用經修飾的微生物改善乙醇酸發酵產生的制作方法

專利名稱：用經修飾的微生物改善乙醇酸發酵產生的制作方法
用經修飾的微生物改善乙醇酸發酵產生發明目的本發明涉及用于從廉價的碳底物如葡萄糖或其它糖生物產生乙醇酸的改善的方法。本發明涉及修飾大腸桿菌K-12基因組DNA，使得所述微生物包含增加的乳清酸磷酸核糖基轉移酶(orotate phosphoribosyl transferase,OPRTase)活性，其目的是減少副產物乳清酸的產生和優化乙醇酸合成。
背景技術：
乙醇酸(H0CH2C00H)(glycolic acid 或 glycolate),是羧酸的 α -輕基酸家族中最簡單的成員。乙醇酸在非常小的分子上具有雙官能性，即具有醇和中等強酸官能團。其性質使其非常適于廣泛的消費和工業應用，包括用于水井再生(water wellrehabilitation),皮革工業，油氣工業(oil and gas industry),洗漆和紡織品工業，以及作為個人護理產品的成分。乙醇酸亦可用于產生多種聚合材料，包括含聚乙醇酸的熱塑性樹脂。包含聚乙醇酸的樹脂具有良好的阻氣性質(gas barrier property),且此類包含聚乙醇酸的熱塑性樹脂可用于制備具有相同性質的包裝材料(例如飲料容器等)。聚酯聚合物在水性環境中以可控制的速率逐漸水解。該性質使其可用于生物醫學應用如可溶解的縫線，以及用于其中需要酸的受控釋放以減少PH的應用中。目前，在美國每年消費超過15，000噸的乙醇酸。盡管乙醇酸作為痕量成分天然見于甘蔗、甜菜、葡萄和水果，但其主要是合成產生的。用于產生乙醇酸的其它技術描述于文獻或專利申請中。例如，Mitsui Chemincals, Inc.描述了一種通過使用微生物從在末端具有羥基的脂族多元醇產生所述羥基羧酸的方法(EP2025759A1和EP2025760A1)。該方法是如Michihiko Kataoka在其關于使用乙二醇氧化微生物產生乙醇酸的論文中 所述的生物轉化(Biosc1.Biotechnol.Biochem., 2001)。乙醇酸亦使用具有改善的腈水解酶活性的突變體腈水解酶從乙醇腈通過生物轉化產生，且該技術由Dupont de Nemours and Co在W02006/069110中公開。用于通過發酵從可再生資源使用其它細菌菌株產生乙醇酸的方法公開于來自Metabolic Explorer的專利申請(W02007/141316 和 US61/162, 712 和 EP09155971.6，其申請日為 2009 年 3 月 24 日)。出于構建用于產生乙醇酸的更佳菌株的目的，本發明的發明人一直對一些特定大腸桿囷囷株感興趣。大腸桿菌為工業生物技術中使用的第一種生產微生物，且仍舊為最常用的一種。由于對大腸桿菌K-12菌株的多年研究，該菌株內的各種克隆對于操縱重組DNA和產生大量化學品是特別有吸引力的宿主。當前，用于研究和商業目的的大腸桿菌K-12菌株是在對該菌株的最早研究中構建和分離的克隆通過使用X射線輻照，之后用UV輻照以誘導隨機突變所產生的衍生物(Bachmann, B.J.1987.Derivations and genotypes ofsome mutant derivatives of E.coli K-12, p.1191-1219.于 J.L.1ngraham, Κ.B.Low, B.Magasanik, M.Schaechter 和 Η.E.Humbarger(編),Escherichia coli and Salmonellatyphimurium: cellular and molecular biology)。一些突變體或衍生物已經經有目的的選擇而演化，并因此具有充分表征的突變。然而，亦認識到許多當前的衍生物含有未檢測的和/或，尚未表征的等位基因差異。因此，大腸桿菌K-12菌株的成員彼此通過在一個或多個基因中的點突變而不同。許多大腸桿菌K-12菌株在rph基因中具有移碼突變(Jensen K.F.1993，J.Bacteriol.175:3401-3707)。該點突變導致在最后15個密碼子的翻譯中的移碼，并使得rph基因產物的大小減少了 10個氨基酸殘基。該截短的蛋白缺乏核糖核酸酶PH活性，且在rph順反子中的提前翻譯終止解釋了大腸桿菌K-12中乳清酸磷酸核糖基轉移酶的低水平，因為需要轉錄和翻譯的緊密偶聯以支持越過順反子間PryE減弱子的轉錄的最優水平。已顯示該點突變影響下游pyrE基因的表達，該基因編碼乳清酸磷酸核糖基轉移酶(ORPTase),其催化乳清酸至乳清苷5’磷酸的轉化(Poulsen P等1984, EMB03:1783-1790) ο由于pyrE基因的表達減少，ORPTase的減少水平導致底物乳清酸在細胞生長過程中在細胞中和生長培養基中的蓄積(Womack J.E.和O’ DonavanG.A.1978，J.Bacteriol, 136:825-827)。而且，專利US593243描述了在含有移碼突變的大腸桿菌K-12菌株中野生型rph基因的回復增加了此類菌株中產生的異源蛋白的量。乳清酸是不希望的，因為其代表碳的消耗，而該碳本可用于生成生物質或乙醇酸。而且，乳清酸是在乙醇酸純化過程中難以消除的副產物，并因此增加純化成本。此外，痕量乳清酸可使得終產物著色。本發明解決的問題是減少從廉價的碳底物如葡萄糖或其它糖生物產生乙醇酸過程中的乳清酸蓄積。成本的減少可為顯著的，因為乙醇酸產生屬性得到改善。

發明內容
本發明涉及用于改善由大腸桿菌菌株進行的乙醇酸的發酵產生的工藝，其中所述菌株經修飾以改善乳清酸至乳清苷5’磷酸的轉化。所述轉化的增加對乙醇酸的產生具有改善作用。用于發酵產生乙醇酸，其衍生物或前體的方法包括在包含碳源的合適培養基中培養大腸桿菌菌株，并回收培養基中的乙醇酸，其中所述菌株經修飾以改善乳清酸至乳清苷5’磷酸的轉化。在本發明的第一個實施方案中，在經修飾的菌株中增加乳清酸磷酸核糖基轉移酶(OPRTase)比活性。在本發明的另一個實施方案中，修飾所述大腸桿菌菌株以增強磷酸核糖基焦磷酸(PRPP)，一種將乳清酸轉化為乳清苷5’磷酸的反應的必需輔因子的產生。這兩種修飾，OPRTase活性的增加和PRPP產生的增加，都可導入同一大腸桿菌菌株。在本發明的一個優選實施方案中，該菌株進一步經遺傳工程改造以增強乙醇酸的產生。本發明亦涉及用于制備乙醇酸的方法，其中將根據本發明的微生物在包含碳源的合適生長培養基中生長，并回收乙醇酸。

本發明亦涉及經修飾的大腸桿菌菌株，其呈現如上所述的修飾。


圖1:涉及酶PyrE (乳清酸磷酸核糖基轉移酶)和PrsA (PRPP合成酶)的嘧啶生物合成和戊糖磷酸途徑。圖2:顯示三種不同生物合成途徑:乙醇酸、戊糖磷酸和嘧啶途徑的聯系的示意圖。圖3:質粒 pBBRlMCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE-TTs 的圖譜。圖 4:質粒 pBBRlMCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE-prsA-TTs 的圖譜。發明詳述 本發明涉及用于發酵產生乙醇酸，其衍生物或前體的新方法，其包括在包含碳源的合適培養基中培養大腸桿菌菌株，并回收培養基中的乙醇酸，其中所述大腸桿菌菌株經修飾以改善乳清酸至乳清苷5’磷酸的轉化。在本發明的一個優選實施方案中，乙醇酸的產生亦通過修飾大腸桿菌菌株以改善乳清酸至乳清苷5’磷酸的轉化而改善。在本發明中，術語“乙醇酸(glycolate) ”和“乙醇酸(glycolic acid) ”可互換使用。術語“乙醇酸，其衍生物或前體”指乙醇酸形成和降解代謝途徑中所有的中間體化合物。乙醇酸的前體具體為:檸檬酸、異檸檬酸、乙醛酸，和一般而言所有乙醛酸循環的化合物。乙醇酸的衍生物具體為乙醇酸酯如乙醇酸乙酯，乙醇酸甲酯和含有乙醇酸的聚合物如聚乙醇酸。根據本發明，術語“發酵產生”，“發酵”或“培養”可互換使用以表示細菌在包含碳源的合適的生長培養基上的生長，其中所述碳源兼用并同時用于菌株的生長和期望的產物乙醇酸的產生。“合適的培養基”是適于微生物的培養和生長的培養基。此種培養基在微生物發酵領域中是公知的，取決于待培養的微生物。合適的培養基包含“碳源”，其指任何能由微生物代謝的碳源。就本發明而言，“代謝”應理解為其通常含意，即允許微生物生長，或至少維持生命的能量和物質的轉化。在本發明的發酵工藝中，所述碳源用于:-生物質產生一通過轉化培養基的碳源等進行的微生物生長，和-乙醇酸產生一由該生物質將該碳源轉化為乙醇酸。這兩步同時進行，且生長的微生物對碳源的轉化導致乙醇酸在培養基中分泌，因為微生物包含允許此種轉化的代謝途徑。碳源選自下組:葡萄糖、蔗糖、單糖(如果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖)、寡糖(如半乳糖、纖維二糖…)、多糖(如纖維素)、淀粉或其衍生物、甘油和一碳底物。特別優選的碳源是葡萄糖。另一種特別優選的碳源是蔗糖。術語“改善的”，“增加的”，“增加”或“改善”意指經修飾的微生物中乳清酸至乳清苷5’磷酸的轉化的量與相應的未修飾的微生物相比更高。此種轉化可通過多種手段來改善，特別是:-增加起始底物(乳清酸)的數量，-增加輔因子(PRPP)的可獲得性，
-增加催化反應的酶(乳清酸磷酸核糖基轉移酶)的活性。在本發明的一個具體方面，所述菌株具有增加的乳清酸磷酸核糖基轉移酶活性。乳清酸磷酸核糖基轉移酶或“OPRTase”是催化乳清酸至乳清苷5’磷酸(OMP)的轉化的酶。具體而言，所述菌株呈現約30單位的增加的乳清酸磷酸核糖基轉移酶比活性，優選至少50單位且最優選至少70單位。在本發明的一個優選的方面，編碼乳清酸磷酸核糖基轉移酶的基因pyrE的表達增加。術語“表達”指基因至蛋白(即基因產物)的轉錄和翻譯。基因表達可通過多種手段增加，如:-在導入菌株的質粒上表達異源基因；-過表達內源基因，通過用更強的啟動子替代內源啟動子，或通過增加染色體上基因的拷貝數來獲得；-通過位于染色體上另一個或其它位置的人工啟動子來表達基因。在本發明的一個更優選的方面，在具有在rph-pyrE操縱子中的移碼突變的大腸桿菌K12菌株中，基因pyrE的表達得到回復。含有移碼突變的rph基因的核苷酸序列由Jensen，K.F.(1993)列出。此外，野生型rph-pyrE操縱子的核苷酸序列可從GenBank/EMBL數據庫以登錄號X00781和X01713獲得，且順反子間rph-pyrE區段以及側翼區的序列可從EMBL數據庫以登錄號X72920獲得。本領域技術人員亦理解，當提及野生型rph和pyrE DNA序列時,此類序列包括與那些公開或保藏的序列功能上等同的天然和合成序列。術語“大腸桿菌K-12菌株”應理解為包括來自Stanford University的細菌學系的保藏的的培養物大腸桿菌，和所有Lederberg菌株W1485的衍生物，其在用UV光，X射線和/或其它化學或遺傳處理之后，從原始的大腸桿菌K-12菌株產生(Bachmann，B.J.1987.Derivations and genotypes of some mutant derivatives of Escherichiacoli K-12, p.1191-1219.于 J.L.1ngraham, Κ.B.Low, B.Magasanik, M.Schaechter 和H.E.Umbarger(編),Escherichia coli and Salmonella typhinurium:cellular andmolecular biology.American Society for Microbiology, Washington, D.C)。術語“在rph-pyrE操縱子中具有移碼突變的大腸桿菌K12菌株”指攜帶在rph基因上已知的點突變的Lederberg菌株W1485的大腸桿菌菌株衍生物。與那些攜帶未突變的野生型rph基因的菌株相比，從見于rph終止密碼子上游43至47對堿基處的5個“GC”區段缺失一個“CG”堿基對的`大腸桿菌菌株視為突變菌株(Jensen K, 1993，J.Bacteriol.175:3401-3407)。之前說明了大腸桿菌K-12菌株的rph基因中的移碼突變對pyrE基因的表達具有極性作用，PyrE基因位于rph下游，在同一“操縱子”中。因此，在rph基因中的突變導致低水平的乳清酸磷酸核糖基轉移酶，且其結果為乳清酸的蓄積。具有突變的rph-pyrE操縱子的大腸桿菌K_12菌株產生具有約5至20個單位的比活性的乳清酸磷酸核糖基轉移酶(PyrE)，而其它具有野生型rph-pyrE操縱子的大腸桿菌菌株，換言之，其具有野生型PyrE表達，則呈現約30至90單位的OPRTase比活性水平。在rph上具有移碼突變的菌株中乳清酸的蓄積可干擾乙醇酸的產生、分離和純化。因此，通過顯著地減少呈現野生型OPRT活性(至少30個單位的比活性)的大腸桿菌K-12中該乳清酸的蓄積，可顯著改善乙醇酸的產生。術語“回復”指用于重新構建野生型rph-pyrE操縱子的本領域技術人員已知的特定遺傳改變或操作。在此特定情況下,一種增加pyrE的轉錄的可能是通過校正對導致pyrE的不良轉錄的rph中的點突變來回復rph-pyrE操縱子的野生型序列。具有野生型操縱子的大腸桿菌K-12菌株可通過測定乳清酸磷酸核糖基轉移酶活性的水平和/或通過對其中包含的rph-pyrE區進行測序來鑒定。當提及化學化合物的“收率”，“水平”或“量”時，這些術語應理解為意指基本上純的產物的數量。可使用常規化學檢測方法如GCMS、HPLC、分光光度技術和酶活性。在本發明中，酶通過其比活性鑒別。該定義因此包括亦存在于其它生物，更具體而言其它微生物中的所有具有限定的比活性的多肽。具有類似活性的酶可通過與某些家族具有如PFAM或COG定義的同源性來鑒定。PFAM(比對和隱藏的Markov模型的蛋白家族數據庫http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)展示大量蛋白序列比對的收集。每個PFAM使得能夠使多重比對可視化,觀察蛋白域，評價多種生物間的分配，訪問其他數據庫，并使得已知蛋白結構可視化。COG(蛋白同向進化同源組的簇；http://www.ncb1.nlm.nih.gov/COG/)通過比較來自代表30個主要系統發生系的43個全部測序的基因組的蛋白序列而獲得。每個COG從至少三個系定義，這使得可以鑒定先前保守的域。鑒定同源序列及其百分比同源性的方法對于本領域技術人員是公知的，并具體包括BLAST程序,其可從網站http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/以該網站指示的缺省參數進行使用。然后可使用例如程序CLUSTALW(http://www.eb1.ac.uk/cIustalw/)或MULTALIN(http://prodes.toulouse.1nra.fr/multalin/cg1-bin/multalin.pi)以這些網站指示的缺省參數來探查(例如比對)獲得的序列。使用GenBank中對于已知基因給出的參照,本領域技術人員能夠確定其它生物、細菌菌株、酵母、真菌、哺乳動物、植物等中的等同基因。該常規工作有利地使用共同序列，并設計簡并探針以克隆其它生物中的相應基因來進行，所述共同序列可通過與來源于其它微生物的基因進行序列比對來確定。這些分子生物學的常規方法對于本領域技術人員是公知的，并描述于，例如 Sambrook 等(1989Molecular Cloning:a Laboratory Manual.第 2版,Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York)。在本發明的一個具體實施方案中，所述菌株呈現增加的5-磷酸核糖基1-焦磷酸(PRPP)可獲得性。術語“磷酸核糖基焦磷酸”，“5-磷酸核糖1-焦磷酸”和“PRPP”可互換使用。PRPP是一種通過由基因PrsA編碼的酶磷酸核糖基焦磷酸合成酶由核糖-5-磷酸和一個ATP形成的戊糖磷酸(參見圖1)。磷酸核糖基焦磷酸合成酶參與嘌呤、嘧啶和煙酰胺核苷酸的生物合成的第一步和組氨酸和色氨酸的生物合成(來自Ajinomoto的EP1529839A1和EP1700910A2)。PRPP分子亦為由酶OPRTase催化的反應的必需的輔因子(見上)。事實上，該反應使用來自PRPP的戊糖磷酸 模塊。
術語“增加的可獲得性”意指PRPP以與未經修飾的菌株相比更高的量存在:或者是PRPP的產生增加，或者是其消耗減少。在本發明的一個具體方面，增加了編碼磷酸核糖基焦磷酸合成酶的基因prsA的表達，因此PRPP的產生與未經修飾的菌株相比增加。多種方法可用于增加基因的表達，且為本領域技術人員所知:-從質粒DNA表達基因，-在染色體上直接用強啟動子替代基因的天然啟動子，-通過在染色體上的另一個或其它位置上的人工啟動子表達基因。在本發明的另一個實施方案中，對菌株進一步修飾以增強乙醇酸的產生。具體而言，所述經修飾的微生物可包含至少一種下列修飾:-減少乙醛酸至除乙醇酸之外其它產物的轉化，具體通過減弱基因aceB，glcB,gel, eda來獲得，-無法實質性代謝乙醇酸，具體通過減弱基因glcDEFG，aldA來獲得，-增加乙醒酸途徑通量,具體通過減弱基因icd,aceK, pta, ackA, poxB, iclR或fadR，和/或通過過表達基因aceA來獲得，-增加乙醒酸至乙醇酸的轉化,具體通過過表達基因ycdW或yiaE來獲得，-增加NADPH的 可獲得性，具體通過減弱基因pgi，udhA，edd來獲得。具體而言，微生物經修飾以具有除了產生乙醇酸之外，較低的乙醛酸轉化能力，這是由于減弱了編碼消耗乙醛酸(乙醇酸的一個關鍵前體)的酶的基因的表達:-編碼蘋果酸合酶的aceB和gclB基因，-編碼乙醛酸聚醛酶的gel和-編碼2-酮-3-脫氧葡糖酸-6-磷酸醛縮酶的eda。多種方法可用于減弱基因的表達:-將突變導入基因，減少該基因的表達水平，-用弱啟動子替代基因的天然啟動子，導致較低的表達，_缺失基因，若無需表達。在本發明的進一步的實施方案中，對大腸桿菌K12菌株進行修飾使其無法實質性代謝乙醇酸。該結果可通過減弱至少一種編碼消耗乙醇酸的酶的基因來取得:-編碼乙醇酸氧化酶的glcDEF，和-編碼乙醇醛脫氫酶的aldA。基因的減弱可通過來用低強度啟動子或使得相應的信使RNA或蛋白不穩定的元件替代天然啟動子完成。若需要，基因的完全減弱亦可通過缺失相應的DNA序列來取得。在另一個實施方案中，根據本發明的大腸桿菌K12菌株經轉化以增加乙醛酸途徑通量。乙醛酸途徑中的通量可通過不同手段來增加，且特別是:i)減少由icd基因編碼的酶異檸檬酸脫氫酶的活性，ii)減少至少一種下列酶的活性:-由pta基因編碼的磷酸轉乙酰酶-由ack基因編碼的乙酸激酶
-由poxB基因編碼的丙酮酸氧化酶-由aceK基因編碼的Icd激酶-磷酸酶iii)增加由aceA基因編碼的酶異檸檬酸裂合酶的活性。減少異檸檬酸脫氫酶的水平可通過導入驅動編碼異檸檬酸脫氫酶的icd基因的表達的人工啟動子，或通過將減少蛋白的酶活性的突變導入icd基因來實現。因為蛋白Icd的活性通過磷酸化減少，其亦可通過導入相對于野生型AceK酶具有增加的激酶活性或減少的磷酸酶活性的突變體aceK基因來調控。增加異檸檬酸裂合酶的活性可通過減弱編碼乙醛酸途徑抑制物的iclR或fadR基因的水平，或通過刺激aceA基因的表達，例如通過導入驅動該基因表達的人工啟動子，或通過將增加編碼蛋白的活性的突變導入aceA基因來實現。在本發明的另一個實施方案中，所述大腸桿菌K12菌株含有至少一個編碼催化乙醛酸至乙醇酸的轉化的多肽的基因。在一個優選的方式中，增加所述基因的表達。具體而言，該多肽是酶NADPH依存性乙醛酸還原酶，其將有毒的乙醛酸中間物轉化為乙醇酸。 優選地，所述基因選自來自大腸桿菌MG1655的基因組的ycdW或yiaE基因。若需要的話，高水平的NADPH依存性乙醛酸還原酶活性可從染色體上編碼的基因通過使用基因組上的一個或幾個拷貝來獲得，所述拷貝可通過本領域技術人員已知的重組方法導入。對于染色體外基因，可使用不同類型的質粒，這些質粒就其復制起點和因此其在細胞中的拷貝數而不同。它們可以以I至5個拷貝，約20個或多至500個拷貝存在，其分別對應于具有嚴緊復制的低拷貝數質粒(pSClOl，RK2)，低拷貝數質粒(pACYC，pRSFlOlO)或高拷貝數質粒(pSK bluescript II)。所述ycdW或yiaE基因可使用具有不同強度,需要或不需要由誘導物分子誘導的啟動子來表達。實例為啟動子Ptrc, Ptac, Plac, lambda啟動子cl或其它本領域技術人員已知的啟動子。基因的表達亦可通過使相應的信使RNA(Carrier和 Keasling(1998)Biotechnol.Prog.15,58-64)或蛋白(例如 GST 標簽，AmershamBiosciences)穩定的元件來增強。編碼所述多肽的基因可為外源或內源的，并可在染色體上或染色體外表達。在本發明的另一個實施方案中，所述大腸桿菌K12菌株對于NADPH依存性乙醛酸還原酶呈現增加的NADPH可獲得性，其提供了更佳的乙醇酸產生的收率。對微生物的該修飾可通過減弱至少一種選自下組的基因來獲得:-編碼葡萄糖-6-磷酸異構酶的pgi，-編碼可溶性轉氫酶的UdhAjP-編碼6-磷酸葡糖酸脫水酶活性的edd。在這些遺傳修飾存在下，所有的葡萄糖-6-磷酸將必須通過戊糖磷酸途徑進入糖酵解，且對于每個代謝的葡萄糖-6-磷酸將產生2個NADPH。在本發明的一個優選實施方案中，所述經修飾的微生物包含基因aceB, glcB, gel,eda, glcDEFG, aldA, icd, aceK, pta, ackA, poxB, iclR 的減弱和基因 aceA 和 ycdff 的過表達。任選地，所述經修飾的微生物亦可包含基因pgi，udhA,和edd的減弱。在本發明的一個實施方案中，所述碳源選自下組:葡萄糖、蔗糖、單糖或寡糖、淀粉或其衍生物或甘油，及其組合。
之前描述的本發明亦涉及用于發酵制備乙醇酸的方法，其包括下列步驟:a)發酵產生乙醇酸的微生物，b)在細菌或在培養基中濃縮乙醇酸,和c)從發酵液和/或任選地以部分或全部量(O至100%)遺留在終產物中的生物質
分離乙醇酸。在一個具體實施方案中，所述乙醇酸通過聚合至至少乙醇酸二聚體的步驟進行分離，并通過從乙醇酸二聚體、寡聚體和/多聚體解聚來回收。本領域技術人員能夠定義對于根據本發明的微生物的培養條件。具體而言，大腸桿菌K12菌株在30至37°C的溫度發酵。發酵通常在含有無機培養基的發酵罐中進行，所述培養基具有調適于使用的細菌的已知的限定組成，含有至少一種簡單碳源，且若需要含有產生代謝物必需的共底物。本發明亦涉及具有增強的乳清酸至乳清苷5’-磷酸的轉化的大腸桿菌K-12菌株。具體而言，所述菌株呈現增加的乳清酸磷酸核糖基轉移酶比活性。在本發明的一個優選的方面，編碼乳清酸磷酸核糖基轉移酶的基因pyrE的表達在所述菌株中增加。在本發明的一個具體方面，所述菌株經修飾使得基因pyrE的表達在具有rph-pyrE操縱子中 的移碼突變的大腸桿菌K12菌株中回復。在本發明的另一個方面，所述菌株呈現增加的5-磷酸核糖基1-焦磷酸(PRPP)的
可獲得性。具體而言，本發明涉及大腸桿菌菌株，其中增加了基因pyrE的表達和PRPP的產生。更具體而言，本發明涉及大腸桿菌菌株，其中如上所述編碼磷酸核糖基焦磷酸合酶的基因PrsA過表達。在本發明的另一個實施方案中，所述經修飾的大腸桿菌菌株進一步經修飾以產生具有高收率的乙醇酸。具體而言，所述大腸桿菌菌株包含至少一種下列修飾:-減少乙醛酸至除乙醇酸之外其它產物的轉化，具體通過減弱基因aceB，glcB,gel, eda來獲得，-無法實質性代謝乙醇酸，具體通過減弱基因glcDEFG，aldA來獲得，-增加乙醒酸途徑通量,具體通過減弱基因icd,aceK, pta, ackA, poxB, iclR或fadR，和/或通過過表達基因aceA來獲得，-增加乙醒酸至乙醇酸的轉化,具體通過過表達基因ycdW或yiaE來獲得，-增加NADPH的可獲得性，具體通過減弱基因pgi，udhA,edd來獲得。該微生物優選為大腸桿菌K-12菌株，具有rph移碼突變[參見Machida，H.和Kuninaka, A.(1969) and “Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular andMolecular Biologyl987]，首先校正為含有至少野生型的OPRT活性，然后經遺傳工程改造，尤其是避免任何乙醛酸至除了乙醇酸之外的產物的轉化。此類菌株可通過本文中已經描述的不同方法鑒定:通過測量OPRT活性，通過對rph-pyrE操縱子的DNA序列分析，和/或通過檢查乳清酸蓄積的水平。實施例使用了數種實驗方案以構建后續實施例中描述的產生乙醇酸的菌株。這些方案如下文詳述。實驗方案1:導入用于重組的PCR產物并選擇重組體(Cre-LOX系統)使用選定的、在表I中給出的用于替代基因或基因間區域的寡核苷酸從質粒loxP-cm-loxP (Gene Bridges)擴增氯霉素抗性盒或從質粒 loxP-PGK-gb2-neo_loxP (GeneBridges)擴增新霉素抗性盒。然后將獲得的PCR產物通過電穿孔導入攜帶質粒PKD46的受體株，其中表達的系統XRed(Y，β，exo)極大地有利于同源重組。然后選擇抗生素抗性轉化體，并用表2中給出的合適的寡核苷酸通過PCR分析檢查抗性盒的插入。實驗方案2:用噬菌體Pl進行基因缺失的轉導將DNA從一種大腸桿菌菌株轉移至另一種是通過用噬菌體Pl的轉導技術進行的。該實驗方案分兩步進行，(i)對具有單一修飾基因的供體株制備噬菌體裂解液，和(ii)通過該噬菌體裂解液轉導受體株。

噬菌體裂解液的制備-用100μ I具有單一修飾基因的株MG1655的過夜培養物接種10mlLB+Cm30 μ g/ml/Km50 μ g/ml+ 葡萄糖 0.2%+CaCl25mM。-在37°C振蕩溫育30分鐘。-添加100μ I對于供體株MG1655制備的噬菌體裂解液Pl (大約IxlO9個噬菌體
/ml) ο-在37°C振蕩3小時直至所有細胞裂解。-添加200μ I氯仿，并渦旋。-以4500g離心10分鐘以消除細胞碎片。-將上清轉移到滅菌管中，并添加200μ I氯仿。-將裂解液在4°C儲藏。MS-以1500g將5ml的LB培養基中的大腸桿菌受體株的過夜培養物離心10分鐘。-將細胞沉淀懸浮于1.5ml 的 MgSO4IOmM, CaCl25mM 中。-對照管:100μ I細胞100 μ I具有單一基因缺失的株MG1655的噬菌體Pl。-管測試:100μ I細胞+100 μ I具有單一修飾基因的株MG1655的噬菌體Pl。-在30°C溫育30分鐘，無振蕩。-在每個管中添加100μ I檸檬酸鈉1Μ，并渦旋。-添加Iml 的 LB。-在37°C振蕩溫育I小時-在以7000rpm將試管離心3分鐘之后鋪板于平板LB+Cm30μ g/ml/Km50 μ g/ml上。-在37°C溫育過夜。然后選擇抗生素抗性轉化體，并用表2中給出的合適的寡核苷酸通過PCR分析檢查缺失的插入。
權利要求
1.一種用于發酵產生乙醇酸，其衍生物或前體的方法，其包括在包含碳源的合適培養基中培養大腸桿菌(Escherichia coli)菌株,并回收所述培養基中的乙醇酸,其中所述菌株經過修飾以改善乳清酸至乳清苷5’ -磷酸的轉化。
2.權利要求1的方法，其中所述菌株呈現增加的乳清酸磷酸核糖基轉移酶比活性(specific activity)。
3.權利要求2的方法，其中編碼所述乳清酸磷酸核糖基轉移酶的基因pyrE的表達增加。
4.權利要求1至3中任一項的方法，其中在具有在rph-pyrE操縱子中的移碼突變的大腸桿菌K12菌株中，基因pyrE的表達得到回復。
5.權利要求1至4中任一項的方法，其中所述菌株呈現增加的5-磷酸核糖基1-焦磷酸(PRPP)可獲得性。
6.權利要求5的方法，其中編碼磷酸核糖基焦磷酸合酶的基因prsA的表達增加。
7.權利要求1至6中任一項的方法，其中所述菌株經進一步修飾以增強乙醇酸的產生。
8.權利要求7的方法，其中所述經修飾的微生物包含至少一種下列修飾: -減少乙醒酸至除乙醇酸之外其它產物的轉化,具體通過減弱基因aceB, glcB, gel,eda來獲得， -無法實質性代謝乙醇酸，具體通過減弱基因glcDEFG，aldA來獲得，-增加乙醒酸途徑通量，具體通過減弱基因icd, aceK, pta, ackA, poxB, iclR或fadR,和/或通過過表達基因aceA來獲得， -增加乙醛酸至乙醇酸的轉化，具體通過過表達基因ycdW或yiaE來獲得， -增加NADPH的可獲得性，具體通過減弱基因pgi，udhA, edd來獲得。
9.權利要求1至8中任一項的方法，其中所述碳源選自下組:葡萄糖、蔗糖、單糖或寡糖、淀粉或其衍生物或甘油，及其組合。
10.一種如權利要求1至9中任一項所要求保護的用于發酵制備乙醇酸的方法，其包括下列步驟: a)發酵產生乙醇酸的微生物， b)在細菌或在培養基中濃縮乙醇酸，和 c)從發酵液和/或任選地以部分或全部量(O至100%)遺留在終產物中的生物質分離乙醇酸。
11.權利要求10中所述的方法，其中所述乙醇酸通過聚合至至少乙醇酸二聚體的步驟進行分離，并通過從乙醇酸二聚體、寡聚體和/多聚體解聚來回收。
12.一種大腸桿菌菌株，其中所述菌株經過修飾以改善乳清酸至乳清苷5’ -磷酸的轉化。
13.權利要求12的菌株，其中所述菌株呈現增加的乳清酸磷酸核糖基轉移酶比活性。
14.權利要求13的菌株，其中編碼所述乳清酸磷酸核糖基轉移酶的基因pyrE的表達增加。
15.權利要求12至14中任一項的菌株，其中在具有在rph-pyrE操縱子中的移碼突變的大腸桿菌K12菌株中，基因pyrE的表達得到回復。
16.權利要求12至15中任一項的菌株，其中所述菌株呈現增加的5-磷酸核糖基1-焦磷酸(PRPP)可獲得性。
17.權利要求16的菌株，其中編碼磷酸核糖基焦磷酸合酶的基因prsA的表達增加。
18.權利要求12至17中任一項的菌株，其中所述菌株經進一步修飾以增強乙醇酸的產生。
19.權利要求18的菌株，其中所述經修飾的微生物包含至少一種下列修飾: -減少乙醒酸至除乙醇酸之外其它產物的轉化,具體通過減弱基因aceB, glcB, gel,eda來獲得， -無法實質性代謝乙醇酸，具體通過減弱基因glcDEFG，aldA來獲得， -增加乙醒酸途徑通量，具體通過減弱基因icd, aceK, pta, ackA, poxB, iclR或fadR,和/或通過過表達基因aceA來獲得， -增加乙醛酸至乙醇酸的轉化，具體通過過表達基因ycdW或yiaE來獲得， -增加NADPH的可獲得性，具體通 過減弱基因pgi，udhA, edd來獲得。
全文摘要
本發明涉及用于一種用于發酵產生乙醇酸，其衍生物或前體的方法，其包括在包含碳源的合適培養基中培養大腸桿菌菌株，并回收培養基中的乙醇酸，其中所述大腸桿菌菌株經過修飾以改善乳清酸至乳清苷5’-P的轉化。本發明亦涉及經修飾的大腸桿菌菌株，其顯示改善的乳清酸至乳清苷5’磷酸的轉化，且任選地進一步經修飾以供改善的乙醇酸產生。
文檔編號C12N9/12GK103189517SQ201080069872
公開日2013年7月3日 申請日期2010年8月27日 優先權日2010年8月27日
發明者W.迪斯切特, C.科洛姆, G.貝斯特爾-科雷爾 申請人:代謝探索者公司