專利名稱：與雞腸炎沙門氏菌病抗性密切相關的多態位點及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一個與雞腸炎沙門氏菌病抗性密切相關的抗性基因位點以及基于該多態位點突變特性篩選雞腸炎沙門氏菌病抗性雞群的方法，屬于生物技術的基因領域。
背景技術：
進入21世紀以來，禽類肉蛋產品的需求在我國肉食產品需求總量中呈剛性增長態勢，與此同時，人們對禽產品質量的追求意識亦日益增強。禽沙門氏菌病的危害伴隨養雞業的全周期，對禽類生產造成無法估量的經濟損失；尤其是沙門氏菌感染雞群能通過食物鏈將病菌傳遞給人類，嚴重威脅人類食品安全(Foley & Lyrme，2008《allaway et al, 2008 ；Suzuki, 1994 ；Gantois et al，2009)，已經引起養禽界、公共衛生界和禽病防治界的高度重視。從長遠發展考慮，尋求一種全新的預防與控制策略，采用遺傳學方法，培育出抗病新品種(品系)，從遺傳素質上永久性地提高雞群對腸炎沙門氏菌的抵抗能力，培育高效、優質、抗性雞種是實現養禽業可持續發展的迫切需要。單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)，是由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列的多態性，包括轉換、顛換、插入或缺失。SNP是疾病易感性、顯現性、 抵抗力、以及藥物反應性等生物性狀差異的重要基礎，很多疾病與基因突變或基因多態有關。SNP作為第三代遺傳標記已得到飛速發展，目前已經多種發展成熟的檢測技術，如DNA 測序(Sanger測序法和焦磷酸測序法)、單鏈構象多態性(SSCP)、限制性酶切片段長度多態性(RFLP)、等位基因特異的寡聚核苷酸雜交(ASO)、寡聚核苷酸特異的連接、DNA芯片以及 Taqman探針等技術手段。Toll樣受體(Toil-like receptor,TLR)家族被認為是目前哺乳動物和脊椎動物唯一將細胞外抗原識別信息向細胞內傳遞并引發炎癥反應的關鍵跨膜蛋白(Gordon，2002 ； Nerren et al.，2009)，從源頭為疾病機制的研究提供了方向，成為目前研究禽類抗病力的熱門基因。ChTLR15是在2006年發現的一個雞所特有的新的TLR類型，相關研究報道沙門氏菌敏感雞的ChTLR15的表達水平低于不易感雞的表達水平，說明ChTLR15是決定雞是否是對沙門氏菌易感的一個重要因素，而它作為易感性評價的基礎就是其SNP特性。經過對現有國內外文獻和專利的檢索，至今未見有chTLR15基因多態性位點與腸炎沙門氏菌病抗性相關性的報道。
發明內容
本發明的目的在于揭示與雞腸炎沙門氏菌病抗性密切相關的TLR15基因多態位點，以及通過該抗性基因位點的遺傳特性篩查抗雞腸炎沙門氏菌病的抗性雞群的方法和基于該方法提供一種雞腸炎沙門氏菌病抗性相關基因TLR15基因SNP分型試劑盒。本發明的目的是通過以下技術方案實現的，一種檢測雞TLR15基因外顯子SNP分型的方法，其特征在于(a)通過特異性引物混合物TLR15P擴增TLR15基因TLR15E1序列；
(b)確定在雞TLR15基因外顯子的TLR15E1所示序列的第162位的核苷酸；(c)檢測在所述位置是否存在單核苷酸多態性。所述的特異性引物混合物TLR15P表示的信息如下TLR15 上游引物序列 5' -TTAGCAGCCACGCTGAGG-3 ‘，TLR15 下游引物序列 5' -GGGCTTCAACGTCTATGTTG-3 ‘。步驟(a)中所述的擴增方法為PCR反應體系為20μ 1 Iyl模板DNA(約 50ng)，2 μ 1 擴增緩沖液(10 X buffer)，0. 8 μ 1 2. 5mM dNTP, 0. 8ul 特異性引物混合物 TLR15P(5uM)，0. 1μ 1 5U/ul rTaq酶，加水補足20 μ 1 ；PCR的反應條件為94°C預變性 4min，后94°C變性30s，61°C復性30s，72°C延伸30s，35個循環，最后72°C延伸6min，4°C保存備用；擴增產物為257bp，2%瓊脂糖檢測擴增產物。步驟(c)中所述的檢測方法為取4ul擴增產物，加入Sul甲酰胺加樣緩沖液，98°C 變性lOmin，然后迅速冰浴IOmin后，10%非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr Bis = 39 1)， 1 X TBE電泳，室溫下，先用220V電泳20分鐘，便于單鏈DNA初步分離，后120V電泳12_14h， 銀染顯色。所述的單核苷酸多態性是在第162位存在T。本發明的第二個目的，一種分離核酸，其特征在于它具有TLR15E1所示序列，且第162位是T。本發明的最后一個目的，一種雞腸炎沙門氏菌病抗性相關基因TLR15基因SNP分型試劑盒，其特征是所述的試劑盒由盒體，盒體內的襯墊，襯墊的各孔腔內分別置入的特異性引物混合物TLR15P，DNA Tag酶，擴增緩沖液，dNTP, 10 %非變性聚丙烯酰胺凝膠和甲酰胺加樣緩沖液組成。本發明利用引物(TLR15P)對雞的總DNA進行PCR擴增，TLR15只有一個外顯子， 用TLR15P可以擴增外顯子的565-822片段(TLR15E1)，具體序列如下TLR15E1ccagca gccacgctga ggcctgactt gtgtggagca601 ccgatcaatg ggttgcttga cctatcaagg accaaactgt ctaatgaaga gctgacagca661 aaattggatg cagacctctg ccaagctcag ctgggcactg ttttggagtt taacattagt721 cacag [Tlgacc tggagatgga tcttctatct ctgttcatcc tgtttttgcc gatgaaagat781 atacagtccg ttgatgccag ctacaacaga ataacaatta ac用單鏈構象多態性(SSCP)結合測序的方法，檢測出一個多態位點C162T，位于 TLR15E1所示序列的第162位，即上面用方框標出的位點。取52只正常的和41只感染SE的白耳雞的血液樣本的基因型，用SPSS軟件分析發現與正常對照組相比，感染組的C162T多為CC或CT基因型，差別具有統計學意義(ρ < 0. 05，表1)。進一步性別分組分析表明，雄性組中其差別也具有統計學意義(P <0.01, 表2)。這些結果表明，TLR15基因C162T位點上攜帶T等位基因的個體抗腸炎沙門氏菌病的能力比較強。T等位基因是產生SE抗性的一個等位位點。表1正常組和感染組TLR15基因的多態性及基因型頻率的分布
權利要求
1.一種檢測雞TLR15基因外顯子SNP分型的方法，其特征在于(a)通過特異性引物混合物TLR15P擴增TLR15基因TLR15E1序列；(b)確定在雞TLR15基因外顯子的TLR15E1所示序列的第162位的核苷酸；(c)檢測在所述位置是否存在單核苷酸多態性。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的特異性引物混合物TLR15P表示的信息如下TLR15 上游引物序列 5' -TTAGCAGCCACGCTGAGG-3 ‘，TLR15 下游引物序列 5' -GGGCTTCAACGTCTATGTTG-3 ‘。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(a)中所述的擴增方法為PCR反應體系為20 μ 1 1μ 1模板DNA，2 μ 1擴增緩沖液，0·8μ 1 2. 5mMdNTP, 0. 8ul特異性引物混合物TLR15P，0. 1 μ 1 5U/ul rTaq酶，加水補足20 μ 1 ；PCR的反應條件為94°C預變性4min, 后94°C變性30s，61°C復性30s，72°C延伸30s, 35個循環，最后72°C延伸6min，4°C保存備用；擴增產物為257bp，2%瓊脂糖檢測PCR擴增產物。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(c)中所述的檢測方法為取4ul擴增產物，加入8ul甲酰胺加樣緩沖液，98°C變性lOmin，然后迅速冰浴IOmin后，10%非變性聚丙烯酰胺凝膠，IXTBE電泳，室溫下，先用220V電泳20分鐘，后120V電泳12_14h，銀染顯色。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的單核苷酸多態性是在TLR15P序列的第162位存在T。
6.一種分離核酸，其特征在于它具有TLR15E1所示序列，且第162是T。
7.一種雞腸炎沙門氏菌病抗性相關基因TLR15基因SNP分型試劑盒，其特征是所述的試劑盒由盒體(1)，盒體內的襯墊O)，襯墊的各孔腔內分別置入的特異性引物混合物 TLRl 5P (3), DNATag Bl (4)，擴增緩沖液(5)，dNTP (6)，10%非變性聚丙烯酰胺凝膠(7)和甲酰胺加樣緩沖液(8)組成。
全文摘要
本發明公開了一個與雞腸炎沙門氏菌病抗性密切相關的多態位點及其應用，屬于生物技術領域。該多態性位點為C162T，位于TLR15外顯子TLR15E1序列的第162位，這個位點上攜帶T等位基因的個體為腸炎沙門氏菌抗性群體，特別是攜帶T等位基因的雄性對腸炎沙門氏菌抗性更強。此位點對于研究雞TLR15抗腸炎沙門氏菌病的作用機制具有非常重要的意義。本發明可以簡便快速的檢測位于TLR15基因外顯子TLR15E1序列第162位上的單核苷酸多態性位點C162T的基因型，通過T等位基因的有無來評判個體對雞腸炎沙門氏菌病的抗性，從而有利于雞抗病育種的篩查。
文檔編號C12N15/11GK102168144SQ20111008678
公開日2011年8月31日 申請日期2011年4月7日 優先權日2011年4月7日
發明者單艷菊, 徐文娟, 朱春紅, 李慧芳, 束婧婷, 胡艷, 胡輝, 郭軍, 陳雯雯 申請人:江蘇省家禽科學研究所