專利名稱：一種快速抑制啤酒酵母細胞酸性海藻糖分解酶活性的方法
技術領域：
本發明屬于農副產品精深加工及其副產物綜合利用的技術領域，涉及一種利用高壓脈沖電場技術快速抑制啤酒酵母細胞酸性海藻糖分解酶活性的方法。
背景技術：
海藻糖已被認定為21世紀生命之糖，目前其提取分離技術與其應用領域已被國內外學者認定為熱點問題與焦點問題。海藻糖是一種由兩個葡萄糖分子通過糖苷鍵連接的非還原性雙糖。隨著海藻糖在凍結、干燥、高滲透壓等特殊環境下，能對生物膜、膜蛋白質、 核酸類等發揮保護效果的這種特殊功能的發現和認識的增進，以及對海藻糖性質研究的深入，促使科技工作者爭先進行對海藻糖生產技術的研究開發。海藻糖目前作為一種良好的生物保護劑已引起產業界人士的高度重視。同時海藻糖作為一種應急代謝物，能賦予動物、 植物和微生物等抵抗營養缺乏、高溫、低溫、干燥、高滲透壓、有毒物質等惡劣環境的能力， 因而在食品、醫藥、化妝品等領域具有廣闊的應用前景。啤酒酵母細胞因富含海藻糖而被認為是極具發展前景的重要海藻糖源。啤酒酵母細胞在一些極端環境(冷凍、干燥、熱處理等)下，可以通過調節海藻糖的合成來抵御外界的不良傷害，積累大量的海藻糖，海藻糖含量被認為是酵母耐性的重要鑒定指標。啤酒酵母泥目前仍然是啤酒生產企業的污染物與廢棄物，若能深入研究并從中開發海藻糖產品，將有利于解決啤酒生產企業的環境污染問題。啤酒廢酵母是啤酒生產中的主要副產物，是指啤酒釀造后沉降在發酵罐底部的酵母泥，主要是仍具有活性的酵母細胞和酒花碎片及少量死細胞弱細胞組成。據估算，每生產100噸啤酒大約產生啤酒廢酵母 1.5 2.0噸(含水75% 80% )，折合干酵母(含水8%-10%)約為0. 35 0. 4噸，目前我國啤酒年產量已達到4000萬噸，如此推算，全國啤酒行業一年可排放啤酒廢酵母60 80萬噸左右，約占啤酒廠總污染的1/3。目前，廢酵母的主要去向是隨廢水排棄或用作飼料，仍以廢棄物排放，不但對生產企業環境造成嚴重污染，而且對營養價值相當豐富的啤酒廢酵母資源的造成巨大浪費。因此如果能夠合理利用這一資源進行廣泛而深入地研究和開發海藻糖產品，既可減少環境污染，又可創造極其可觀的經濟效益，還可以為啤酒廢酵母泥綜合開發成高附加值產品提供一種可行的技術路線，對發展啤酒廢酵母的資源化利用具有重要的意義。啤酒酵母細胞中海藻糖分解酶活性直接影響海藻糖提取率及其技術開發。啤酒酵母細胞中存在海藻糖分解酶，其活性高低是影響海藻糖在細胞中積累量的主要因素，也將直接影響到海藻糖的生產成本和提取率以及啤酒酵母泥增值效益。高壓脈沖電場技術抑制啤酒酵母泥中酸性海藻糖分解酶技術，有利于啤酒酵母泥中海藻糖的提取技術的可行性、高效性、環保性。高壓脈沖電場(High-Voltage Pulsed Electrc Field，簡稱PEF)技術是一項處于國際研究熱點的非熱加工高新技術。通過增加細胞膜通透性，減弱細胞膜強度，最終導致細胞膜破壞，膜內細胞物質外流，膜外物質滲入， 具有耗能少、處理時間短、效率高、不易引起蛋白質和核糖核酸變性的優點。
此外，相關研究發現，PEF技術對不同的生物酶有快速激活或抑制作用，本發明專利是再大量實驗研究的基礎上，優化獲得高壓脈沖電場快速抑制啤酒酵母細胞酸性海藻糖分解酶活性技術參數。言而總之，本發明專利要求保護的是一種以啤酒酵母細胞為原料，利用流動式高壓脈沖電場裝置，安裝長度與半徑均適宜的電極，控制高壓脈沖電場裝置中的電場強度和頻率在其適宜范圍內，將適宜濃度和適宜PH值的啤酒酵母細胞懸浮液以一定的恒流速度泵入高壓脈沖電場電極處流處理后收集于成品罐中，實現了在60μ S的時間內啤酒酵母細胞酸性海藻糖分解酶活性抑制率達到95%以上的技術突破，其優勢主要體現在以下兩個方第一，本專利技術是以高壓脈沖電場技術為核心技術。PEF技術優勢具體體現在
(1)PEF處理通常是選取室溫、低于室溫、或稍微高于室溫等溫度條件下進行操作，因此，對食品質量屬性來說，PEF技術避免或很大程度上減少了食品感官和物理特性的有害變化；
(2)PEF技術具有處理時間非常短(小于ls)，傳遞快速，適合工業化生產。(3)PEF技術具有處理均勻、安全等特點。特別強調的是，將高壓脈沖電場技術應用于抑制啤酒酵母細胞酸性海藻糖分解酶活性的研究中，其技術優勢突出體現在=(I)PEF法抑制啤酒酵母細胞酸性海藻糖分解酶活性，抑制率達到95%以上；⑵PEF法處理時間短，僅為60 μ s以內，并可以進行連續工業化生產；(3)高壓脈沖電場能耗較低，更適合啤酒酵母細胞高附加值產品開發的綠色低碳主題。第二，本專利技術是以啤酒酵母細胞為原料，可以由啤酒酵母泥經除雜、脫苦處理 (專利發明人已公開發表論文中具體優化獲得最佳技術參數)制備啤酒酵母細胞，具有來源廣泛，原料成本低廉，適于啤酒工業的副產物增值增效技術應用。本專利發明人公開發表論文《廢棄啤酒酵母泥除雜、脫苦工藝條件的篩選與其RNA 提取技術的優化》[J].食品科學，2008，29 (10) :404-407.，公開了一種利用啤酒廢酵母泥經除雜和脫苦處理后制備啤酒酵母細胞的工藝流程啤酒廢棄酵母泥一8%酵母懸液一過80 目篩2次一加5%酒石酸，沉降30min — 4°C，3600r/min，離心IOmin —棄上清液一啤酒廢酵母細胞一冷藏備用。本專利技術能夠為啤酒生產工業實現蛋殼資源的綜合利用開辟了一個新途徑。綜上所述，縱觀國內外相關研究與技術報道，未見利用利用高壓脈沖電場技術快速抑制啤酒酵母細胞酸性海藻糖分解酶活性的方法，實現了在60 μ s的時間內啤酒酵母細胞酸性海藻糖分解酶活性抑制率達到95%以上的技術突破。
發明內容
本發明所需要解決的技術問題是公開一種利用高壓脈沖電場技術快速抑制啤酒酵母細胞酸性海藻糖分解酶活性的方法。本發明的技術方案是一種采用啤酒酵母細胞為原料，利用高壓脈沖電場技術快速抑制啤酒酵母細胞酸性海藻糖分解酶活性的方法，包括啤酒酵母細胞懸浮液的制備、懸浮液酸度的調配、高壓脈沖電場參數的調控、懸浮液恒流泵料速度的調控工藝過程。所述的啤酒酵母細胞懸浮液的制備過程，倘若以活的啤酒酵母細胞為原料，則是按照啤酒酵母細胞水=1 10 1 100 (g/mL)混合均勻即為啤酒酵母細胞懸浮液；倘若以啤酒酵母泥為原料，則是先將啤酒廢棄酵母泥配制成8%混合液，過80目篩2次，再加 5%酒石酸后自然沉降30min后，進行低溫離心處理(4°C，3600r/min，lOmin)，棄上清液，獲得啤酒廢酵母細胞；而后再按照啤酒酵母細胞水=1 10 1 100 (g/mL)混合均勻即為啤酒酵母細胞懸浮液，即可進行酸度的調配處理。所述的酸度的調配過程，是將啤酒酵母細胞懸浮液即刻放置于在5 20°C溫度環境下進行機械或者磁力攪拌，時間控制在1 5min范圍內，并再攪拌過程中利用0. IM鹽酸溶液和0. IM氫氧化鈉溶液調配啤酒酵母細胞懸浮液pH值至1. 5 5. 5后，即可進行高壓脈沖電場參數的調控處理。所述的高壓脈沖電場參數的調控過程，是選用長度為0. 5 3. 5mm、半徑為0. 5 0.8mm的適宜電極，而后依次選用75%乙醇、去離子水、酸性去離了水(利用0. IM鹽酸溶液利0. IM氫氧化鈉溶液調配pH值至1. 5 5. 5)分別清洗高壓脈沖電場內物料循環管路 2 3次后，再調整設定高壓脈沖電場裝置的電場強度為10 45kV/cm和頻率為1000 3000Hz后，即可進行物料恒流泵調控處理。所述的恒流泵料速度的調控過程，是將物料恒流泵調控至啤酒酵母細胞懸浮液流量為10 45mL/min，按照高壓脈沖電場電極處理前的管路溶液體積，進行核算未經電場處理樣液體積所需歷經時間后再進行收集酸性海藻糖分解酶活性抑制率達到95%以上的啤酒酵母細胞懸浮液于成品罐中。本發明技術效果如下(1)本發明是以啤酒酵母細胞或者啤酒酵母泥為原料，采用高壓脈沖電場技術，僅經60μ s的時間內即可獲得酸性海藻糖分解酶活性抑制率達到95%以上的啤酒酵母細胞懸浮液，能夠為綜合開發啤酒酵母泥資源開辟一條新的途徑。(2)本發明設計的工藝路線簡捷，設備投入少，工業化推廣可行，是一種啤酒工業生產企業廢棄物——啤酒酵母泥的綜合利用和減少排污的有效方法。(3)在本發明的制備方法中，所獲得的酸性海藻糖分解酶活性抑制率達到95%以上的啤酒酵母細胞懸浮液，可以進行后續的海藻糖提取與分離，海藻糖得率提高至97.6%。總之，本發明是以啤酒酵母細胞為主要原料，經過高壓脈沖電場處理后，實現了在 60μ s的時間內啤酒酵母細胞酸性海藻糖分解酶活性抑制率達到95%以上，不僅為快速提取海藻糖生產工藝研究提供了技術支撐，也可為啤酒酵母泥變廢為寶綜合開發技術研發奠定一定基石出。ο
具體實施例方式實施例1 以活酵母細胞為原料，按照啤酒酵母細胞水=1 10g/mL混合均勻后，即刻放置于在5°C溫度環境下進行機械攪拌5min，并再攪拌過程中利用0. IM鹽酸溶液和OlM氫氧化鈉溶液調配啤酒酵母細胞懸浮液PH值至1. 5 ；選用長度為05mm、半徑為0. 5mm的適宜電極，而后依次選用75%乙醇、去離子水、酸性去離子水(利用0. IM鹽酸溶液和0. IM氫氧化鈉溶液調配PH值至15)分別清洗高壓脈沖電場內物料循環管路2次后，再調整設定高壓脈沖電場裝置的電場強度為45kV/cm和頻率為3000Hz后，再將物料恒流泵調控至啤酒酵母細胞懸浮液流量為45mL/min，按照高壓脈沖電場電極處理前的管路溶液體積，進行核算未經電場處理樣液體積所需歷經時間后再進行收集酸性海藻糖分解酶活性制率達到95%以上的啤酒酵母細胞懸浮液于成品罐中。實施例2 以啤酒酵母泥為原料，則是先將啤酒廢棄酵母泥配制成8%混合液，過80目篩2 次，再加5%酒石酸后自然沉降30min后，進行低溫離心處理(4°C，3600r/min，lOmin)，棄上清液，獲得啤酒廢酵母細胞；而后再按照啤酒酵母細胞水=1 20g/mL混合均勻，即刻放置于在18°C溫度環境下進行磁力攪拌3min，并再攪拌過程中利用0. IM鹽酸溶液和0. IM 氫氧化鈉溶液調配啤酒酵母細胞懸浮液PH值至2. 5 ；選用長度為1. 5mm、半徑為0. 5mm的適宜電極，而后依次選用75%乙醇、去離子水、酸性去離子水(利用0. IM鹽酸溶液和0. IM氫氧化鈉溶液調配PH值至2. 5)分別清洗高壓脈沖電場內物料循環管路2次后，再調整設定高壓脈沖電場裝置的電場強度為35kV/cm和頻率為2500Hz后，再將物料恒流泵調控至啤酒酵母細胞懸浮液流量為35mL/min，按照高壓脈沖電場電極處理前的管路溶液體積，進行核算未經電場處理樣液體積所需歷經時間后再進行收集酸性海藻糖分解酶活性抑制率達到 95%以上的啤酒酵母細胞懸浮液于成品罐中。實施例3 以活酵母細胞為原料，按照啤酒酵母細胞水=1 lOOg/mL混合均勻后，即刻放置于在10°C溫度環境下進行磁力攪拌5min，并再攪拌過程中利用0. IM鹽酸溶液和0. IM氫氧化鈉溶液調配啤酒酵母細胞懸浮液PH值至3. 5 ；選用長度為3. 5mm、半徑為0. 8mm的適宜電極，而后依次選用75%乙醇、去離子水、酸性去離子水(利用0. IM鹽酸溶液和0. IM氫氧化鈉溶液調配PH值至3. 5)分別清洗高壓脈沖電場內物料循環管路3次后，再調整設定高壓脈沖電場裝置的電場強度為lOkV/cm和頻率為2000Hz后，再將物料恒流泵調控至啤酒酵母細胞懸浮液流量為25mL/min，按照高壓脈沖電場電極處理前的管路溶液體積，進行核算未經電場處理樣液體積所需歷經時間后再進行收集酸性海藻糖分解酶活性抑制率達到 95%以上的啤酒酵母細胞懸浮液于成品罐中。實施例4:以啤酒酵母泥為原料，則是先將啤酒廢棄酵母泥配制成8%混合液，過80目篩2 次，再加5%酒石酸后自然沉降30min后，進行低溫離心處理(4°C，3600r/min，lOmin)，棄上清液，獲得啤酒廢酵母細胞；而后再按照啤酒酵母細胞水=1 60g/mL混合均勻，即刻放置于在20°C溫度環境下進行機械攪拌5min，并再攪拌過程中利用0. IM鹽酸溶液和0. IM氫氧化鈉溶液調配啤酒酵母細胞懸浮液PH值至4. 5 ；選用長度為2. 5mm、半徑為0. 8mm的適宜電極，而后依次選用75%乙醇、去離子水、酸性去離子水(利用0. IM鹽酸溶液和0. IM氫氧化鈉溶液調配PH值至4. 5)分別清洗高壓脈沖電場內物料循環管路3次后，再調整設定高壓脈沖電電場裝置的電場強度為15kV/cm和頻率為3000Hz后，再將物料恒流泵調控至啤酒酵母細胞懸浮液流量為35mL/min，按照高壓脈沖電場電極處理前的管路溶液體積，進行核算未經電場處理樣液體積所需歷經時間后再進行收集酸性海藻糖分解酶活性抑制率達到 95%以上的啤酒酵母細胞懸浮液于成品罐中。實施例5 以活酵母細胞為原料，按照啤酒酵母細胞水=1 40g/mL混合均勻后，即刻放置于在15°C溫度環境下進行磁力攪拌lmin，并再攪拌過程中利用OlM鹽酸溶液和0. IM氫氧化鈉溶液調配啤酒酵母細胞懸浮液PH值至5. 5 ；選用長度為2. 0mm、半徑為0. 6mm的適宜電極，而后依次選用75%乙醇、去離子水、酸性去離子水(利用0. IM鹽酸溶液和0. IM氫氧化鈉溶液調配PH值至5. 5)分別清洗高壓脈沖電場內物料循環管路2次后，再調整設定高壓脈沖電場裝置的電場強度為lOkV/cm和頻率為1200Hz后，再將物料恒流泵調控至啤酒酵母細胞懸浮液流量為45mL/min，按照高壓脈沖電場電極處理前的管路溶液體積，進行核算末經電場處理樣液體積所需歷經時間后再進行收集酸性海藻糖分解酶活性抑制率達到 95%以上的啤酒酵母細胞懸浮液于成品罐中。實施例6 以啤酒酵母泥為原料，則是先將啤酒廢棄酵母泥配制成8%混合液，過80目篩2 次，再加5%酒石酸后自然沉降30min后，進行低溫離心處理(4°C，3600r/min，lOmin)，棄上清液，獲得啤酒廢酵母細胞；而后再按照啤酒酵母細胞水=1 80g/mL混合均勻，即刻放置于在5°C溫度環境下進行機械攪拌4min，并再攪拌過程中利用0. IM鹽酸溶液和0. IM氫氧化鈉溶液調配啤酒酵母細胞懸浮液PH值至5. 5 ；選用長度為3. 5mm、半徑為0. 7mm的適宜電極，而后依次選用75%乙醇、去離子水、酸性去離子水(利用0. IM鹽酸溶液和0. IM氫氧化鈉溶液調配PH值至5. 5)分別清洗高壓脈沖電場內物料循環管路3次后，再調整設定高壓脈沖電場裝置的電場強度為25kV/cm和頻率為1000Hz后，再將物料恒流泵調控至啤酒酵母細胞懸浮液流量為lOmL/min，按照高壓脈沖電場電極處理前的管路溶液體積，進行核算未經電場處理樣液體積所需歷經時間后再進行收集酸性海藻糖分解酶活性抑制率達到 95%以上的啤酒酵母細胞懸浮液于成品罐中。
權利要求
1.一種采用啤酒酵母細胞為原料，利用高壓脈沖電場技術快速抑制啤酒酵母細胞酸性海藻糖分解酶活性的方法，包括啤酒酵母細胞懸浮液的制備、懸浮液酸度的調配、高壓脈沖電場參數的調控、懸浮液恒流泵料速度的調控工藝過程。1)所述的啤酒酵母細胞懸浮液的制備過程，倘若以活酵母細胞為原料，則是按照啤酒酵母細胞水=1 10 1 100(g/mL)混合均勻即為啤酒酵母細胞懸浮液；倘若以啤酒酵母泥為原料，則是先將啤酒廢棄酵母泥配制成8%混合液，過80目篩2次，再加5%酒石酸后自然沉降30min后，進行低溫離心處理(4°C，3600r/min, IOmin)，棄上清液，獲得啤酒廢酵母細胞；而后再按照啤酒酵母細胞水=1 10 1 100(g/mL)混合均勻即為啤酒酵母細胞懸浮液，即可進行酸度的調配處理。2)所述的酸度的調配過程，是將啤酒酵母細胞懸浮液即刻放置于在5 20°C溫度環境下進行機械或者磁力攪拌，時間控制在1 5min范圍內，并再攪拌過程中利用0. IM鹽酸溶液和0. IM氫氧化鈉溶液調配啤酒酵母細胞懸浮液pH值至1. 5 5. 5后，即可進行高壓脈沖電場參數的調控處理。3)所述的高壓脈沖電場參數的調控過程，是選用長度為0.5 3. 5mm、半徑為0. 5 Omm的適宜電極，而后依次選用75%乙醇、去離子水、酸性去離子水(利用0. IM鹽酸溶液和 0. IM氫氧化鈉溶液調配pH值至1. 5 5. 5)分別清洗高壓脈沖電場內物料循環管路2 3 次后，再調整設定高壓脈沖電場裝置的電場強度為10 45kV/cm和頻率為1000 3000Hz 后，即可進行物料恒流泵調控處理。4)所述的恒流泵料速度的調控過程，是將物料恒流泵調控至啤酒酵母細胞懸浮液流量為10 45mL/min，按照高壓脈沖電場電極處理前的管路溶液體積，進行核算未經電場處理樣液體積所需歷經時間后再進行收集酸性海藻糖分解酶活性抑制率達到95%以上的啤酒酵母細胞懸浮液于成品罐中。
2.按權利要求1所述的一種快速抑制啤酒酵母細胞酸性海藻糖分解酶活性的方去，其特征在于，所述的啤酒酵母細胞，可以直接利用活的啤酒酵母細胞，也可以利用啤酒酵母泥為原料，經過除雜和脫苦處理過程，即為將啤酒廢棄酵母泥配制成8%混合液，過80目篩2 次，再加5%酒石酸后自然沉降30min后，進行低溫離心處理(4°C，3600r/min，lOmin)，棄上清液，獲得啤酒廢酵母細胞。
全文摘要
本發明是公開一種快速抑制啤酒酵母細胞酸性海藻糖分解酶活性的方法，屬于農副產品精深加工及其副產物綜合利用的技術領域，特別涉及一種利用高壓脈沖電場技術抑制啤酒酵母細胞酸性海藻糖分解酶活性的方法，是利用流動式高壓脈沖電場裝置，選用長度與半徑均適宜的電極，控制高壓脈沖電場裝置中的電場強度和頻率在其適宜范圍內，將適宜濃度和適宜pH的啤酒酵母細胞懸浮液以定的恒流速度泵入高壓脈沖電場電極處流處理后收集于成品罐中。本技術制備方法包括啤酒酵母細胞懸浮液的制備、懸浮液酸度的調配、高壓脈沖電場參數的調控、懸浮液恒流泵料速度的調控工藝過程，優勢體現于在60μs的時間內啤酒酵母細胞酸性海藻糖分解酶活性抑制率達到95％以上，不僅為快速提取海藻糖生產工藝研究提供了技術支撐，也可為啤酒酵母泥變廢為寶綜合開發奠定一定基礎。
文檔編號C12N13/00GK102174506SQ20111002374
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月21日 優先權日2011年1月21日
發明者劉明源, 劉靜波, 宮新統, 張美碩, 楊藝, 林松毅, 殷涌光, 王睦, 赫桂丹, 金艷 申請人:吉林大學