顯示了在來自FAW的BBMV中125I CrylDa(0. 5nM)對未標記的同源CrylDa(〇)和異源CrylCa(_)的競爭的百分比特異性結合。CrylDa的同源競爭的置換曲線產生s形(sigmoidal)形狀的曲線，顯不在約I. 5nM CrylDa的50%放射性配體置換。CrylCa在任何測試濃度(多至1，OOOnM,或用于測定法的125I CrylDa濃度的2，000倍)都不置換125ICrylDa的特異性結合。參考文獻列表Heckel，D. G.，Gahan，L. J.，Baxter, S. W.，Zhao，J. Z.，Shel ton, A.Μ·，Gould，F.，and Tabashnikj B. E. (2007). The diversity of Bt resistance genes inspecies of Lepidoptera. J Invertebr Pathol 95，192-197.Luoj K. , Banks, D. , and Adangj M. J. (1999). Toxicity, binding, and permeabilityanalyses of four bacillus thuringiensis cry I deIta-endotoxins using brushborder membrane vesicles of spodoptera exigua and spodoptera fugiperda. Appl.Environ. Microbiol. 65，457-464.Palmer, M.，Buchkremerj M，Valevaj A，and Bhakdij S. Cysteine-specificradioiodination of proteins with fluorescein maleimide. Analytical Biochemistry253，175-179. 1997.Ref Type: Journal (Full)Sambrookj J.and Russell,D. W. (2001). Molecular Cloning:A LaboratoryManual. Cold Spring Harbor Laboratory).Schlenz，M. L，Babcock，J. M.，and Storerj N. P. Response of CrylF-resistantand Susceptible European Corn Borer and Fall Armyworm Colonies to CryIA. 105 andCryl2Ab2. DAI 0830，2008. Indianapolis，Dow AgroSciences. Derbi Report.Sheets, J. J. and Storer, N. P. Analysis of CrylAc Binding to Proteinsin Brush Border Membrane Vesicles of Corn Earworm Larvae(Heleothis zea).Interactions with CrylF Proteins and Its Implication for Resistance in theField. DAI-0417, 1-26. 2001. Indianapolis, Dow AgroSciences.Tabashn ik，B. E.，Liuj Y. B.，Fin son，N.，Masson, L.，and Hecke I，D. G. (1997).One gene in diamondback moth confers resistance to four Bacillus thuringiensistoxins. Proc. N atl. Acad. Sci. U. S. A94，1640-1644.Tabashnikj B. E.，Malvar, T.，Liuj Y. B.，Finsonj N.，Borthakurj D.，Shin, B.S.，Park, S. H.，Masson, L.，de Maagdj R. A.，and Bosch, D. (1996). Cross-resistance ofthe diamondback moth indicates altered interactions with domain II of Bacillusthuringiensis toxins. Appl. Environ. Microbiol. 62，2839-2844.Tabashnikj B. E.，Roush, R. T.，Earle, E. D.，and Shelton, A. M. (2000).Resistance to Bt toxins. Science 287,42.Wolfersbergerj M. G. (1993). Preparation and partial characterization ofamino acid transporting brush border membrane vesicles from the larval midgut of the gypsy moth(Lymantria dispar). Arch. Insect Bioche m. Physiol 24，139-147.

Xu，X.，Yu，L，and WujY. (2005). Disruption of a cadherin gene associated with resistance to CrylAc {delta}-endotoxin of Bacillus thuringiensis in Helicoverpa armigera. Appl Environ Microbiol 71，948—954.

附錄Adelta-內毒素的列表-來自Crickmore等網站(申請中引用)登錄號是NCBI條巨

權利要求
1.一種轉基因植物，其包含編碼CrylDa殺蟲蛋白的DNA和編碼CrylCa殺蟲蛋白的DNA。
2.權利要求I的轉基因植物，所述植物進一步包含編碼第三殺蟲蛋白的DNA，所述第三蛋白選自下組CrylFa、Vip3Ab、CrylBe、和 CrylE。
3.權利要求2的轉基因植物，其中所述第三蛋白選自下組=CrylFa和CrylBe，植物進一步包含編碼選自下組的第四和第五殺蟲蛋白的DNA:Cry2A、CrylI、DIG-3、和CrylAb。
4.依照權利要求1-3中任一項的植物的種子，其中所述種子包含所述DNA。
5.包含非Bt避難所植物和依照權利要求1-3中任一項的多個植物的植物田地，其中所述避難所植物占所述田地中的所有作物植物的小于40%。
6.權利要求5的植物田地，其中所述避難所植物占所述田地中的所有作物植物的小于30%。
7.權利要求5的植物田地，其中所述避難所植物占所述田地中的所有作物植物的小于20%。
8.權利要求5的植物田地，其中所述避難所植物占所述田地中的所有作物植物的小于10%。
9.權利要求5的植物田地，其中所述避難所植物占所述田地中的所有作物植物的小于5% ο
10.權利要求5的植物田地，其中所述避難所植物在區組或條中。
11.種子混合物，其包含來自非Bt避難所植物的避難所種子和權利要求4的多個種子，其中所述避難所種子占(comprise)所述混合物中的所有種子的小于40%。
12.權利要求11的種子混合物，其中所述避難所種子構成所述混合物中的所有種子的小于30%ο
13.權利要求11的種子混合物，其中所述避難所種子構成所述混合物中的所有種子的小于20%ο
14.權利要求11的種子混合物，其中所述避難所種子構成所述混合物中的所有種子的小于10% ο
15.權利要求11的種子混合物，其中所述避難所種子構成所述混合物中的所有種子的小于5% ο
16.—種管理昆蟲形成對Cry蛋白的抗性的方法，所述方法包括種植種子以產生權利要求5的植物田地。
17.權利要求5-10中任一項的田地，其中所述植物占據超過10英畝。
18.權利要求1-3中任一項的植物，其中所述植物選自下組玉米、大豆、和棉花。
19.權利要求18的植物，其中所述植物是玉米植物。
20.權利要求1-3中任一項的植物的植物細胞，其中所述植物細胞包含編碼所述CrylCa殺蟲蛋白的所述DNA和編碼所述CrylDa殺蟲蛋白的所述DNA,其中所述CrylCa殺蟲蛋白與SEQ ID NO: I是至少99%相同的，且所述CrylDa殺蟲蛋白與SEQ ID NO: 2是至少99%相同的。
21.權利要求1-3中任一項的植物，其中所述CrylCa殺蟲蛋白包含SEQID N0:1，且所述CrylDa殺蟲蛋白包含SEQ ID NO: 2。
22.—種生成權利要求20的植物細胞的方法。
23.一種控制秋粘蟲昆蟲的方法,其通過使所述昆蟲與CrylCa殺蟲蛋白和CrylDa殺蟲蛋白接觸來進行。
全文摘要
本發明包括用于控制秋粘蟲鱗翅目昆蟲的方法和植物，所述植物包含Cry1Da殺蟲蛋白和Cry1Ca殺蟲蛋白，和包含此對蛋白質的其它蛋白質的各種組合以延遲或預防昆蟲抗性的形成。
文檔編號C12N15/82GK102762733SQ201080064025
公開日2012年10月31日 申請日期2010年12月16日 優先權日2009年12月16日
發明者A.T.伍斯利, J.J.希茨, K.納瓦, N.P.斯托爾, S.L.伯頓, T.米德 申請人:陶氏益農公司