一種測定抑制骨吸收藥物生物活性的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及測定骨吸收藥物活性的方法，具體涉及抑制破骨細胞分化和骨吸收活 性的藥物的活性測定方法。
【背景技術】
[0002] 骨質疏松癥是常見的骨吸收疾病，隨著世界人口老齡化日趨明顯，骨質疏松癥的 發病率逐年升高，由骨質疏松癥所致的骨痛和骨折直接影響了中老年人的生存質量，已成 嚴峻的社會問題。
[0003] 骨質疏松癥是由于骨代謝失衡導致骨吸收增加而引起的骨代謝性疾病，所以抑制 骨吸收是治療骨質疏松癥的有效途徑。在人體里，破骨細胞是唯一具有骨吸收功能的細胞， 破骨細胞的分化或其功能的改變所導致的骨改建失衡是骨質疏松的重要病理基礎。也就是 說，開發抑制破骨細胞分化和骨吸收能力的藥物是防治骨質疏松癥的主要藥理基礎。
[0004] 破骨細胞來源于骨髓造血干細胞，由單個核前體細胞融合而成，主要分布在主要 分布在骨質表面、骨內血管通道周圍。成熟破骨細胞是含有2-50個緊密堆積的核的巨大細 胞，具有較強的骨吸收能力，在體外培養的破骨細胞可以在骨片或象牙表面上形成骨吸收 陷窩。
[0005] 在體外成功誘導破骨細胞培養體系是開發抑制骨吸收藥物的關鍵。目前，，破骨細 胞的培養方法主要有原代培養方法和骨髓誘導培養方法。其中原代培養方法得到的破骨 細胞數量少，且得到的細胞大多為成熟破骨細胞，不適合用于破骨細胞增殖、分化方面的研 究。骨髓誘導培養方法，雖然得到充足的破骨細胞來源，但目前的培養方法得到的破骨細胞 具有其性質與體內原有破骨細胞有差異，具有噬骨能力差等缺點。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供簡單、有效測定抑制骨吸收藥物生物活性的方法。
[0007] 本發明的技術方案為如下：
[0008] -種測定抑制骨吸收藥物生物活性的方法，在體外誘導的破骨細胞培養體系中， 加入不同濃度的待測藥物，測定破骨細胞功能。
[0009] 本發明的技術方案中，所述體外誘導的破骨細胞培養體系是大鼠骨髓源性細胞誘 導的培養體系。
[0010] 本發明的技術方案中，所述破骨細胞功能包括抗酒石酸酸性磷酸酶染色活性和在 象牙片上骨吸收活性。
[0011] 本發明的技術方案中，所述體外誘導的破骨細胞培養體系，通過如下方法獲得；
[0012] (1)收集大鼠大腿骨和脛骨中的骨髓細胞，懸浮于細胞培養液中；
[0013] (2)細胞懸浮液通過葡聚糖凝膠S印hadex GlO色譜柱，用細胞培養液洗滌，收集細 胞；
[0014] (3)收集得到的細胞種于培養板內，培養板內添加含有細胞因子的培養基共同培 養，每隔2天換液，培養4-7天；
[0015] 其中，步驟（3)中所述培養基為含有KT8Mla, 25(0H)2D3、20-100ng/ml破骨細胞生 成因子、10-50ng/ml巨噬細胞集落刺激因子、15-20%胎牛血清的DMEM。
[0016] 在上述破骨細胞培養體系的獲得方法中，步驟（1)或（2)所述的細胞培養液優選 含有15-20%胎牛血清的DMEM。
[0017] 在上述破骨細胞培養體系的獲得方法中，步驟（3)中種于培養板中的細胞數優選 為 1 X 106-4X 106 個/cm2。
[0018] 在上述破骨細胞培養體系的獲得方法中，步驟（1)所述大鼠優選為4-6周齡。
[0019] 本發明的破骨細胞培養體系獲得的破骨細胞，顯示很強的抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP+)染色活性，在象牙片的骨吸收實驗中也顯示強的骨吸收能力。
[0020] 本發明的破骨細胞培養體系培養方法簡單，使用的相關細胞因子價格低，使用量 少，培養成分低。另一方面，本發明的培養體系穩定，得到的破骨細胞數量多，具有典型的破 骨細胞性質，有利于大量測定抑制骨吸收藥物的生物活性，繼而開發有效的骨吸收疾病治 療要藥物。
【具體實施方式】
[0021 ] 下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以 任何方式限制本發明。實施例中所述試驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和 材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得，或可以常規方法制備。
[0022] 實施例1破骨細胞的培養
[0023] 取4周齡的SD雄性大鼠，麻醉后托頸處死，放在75%乙醇中浸泡片刻，在無菌條件 下，取出大鼠大腿骨和脛骨，去凈骨表面的軟組織，用無菌PBS反復沖洗2-3次，最后置于含 有15%胎牛血清的DMEM培養液中，剪斷大腿骨和脛骨的兩端，并用注射器取吸取含15%胎 牛血清的DMEM培養液，反復沖洗骨髓細胞，直至骨頭發白。將沖洗的骨髓細胞收集于50ml 離心管中，在l〇〇〇rpm，4°C下離心10分鐘，去上清液。再加入DMEM培養液，將離心管內的 細胞均勻懸浮于培養液中，再離心，去上清液，反復洗2-3次。最后加入適量含有15%胎牛 血清的DMEM培養液吹打均勻，上葡聚糖凝膠S印hadex GlO色譜柱，用含有15%胎牛血清的 DMEM培養液，收集洗脫液中的細胞，1000rpm，4°C下離心10分鐘，去上清液。細胞中加入適 量培養培養液，并加入含有la，25 (OH)2D3 (VD3)、破骨細胞生成因子（RANKL)和巨噬細胞集 落刺激因子（M-CSF)的15%胎牛血清的DMEM，其中VD 3、RANKL和M-CSF的最終濃度分別為 10_8M、50ng/ml、20ng/ml。加入細胞因子的細胞種于96孔板中，每孔中的細胞數3X IO5個 細胞，在37°C，5%C02培養箱培養。每兩天換液一次，共培養4天。
[0024] 實施例2破骨細胞活性測定
[0025] 用兩種方法測定。
[0026] 1.抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP+)染色活性：實施例1中，培養4天的細胞，輕輕吸 取培養上清液后加入0. 5ml/孔0. 5%TRIT0N X-100,放置20分鐘，固定細胞。將清除固定 液，細胞用PBS輕輕清洗2-3次，用TRAP+染色試劑盒（sigma，N 〇387)染色，并在顯微鏡下 統計具有3個以上細胞核的TRAP陽性破骨細胞，結果表明96孔板的每孔上形成的破骨細 胞的平均數量為124個。
[0027] 2.對象牙片的骨吸收活性：
[0028] (1)將直徑約3. 7mm，厚度約2. 7μπι的象牙片，用75%乙醇浸泡5個小時，用無血 清的DMEM反復沖洗后，在紫外燈下放置12小時以上。將消毒處理后的象牙片平鋪于96孔 板中，備用。
[0029] (2)實施例1中，培養4天的細胞，輕輕吸取培養上清液后加入0.05%胰蛋白 酶-0. 02%EDTA0. 5ml，聯合消化培養板中的細胞5min，加入0. 5ml/孔含15%胎牛血清的 DMEM培養液終止胰蛋白酶的消化作用。將消化下來的細胞收集于離心管中，在lOOOrpm， 4°C下離心5分鐘，去上清液。然后迅速加入含15%胎牛血清的DMEM培養液，均勻懸浮細 胞，將細胞輕輕加入到步驟（1)中的鋪有象牙片的96孔板中，細胞數為2 X IO5個/孔。在 37°C，5%C02培養箱中培養，每3天換液。培養5天后，棄去培養上清液，2%TRIT0N X-100固 定IOmin,于0. 25mol/L氫氧化銨中超聲波清洗3次，每次5min，依次在50%乙醇，60%乙醇， 70%乙醇，80%乙醇，90%乙醇，95%乙醇，100乙醇和無水乙醇中梯度脫水后，1%甲苯胺藍染 液中染色1-2分鐘，蒸餾水清洗3次，在顯微鏡下觀察吸收陷窩，并計數。每孔中的平均吸 收陷窩數為153個。陷窩面積用Scion Image version Beta4.02software計算，每孔中的 平均吸收陷窩面積為298mm2。
[0030] 實施例3
[0031] 按實施例1的方法準備破骨細胞培養體系，將準備好的鋪好細胞的96孔板中，力口 入不同濃度的OPG-Fc融合蛋白，其最終濃度分別為300 μ g/Ι、100 μ g/1、1 μ g/1、300ng/l、 100ng/l、30ng/l、lng/1、0· 0lng/1，每個濃度設4個平行孔。以不加入OPG-Fc融合蛋白，力口 入相當體積的培養液的為對照組。對照組也設4個平行孔。
[0032] 加入不同濃度藥物和培養液的細胞，在在37°C，5%C02培養箱培養。每兩天換液一 次，共培養4天。
[0033] 按照實施例2所述的方法測定抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP+)染色活性。測定結果 如表1。
【主權項】
1. 一種測定抑制骨吸收藥物生物活性的方法，其特征在于，在體外誘導的破骨細胞培 養體系中，加入不同濃度的待測藥物，測定破骨細胞功能。
2. 根據權利要求1所述的測定抑制骨吸收藥物生物活性的方法，其特征在于，所述體 外誘導的破骨細胞培養體系是大鼠骨髓源性細胞誘導的培養體系。
3. 根據權利要求1所述的測定抑制骨吸收藥物生物活性的方法，其特征在于，所述破 骨細胞功能包括抗酒石酸酸性磷酸酶染色活性和在象牙片上骨吸收活性。
4. 根據權利要求1所述的測定抑制骨吸收藥物生物活性的方法，其特征在于，所述體 外誘導的破骨細胞培養體系，通過如下方法獲得； (1) 收集大鼠大腿骨和脛骨中的骨髓細胞，懸浮于細胞培養液中； (2) 細胞懸浮液通過葡聚糖凝膠Sephadex GlO色譜柱，用細胞培養液洗滌，收集細胞； (3 )收集得到的細胞種于培養板內，培養板內添加含有細胞因子的培養基共同培養，每 隔2天換液，培養4-7天； 其中，步驟（3)中所述培養基為含有10_8Mla，25(0H)2D3、20-100ng/ml破骨細胞生成因 子、10-50ng/ml巨噬細胞集落刺激因子、15-20%胎牛血清的DMEM。
【專利摘要】本發明提供了一種測定抑制骨吸收藥物生物活性的方法，其特征在于，在體外誘導的破骨細胞培養體系中，加入不同濃度的待測藥物，測定破骨細胞功能。本發明所述破骨細胞培養體系培養方法簡單，使用的相關細胞因子價格低，使用量少，培養成分低。本發明的培養體系穩定，得到的破骨細胞數量多，具有典型的破骨細胞性質，有利于大量測定抑制骨吸收藥物的生物活性，繼而開發有效的骨吸收疾病治療要藥物。
【IPC分類】C12Q1-02
【公開號】CN104561226
【申請號】CN201310498692
【發明人】秦宏佳
【申請人】大連市沙河口區中小微企業服務中心
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2013年10月21日