重組IgE-Fc-抗EGFR單鏈抗體融合蛋白及其制備方法和用途的制作方法

專利名稱：重組IgE-Fc-抗EGFR單鏈抗體融合蛋白及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程和蛋白質工程技術領域，具體地說，涉及編碼包含IgE-Fc段和抗EGFR的單鏈抗體(ScFv)重組融合蛋白的編碼DNA、其所編碼的融合蛋白、該融合蛋白的生產方法、該融合蛋白的藥物用途以及該融合蛋白的治療方法。
背景技術：
人體免疫球蛋白分為IgG、IgA、IgM、IgD、IgE五類。作為機體體液免疫應答的主要效應分子，不同的免疫球蛋白行使著不同的功能。其中IgG是體液免疫反應的主要抗體，它在血清中的含量最高，達6 16mg/ml，占血清Ig總量的75% 80%，分子量150kDa。IgG 的Fc段可與中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞等表面的Fc受體結合，激活效應細胞對靶細胞的殺傷，發揮抗感染、中和毒素及免疫調理作用。IgE是正常人血清中含量最少的一種免疫球蛋白，其含量為0. 0001 0. 009mg/ml，約為IgG濃度的0. 05%，其分子量約為190kDa。 一直以來大家都認為IgE的功能主要是參與抗寄生蟲免疫以及與某些環境因子作用引起I 型超敏反應。寄生在人和動物體多種病原寄生物(如線蟲、血吸蟲等)就是被這種抗體抑制和清除的。當病原物或者過敏物與IgE結合后，其Fc段與肥大細胞、嗜堿粒細胞等效應細胞表面多個IgE-Fc受體分子(Fe ε Rs)發生交聯反應，導致肥大細胞、嗜堿粒細胞等效應細胞的活化和生物活性物質的釋放[1’2]。IgE-Fc主要有兩種受體=Fc ε RI和Fc ε RII (CD23)， 其中高親和力受體Fc ε RI主要分布在肥大細胞、嗜堿粒細胞和單核細胞表面，低親和力受體Fc ε RII主要分布在巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和NK細胞表面[3’4]。IgE與這些效應細胞表面的受體結合后刺激效應細胞釋放細胞因子和趨化因子，引起強烈的免疫反應，這些細胞因子包括白介素、組織胺、趨化因子、腫瘤壞死因子等。IgE與效應細胞上受體結合的區域位于其Fc段(IgE-Fc)，也就是其重鏈的C ε 2、C ε 3、C ε 4區域。如果受體分子在巨噬細胞上，則介導細胞吞噬作用來殺死對應的細胞或者病原物，即抗體依賴的細胞介導的細胞吞噬作用(antibody-d印endent cellular phagocytosis，ADCP)[6]。近年來的一些研究表明 IgE在腫瘤發生過程中發揮重要的免疫監控和免疫增強作用。本發明利用IgE所介導的免疫增強反應其實就是利用IgE-Fc來偶聯效應細胞，對腫瘤細胞進行局部的殺傷[7』。近20年來，單克隆抗體作為藥物治療疾病尤其是治療腫瘤取得了突破性進展，已經有27個抗體被FDA批準進入臨床，如抗CD20單抗美羅華(Rituximab)[8]和抗VEGF單抗貝伐單抗(Bevac izumab，Avast in) M。同時，有近500個抗體目前處于臨床前和臨床研究階段。經典的抗腫瘤抗體不管是鼠源化的還是嵌合的或是人源化的甚至是全人的抗體基本都是以IgG型(主要是IgGl)為基礎的。其抗腫瘤機理為(1)介導補體的溶細胞效應，即補體依賴的細胞毒效應(complement dependent cytotoxicity, CDC)，IgG (IgGl 和 IgG3)類抗體與腫瘤表面抗原結合后，激活補體經典途徑，最終形成膜攻擊復合物(membrane attack complex，MAC)，溶解腫瘤細胞。(2)抗體依賴的細胞介導的細胞毒效應，即NK細胞、單核細胞和嗜中性粒細胞通過其表面FcyR與抗腫瘤抗體(IgG)結合，借助細胞介導的細胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)效應而殺傷月中瘤。(3)抗體的免疫調理作用，即抗腫瘤抗體與吞噬細胞表面FcyR結合，增強吞噬細胞的吞噬功能。此外，抗腫瘤抗體與腫瘤抗原結合能活化補體，借助所產生的Ob與吞噬細胞表面CRl結合， 促進其吞噬作用。(4)抗體封閉腫瘤細胞表面某些受體抗體可通過封閉腫瘤細胞表面某些受體影響腫瘤細胞的生物學行為。(5)干擾腫瘤細胞粘附作用，某些抗體可阻斷腫瘤細胞表面粘附分子與血管內皮細胞或其他細胞表面的粘附分子配體結合，從而阻止腫瘤細胞生長、粘附和轉移。機體抗腫瘤效應十分復雜，特異性和非特異性抗腫瘤機制相互交錯，體液免疫與細胞免疫機制相互協調和補充，共同執行免疫監視功能[1°’11]。總的來說，IgG大部分是通過ADCC和CDC途徑介導腫瘤細胞凋亡；而本研究的IgE抗腫瘤活性的機制與此有所不同，我們更多的是利用細胞因子療法，即通過IgE介導效應細胞釋放的細胞因子在腫瘤細胞表面進行局部殺傷作用。所以，它們的抗腫瘤機制側重不同，而IgE抗體與傳統的IgG相比不僅具有IgG的主要免疫功能，更具有一些IgG不可替代的優勢，這將在文章的討論部分逐一探討[12]。本研究以此理論為基礎，選擇了 IgE作為抗體改建的原型來構建更新型、更高效的免疫應答融合蛋白分子。所以，作為一種前瞻性的治療策略，IgE的抗腫瘤功能和活性的驗證是非常值得探索的。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)是原癌基因 c-erbBl的表達產物。EGFR廣泛分布于哺乳動物上皮細胞、成纖維細胞、膠質細胞、角質細胞等細胞表面，EGFR信號通路對細胞的生長、增殖和分化等生理過程發揮重要的作用。其自分泌途徑是腫瘤發生發展的重要因素，在腫瘤細胞增殖、遷移、腫瘤血管新生及轉移等過程中發揮重要作用[13]。通常情況下，EGFR酪氨酸激酶以單體形式存在，在結構上由胞外區、跨膜區、胞內區3個部分組成，其中胞外區具有兩個半胱氨酸豐富區，胞內區具有典型的ATP 結合位點和酪氨酸激酶區。當特異性的配體和EGFR受體結合后，引起受體由失活的單體狀態轉變為激活的二聚化狀態，進而激活胞內內在的酪氨酸激酶，其胞內段的酪氨酸殘基被自磷酸化或交叉磷酸化，引起下游包括PII-Akt、MAPK-ERK等信號通路的激活，調控腫瘤細胞的增殖、轉移、存活以及新生血管生成[14]。目前在多種實體瘤如乳腺癌、肺癌、結腸癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、頭頸癌、卵巢癌、腦腫瘤中均發現EGFR的過表達。近年來，靶向 EGFR家族的抗腫瘤藥物研發已經成為一個熱點領域，其中針對EGFR的單抗西妥昔(C225， Erbitux)和小分子酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼(Gefitinib，Ireasa)已經成功地應用于臨
ι± [15,16]
沐 ο單鏈抗體(single chain variable fragment, scFv)是將抗體的重鏈可變區VH 和輕鏈可變區VL通過連接肽(Linker)重組而成的一種小分子基因工程抗體，它保有了原有抗體良好的抗原結合能力，且具有分子量小，穿透力強，體內循環半衰期短以及免疫原性低等特性。在此基礎上，可與其它效應分子構建成多種具有新功能的抗體分子，是構建免疫毒素和雙特異性抗體的基礎元件。近年來單鏈抗體的研發越來越受到重視，并且也有一些這樣的抗體進入到臨床試驗[17]。本發明目前需要進行新型的高效、低副作用的抗腫瘤治療藥物的研制，以滿足人們的需求。

發明內容
本發明要解決的技術問題是為抗腫瘤藥物治療提供一種新的有效選擇。本發明解決該技術問題的主要方案是提供了一種新的融合蛋白質。本發明融合蛋白質是由抗人表皮生長因子受體的單鏈抗體EGFR scFv與來自人免疫球蛋白IgE的Fc段IgE-Fc構成，EGFR scFv和IgE-Fc之間由連接肽相連。該融合蛋白質可稱為重組IgE-Fc-抗EGFR單鏈抗體融合蛋白。單鏈抗體可以輕鏈在前，也可重鏈在前。EGFR scFv和IgE-Fc之間可EGFR scFv在前，也可IgE-Fc。優選的是EGFR scFv在前(N端)。其中，上述的融合蛋白質中所述的人免疫球蛋白IgE的Fc段的氨基酸序列為(1)如序列表中SEQ ID NO. 4所述；或者O):在SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列中經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸所得功能相同或相似的多肽。其中，上述的融合蛋白質中所述的人抗人表皮生長因子受體的單鏈抗體的氨基酸序列為(1)如序列表中SEQ ID NO. 2所述。或者O)在SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列中經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸所得功能相同或相似的多肽。其中，上述融合蛋白質中所述的連接肽為人免疫球蛋白鉸鏈區。其中，上述融合蛋白質中所述的人免疫球蛋白鉸鏈區的氨基酸序列為EPKSCDKTHTCPPCPo如無特別說明，本發明中列舉的氨基酸序列從左到右均是從氮端到碳端。其中，上述融合蛋白質中所述的抗人表皮生長因子受體的單鏈抗體EGFR scFv的內部有連接輕鏈和重鏈的連接肽，其連接肽的氨基酸序列為GGGGSGGGGSGGGGS。其中，上述融合蛋白質的氨基酸序列為(1)如序列表中SEQ ID NO. 12所示；或者( 在SEQ ID No. 12所示的氨基酸序列中經過取代和/或缺失和/ 或添加一個或幾個氨基酸所得功能相同或相似的蛋白質。該融合蛋白質可表示為 IgE-Fc-EGFRscFv。進一步的，上述的融合蛋白質，其特征在于，還在N端連接有信號肽。其中，上述融合蛋白質的氨基酸序列為(1)如序列表中SEQ ID NO. 8所示；或者O)在SEQ ID No. 8所示的蛋白的氨基酸序列中經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸所得的與SEQ ID No. ？所示的融合蛋白質的功能相同或相似的蛋白質。本發明還提供了編碼上述融合蛋白質的重組DNA。其中，上述的重組DNA的核苷酸序列為(1)如序列表中的 SEQ ID N0. 7 或 SEQ ID NO. 11所或者為 SEQ ID N0. 7 或 SEQ ID NO. 11的簡并序列；或者O)在(1)限定的核苷酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且與(1)限定的核苷酸序列編碼功能相同或相似的蛋白質。本發明還提供了包含上述重組DNA的重組載體。
其中，上述重組載體為質粒載體或病毒載體。同時，本發明還提供了包含上述重組載體的重組體。進一步的，所述重組體是宿主細胞。所述宿主細胞最好是真核宿主細胞。宿主細胞可以用于分泌表達該融合蛋白。另外，本發明還提供了上述融合蛋白質、上述的重組載體、或者上述的重組體在制備抗腫瘤藥物中的應用。本發明還進而提供了一種藥物組合物。該藥物組合物包括上述的融合蛋白質、重組載體、或者上述的重組體作為活性成分并添加藥學上的輔料。進一步的，上述的藥物組合物，還包括任何一種或幾種其他的抗腫瘤藥物。本發明的要點在于設計并構建了一種人免疫球蛋白IgE的Fc段與抗人表皮生長因子受體(EGFR)的單鏈抗體(scFv)的融合蛋白，其目的是利用EGFRscFv的靶向治療功能同時偶聯IgE-Fc這樣的免疫增強分子。既能夠靶向腫瘤細胞表面抗原發揮EGFRscFv的抗腫瘤機制，同時激發IgE-Fc介導的免疫應答反應，功能互補。對于EGFRscFv來說，作為 EGFR的抗體，它本來就扮演著阻斷EGF和EGFR結合的功能，從而抑制由此引發的一系列信號通路所導致的血管生長和腫瘤細胞增殖。而對于IgE-Fc利用它所介導ADCC、ADCP及多種抗腫瘤細胞因子來抑制或者殺死腫瘤細胞，二者相互配合，以得到更好的腫瘤治療效果。 由于加了人免疫球蛋白的Fc片段，以基因工程方式制備的融合蛋白會通過Fc片段的間形成二硫鍵以二聚體形式存在。本發明描述的包含人免疫球蛋白IgE的Fc段與抗人表皮生長因子受體(EGFR) 的單鏈抗體(scFv)融合蛋白是通過常規的基因重組技術所構建，具體實驗步驟如《分子克隆》第三版(Jo^ph Sambrook，科學出版社)及類似的實驗手冊所記載。其中，IgE Fe、 EGFRscFv和連接肽分別是1.人免疫球蛋白IgE的Fc段，表示為IgE-Fc，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1 所述。2.抗人表皮生長因子受體(EGFR)的單鏈抗體(scFv)，表示為EGFRscFv，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2所述。3. IgE-Fc和EGFRscFv之間的所用的連接肽，表示為EPKSCDKTHTCPPCP，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 6所述。上述的優化融合蛋白及其編碼的DNA可以通過常規的基因重組技術獲得。比如所需編碼人免疫球蛋白IgE的Fc段的DNA序列可從臨床哮喘患者外周血淋巴細胞克隆所得， 抗人表皮生長因子受體(EGFR)的單鏈抗體(scFv)可從噬菌體抗體庫篩選所得，然后將編碼上述優化融合蛋白的DNA序列用PCR或直接合成獲得后分別克隆到載體中，所用載體可以是分子生物學常用的質粒、病毒或DNA片段。在編碼上述優化融合蛋白的DNA序列前端加上蛋白分泌信號肽序列，以保證重組蛋白從細胞中分泌出來。載體序列中包括用于驅動基因表達的啟動子、蛋白質翻譯起始和終止信號、以及多聚腺苷酸(PolyA)序列。載體中含有抗生素抗性基因，以利于載體在宿主細胞如細菌和真核細胞中的復制和表達。另外，載體中還包括真核細胞選擇性基因，用于穩定轉染宿主細胞株的選擇。在完成含編碼上述優化融合蛋白的DNA序列的質粒構建以后，即可用該重組載體轉染或轉化宿主細胞，表達相應的融合蛋白質。能夠用于表達這些融合蛋白的表達系統有多種，可以是真核細胞，也可以是原核細胞，它們包括(但不限于)哺乳動物細胞、細菌、酵母、昆蟲細胞等。由于本發明優化融合蛋白的氨基酸序列中包含可糖基化的氨基酸，因此哺乳動物細胞是表達該蛋白的優選系統。可用于大規模表達蛋白質的哺乳動物細胞有多種， 例如CHO細胞、293細胞、NSO細胞、COS細胞、BHK細胞等，其它許多細胞也可以用于蛋白的表達，因此都包括在本發明所能使用的細胞之列。含有編碼上述優化融合蛋白基因的重組質粒可經轉染進入宿主細胞，轉染細胞的方法有多種，其中包括(但不限于)電穿孔法、脂質體轉染法和磷酸鈣轉染法等。一種較佳的蛋白表達方法是在已經穩定轉染的宿主細胞中對重組載體進行基因擴增，以提高相應重組融合蛋白的表達量。例如，用含有新霉素(Neomycin)抗性基因的重組載體穩定轉染無新霉素抗性的宿主細胞后，可在細胞培養液中增加新霉素的濃度以擴增重組載體在宿主細胞中的拷貝數量；又例如用含有二氫葉酸還原酶(DHFR)基因的重組載體穩定轉染缺乏DHFR的宿主細胞后，可在細胞培養液中增加氨甲喋呤(MTX)的濃度以擴增重組載體在宿主細胞中的拷貝數量。哺乳動物細胞以外的其他表達系統，例如細菌、酵母、昆蟲細胞等也可以用于表達本發明的優化融合蛋白，它們也被包含本發明所能使用的宿主細胞之列。這些表達系統的蛋白質產量比哺乳動物細胞的較高，但是所表達的蛋白質缺乏糖基化或形成的糖鏈結構與哺乳動物細胞有所不同。優化融合蛋白表達后，可用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)或其他方法測定細胞培養液中的融合蛋白濃度。由于這些優化融合蛋白含有免疫球蛋白Fe，因此可以用蛋白A親和層析法來純化所表達的優化融合蛋白。此外，與其它蛋白純化方法如離子交換層析等聯合使用，可進一步純化本發明的優化融合蛋白。從重組體培養液中獲得相應的優化融合蛋白后，可以用細胞ELISA和流式細胞術來檢測其對EGFR的結合活性，實驗結果表明，本發明的優化融合蛋白能夠結合EGFR陽性的細胞如A431細胞，因此本發明所構建的優化融合蛋白可以阻斷IgE-Fc-EGFRscFv的結合， 是一種靶向EGFR，通過趨化和激活免疫效應細胞來殺傷腫瘤細胞，從而發揮抗腫瘤作用。應用純化方法獲得高純度的優化融合蛋白后，可利用體外細胞模型和體內動物模型來檢測其對腫瘤細胞的抑制效應。在體外實驗中，EGFR表達陽性的腫瘤細胞如A549肺癌細胞、MDA-MB-435乳腺癌、Raji淋巴瘤細胞等都可以用MTT等方法來檢測優化融合蛋白對這些細胞的生長抑制作用。在體內實驗中，上述EGFR陽性的腫瘤細胞可以用來構建小鼠腫瘤模型，腫瘤模型可通過腹背側皮下、腹腔、尾靜脈等方法構建，以用于觀察融合蛋白的抗腫瘤或抗轉移實驗。本發明還提供了以病毒載體來運載和表達這些優化蛋白的方法。這些病毒載體包括但不限于腺病毒載體(adenoviral vectors)、腺相關病毒載體(adeno-associated viral vectors)、反轉錄病毒載體(retroviral vectors)、單純皰疫病毒載體(herpes simplex virus-based vectors)、t曼病毒載體(lentiviral vectors)。本發明還提供了含有本發明融合蛋白和藥用載體的藥物組合物。該藥物組合物可以按照藥劑學常規技術制備成各種形式的藥物制劑，較優選的是注射劑，最優選的是冷凍干燥注射劑。本發明的藥物組合物，其中還包括任何一種或幾種其它的具有協同作用的抗腫瘤藥物，所述組合物可以和其它治療方法一起治療腫瘤，所述其它治療方法包括化學療法、放射療法、生物療法。本發明以EGFR為靶點，構建了 EGFRscFv，進而聯合IgE-Fc構建了 IgE-Fc-EGFRscFv這樣的融合蛋白類的雙特異性抗體，其目的是利用EGFRscFv的靶向治療功能同時偶聯IgE-Fc這樣的免疫增強分子。既能夠靶向腫瘤細胞表面抗原發揮EGFRscFv 的抗腫瘤機制，同時激發IgE-Fc介導的免疫應答反應，功能互補。對于EGFRscFv來說，作為EGFR的抗體，它本來就扮演著阻斷EGF和EGFR結合的功能，從而抑制由此引發的一系列信號通路所導致的血管生長和腫瘤細胞增殖。而對于IgE-Fc利用它所介導ADCC、ADCP及多種抗腫瘤細胞因子來抑制或者殺死腫瘤細胞。希望二者能夠相互配合，以得到更好的腫瘤治療效果。在本發明不僅利用了抗體作為傳統的抗腫瘤藥物的靶向作用，同時利用了抗體和抗體偶聯后的協同作用。本發明構建的雙特異性融合蛋白抗體既利用了 EGFR單抗阻斷了 EGFR和EGF之間的偶聯，進而抑制一系列由此引發的信號通路所導致的血管生成，腫瘤增殖。同時，也利用了 IgE的特殊的抗腫瘤活性，將效應細胞集聚到腫瘤細胞組織周圍，有效的利用了效應細胞發揮的ADCC和ADCP這樣的功能，抑制腫瘤的生長，二者各種行使其功能互不干擾。而實驗證明了當把這2個抗體通過Linker連接在一起形成融合蛋白抗體后，它們的各自的功能并沒有因此受到影響。本發明雙特異性融合蛋白抗體在體內外都具有良好的生物活性和穩定性，能夠阻斷靶向EGFR陽性腫瘤細胞，激活免疫細胞，特異殺傷腫瘤細胞，從而抑制腫瘤的生長。IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白的IgE-Fc序列為全人源序列，免疫原性低，而且整個融合蛋白的分子量低于其他抗體類藥物，具有很好的應用前景。


圖IRT-PCR擴增出的IgE-Fc瓊脂糖凝膠電泳M為Marker，第1、2、3、4道均為PCR產物樣品，都在IOOObp處都出現了預期條帶，
結果與預期一致。圖2IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白的設計示意3EGFRscFv雙酶切鑒定Xbal和BamHI雙酶切后，電泳顯示第一道只有一條帶，沒有預期條帶出現，第2、3、 4、5道出現2條帶，其中大小約900bp的條帶為預期條帶，結果與預期一致。圖4IgE-Fc-EGFRScFV融合蛋白載體的雙酶切鑒定其中1道為融合蛋白質粒；2道切下大小約IOOObp的條帶，雙酶切位點為)(bal和 BamHI ；3道切下大小約900bp的條帶，雙酶切位點為BamHI和NheI.圖5融合蛋白瞬時轉染效率及表達后Wfestern blot驗證分析A 通過相同體系轉入pcDNA3. 1 (+)-GFP載體后觀察其轉染效率圖。B 第一道為轉染后的CHO細胞樣品，第二道為轉染CHO細胞后的上清樣品，第三道為未轉染的CHO細胞樣品，第四道為未轉染CHO的上清樣品。圖6融合蛋白載體轉染CHO細胞后其穩定株的篩選及驗證分析6個克隆在不同時間點時收集的上清作ELISA的檢測結果。圖7流式細胞術檢測細胞表面受體EGFR和Fc ε RICHO細胞、293細胞和U937單核細胞EGFR的表達結果為陰性，而Α431的檢測結果為陽性；CHO細胞，293細胞和A431細胞檢測受體Fc ε RI時結果為陰性，而U937單核細胞的檢測結果為陽性。圖8利用流式細胞儀檢測融合蛋白的IgE-Fc和EGFR scFv的活性檢測結果中中A、C、D圖均為陰性結果，B圖為陽性結果，IgE-Fc和EGFR scFv表現出各自的功能。圖9IgE-Fc-EGFRScFV融合蛋白抗腫瘤功能分析圖中統計了每組A431細胞死亡指數，作統計分析，其結果具有統計學意義。
具體實施例方式以下實例對本發明所涉及的優化融合蛋白的構建、實驗和應用作了詳細說明。但是本發明的內容和用途并不僅限于實例的范疇。實施例1 I gE-Fc基因的克隆采集哮喘病人的新鮮血液15ml，在無菌環境中分離出外周血淋巴細胞，用Trizol 法提取總的RNA。設計包括了起始密碼子和終止密碼子的引物做一步法RT-PCR。上游引物5，-CGGGATCCCCCACCGTGAAGATCTTACAGTCGT-3，(SEQID NO. 13)；下游引物5，-GCTCTAGATCATTTACCGGGATTTACAGACACCG-3，(SEQIDN0. 14)。得到的RT-PCR產物通過DNA電泳鑒定其大小約lOOObp，與預期中的970bp符合 (見圖1)。再將RT-PCR產物裝載入T-Easy載體后測序，與NCBI Genebank數據庫中報道的序列進行比對，序列一致。實施例2 :EGFRscFv的克隆從噬菌體抗體庫中篩選出的親和力較高的重鏈VH和輕鏈VL，以Linker連接構建抗EGFR單鏈抗體(scFv)，并在EGFRscFv的N端添加分泌信號肽IgK序列，并按哺乳動物密碼子對基因序列進行重新設計和優化，設計并合成寡核苷酸片段，通過重疊PCR法拼接成全長EGFRscFv，載入PUC57載體中。獲得合成EGFRscFv序列后，將PUC57_EGFRSCFv轉化大腸桿菌進行質粒擴增，將目標序列按照設計的酶切位點OCbaI和BamHI)做雙酶切反應從PUC57載體中酶切下來，DNA 電泳可見第2、3、4、5泳道都切出了兩條帶，其中小條帶約為900bp，與預期結果相符，第1 泳道未酶切出預期條帶。將小片段回收后利用連接反應將該片段克隆進pcDNA3. 1(+)載體中，測序驗證，與設計結果一致。 實施例3 JgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白的設計和載體構建本發明中的融合蛋白的設計模式圖如圖2。NheKBamHiabaI為設計的克隆酶切位點。為了保證該融合蛋白能夠分泌到細胞外，我們選擇了 Ig kappa leader sequence ( BP IgK)作為分泌信號序列，因其穩定性和高效性等優勢常被選作蛋白質真核表達載體的分泌序列，該序列共21個氨基酸Qlaa，METDTLLLWVLLLWVPGSTCD)，對應的DNA序列為5 ’ -ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGA C-3，。連接EGFRscFv 重鏈(Heavy chain, VH, 354bp)和輕鏈(Light chain, VL,327bp) 的Linker采用(GGGGS) 3，其對應的編碼核苷酸序列為(SEQ ID NO. 9) :GGTGGAGGCGGTTCAG GCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG。以往的研究表明該Linker具有較強的張力和柔性，穩定性很強，常被選作scFv的鏈接部件。選擇了IgGl 的鉸鏈區即 Hinge 區，Ifea :EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO. 5)，編碼核苷酸序列為45個堿基GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA(SEQ ID NO. 6)來作為連接 EGFRscFv和IgE-Fc的中間連接區(連接肽)，以保證二者都能夠折疊形成各自正確的構象。其中IgE-Fc長度為970bp，EGFRscFv長度為824bp，最終該IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白總長度為1794bp，編碼597個氨基酸(SEQ ID NO. 10)的融合蛋白。本發明的目的是要構建IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白的真核表達載體，在已經分別有針對性的獲得了 IgE-Fc片段和EGFRscFv片段的前提下，采用分步連接方法將其克隆進真核表達載體pcDNA3. 1 (+)中。載體構建后分別做雙酶切驗證，分別在第二泳道和第三泳道出現了大小約為IOOObp和850bp的預期條帶；預計分別為雙酶切下的IgE-Fc片段和 EGFRscFv片段條帶。取10 μ 1質粒測序，測序報告與設計序列一致。實施例4 基因瞬時轉染和融合蛋白表達的驗證將已經構建好的IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白載體通過Lipo2000轉染CHO細胞。為了檢測蛋白的表達情況，首先將融合蛋白載體做瞬時轉染，并且設4個組，它們分別為 JgE-Fc-EGFRscFv 融合蛋白組(2 μ g Plasmid+6 μ g LIP)、pcDNA3. 1 (+) (2 μ g Plasmid+6 μ gLIP)、GFP_pcDNA3. 1 (+) (2 μ g Plasmid+6 μ g LIP)、未轉染組，48 小時后分別收取已經轉染了融合蛋白載體的CHO細胞樣品、轉染后的細胞上清、未轉染的細胞樣品和未轉染的細胞上清，做Western bolt驗證該融合蛋白是否表達并且分泌在上清中，結果在第一道和第二道都觀察到目的蛋白的表達，分子量約為62kDa (還原條件下，為單鏈蛋白)，第三道和第四道未檢測到目的蛋白。同時，為了觀察該體系的轉染效率是否能夠滿足要求，我們于轉染48小時后用熒光顯微鏡觀察轉入pcDNA3. 1 (+)_GFP的CHO細胞(見圖 5)。獲得高純度編碼IgE-Fc-EGFRscFv的重組質粒后，利用Lipofectamine 2000質粒轉染試劑盒anvitrogen公司)將重組質粒轉染CHO細胞(ATCC)，在無血清培養基中培養三天后收集CHO細胞上清液，可以用免疫印跡檢測IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白的表達(見圖5)。此方法可用于快速地獲取少量的IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白，其濃度可以用ELISA 法定量檢測，所用一抗可以為抗人IgE-Fc抗體。實施例5 JgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白在CHO細胞中穩定表達在驗證該融合蛋白能夠在CHO細胞中表達的前提下，對轉染后的CHO細胞用G418 進行穩定株的篩選，挑選單克隆細胞，通過M孔板、6孔板、T25-Flask和T75_Flask中分級擴大培養，并保種。用ELISA方法檢測和篩選更換培養基后0、12、24、36、48、60小時后上清中融合蛋白的表達量，以此來篩選出其中最高效表達株。結果顯示4號克隆在培養基更換后48小時的時候表達量最(大見圖6)。本發明中融合蛋白是在CHO細胞中表達并分泌到培養液中的，并利用葡萄球菌蛋白A親和層析的方法純化所得。包含IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白的細胞培養液可采用葡萄球菌蛋白A親和層析的方法進行純化。將蛋白A-kpharose層析柱以PBS緩沖液平衡后，將超濾器濃縮過的CHO細胞培養液上清液進樣，以A280進行監測，用PBS緩沖液沖洗至未結合的蛋白全部被洗脫，然后用IOOmM的檸檬酸洗脫結合蛋白，立刻以IM的Tris-HCl進行中和。由于加了 Fc片段，融合蛋白會通過二硫鍵以二聚體形式存在。純化后的融合蛋白可以用ELISA法檢測濃度。包含融合蛋白的洗脫液經脫鹽純化后可以凍干，凍干后可置于-20°C 長期保存。實施例6 JgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白的活性檢測為了驗證融合蛋白是否保持了 IgE-Fc和EGFRscFv各自的免疫學活性，我們首先通過流式細胞術分別檢測細胞株A431是否高表達EGFR和U937單核細胞是否高表達 Fc ε RI，選擇了 CHO細胞和四3細胞作為對照。結果顯示CH0細胞和四3細胞均不表達EGFR 和Fc ε RI，檢測結果均為陰性，而Α431細胞EGFR表達率約為95.7% (見圖7)，而U937單核細胞Fc ε RI的表達率約為77. 1%，檢測結果均為陽性(見圖7)。接下來，進一步檢測和驗證IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白的免疫學活性。的檢測策略如下將實施例5制備的I gE-Fc-EGFRscFv作為一抗與A431孵育，然后通過 FITC-anti-IgE顯色。結果顯示，通過FITC-anti-IgE的抗體能夠檢測到該融合蛋白的EGFR scFv能夠與A431細胞結合，其結合率約為68. 3%，其流式細胞結果直接說明IgE-Fc和 EGFR scFv是表達在同一個分子上的，且各自具有活性，這二個部分既能夠獨自形成正確的折疊又互不干涉功能(見圖8)。實施例7 融合蛋白抗腫瘤活性研究采用腫瘤細胞與單核細胞混合培養法來初步檢測該融合蛋白的抗腫瘤活性。于加入實施例5制備的融合蛋白后72小時后，PBS洗去單核細胞，進行碘化丙啶(PI)染色，于熒光顯微鏡下觀察細胞核被染色的情況以確定被殺傷的細胞數量，結果顯示我們構建的融合蛋白能夠起到較為明顯的免疫殺傷作用，該體系能夠按照預計的設計完成腫瘤細胞的殺傷。并且在熒光顯微鏡下拍照，調整焦距至每個視野中約有20個總細胞，連續拍照50張。 計數出每組實驗中約1000個A431細胞的絕對死亡數，做統計分析，結果顯示融合蛋白治療組與對照組具有明顯差異(見圖9)。由于抗體具有特異性的選擇作用，可把效應物質濃集在腫瘤病灶處或腫瘤細胞表面，而殺傷靶細胞。10多年來，國內外已有多種腫瘤相關抗原的抗體用于腫瘤的靶向治療，這些抗體基本都是以IgG為基礎改造的，或是嵌合的如Rituximab，或是人源的如 "Trastuzumab，甚至有全人的抗體進入了臨床試驗如HuMax-⑶4[18]。有關利用IgE來具有對腫瘤細胞的殺傷作用的研究在1991年的時候就有所報道[19]，Sehon和他的搭檔一起用IgE 來對抗乳腺癌細胞在小鼠身上增殖，顯示出IgE的抗腫瘤活性，但是他的這項研究沒有把 IgE和其他的抗體偶聯在一起，共同發揮抗腫瘤功能。IgE能夠在極低濃度的條件下與其效應細胞上的Fc段受體(Fe ε Rs)結合，刺激機體產生強烈的免疫反應，速度迅速，提高了治療效率和成本。所以它只需要很低的劑量， 這是和IgG很大的區別，而實際上當抗體被作為藥物使用時如果需要很大的劑量的話通常就會被認為這是該抗體的局限，因為其有可能產生過于嚴重的HAMA反應。第二，IgE不僅能夠激活大部分的IgG的經典途徑來殺死腫瘤細胞，而且它還能夠激發像抗原遞呈細胞 (antigen-presenting cells,APC)等更加廣泛種類的效應細胞釋放大量的細胞因子，介導 ADCC和ADCP作用于腫瘤細胞。本發明將已經構建好的I gE-Fc-EGFRscFv融合蛋白載體作結構和功能上的改進，利用IgG不僅能夠激活效應細胞的介導ADCC功能，同時又能夠激活補體途徑，通過Complement-dependent cytotoxicity(CDC)途徑誘導凋亡殺死腫瘤細胞。正如前面思考的如果我們能夠在一個抗體分子上同時偶聯IgG和IgE的抗腫瘤活性是最理想的，應該比單用任何一種抗體的抗腫瘤效果都要好。IgG的Fc段包括二個部分C γ 2和C γ 3，它可以通過激活巨噬細胞、NK細胞、樹突狀細胞，介導ADCC反應的同時激活補體效應，而IgE-Fc 包括C ε 2、C ε 3、C ε 4這3個部分，它可以激活肥大細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、NK細胞。其中C ε 4和C γ 3的主要功能都是于低親和力受體結合，介導 ADCC反應，因此為將該融合蛋白的結構更為高效化，改造融合蛋白結構的時候也可以只需要保留IgE-Fc的C ε 2和C ε 3。所以根據該研究的實際進展，我們設計了以下這些方案來進一步強化該融合蛋白的功能，并且已經完成了部分的內容，以期待得到更好治療效果。在本發明中，我們不僅利用了抗體作為傳統的抗腫瘤藥物的靶向作用，同時利用了抗體和抗體偶聯后的協同作用。這樣構建的IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白是一個雙特異性抗體(BsAb)，也叫雙功能抗體(BfAb)。BsAb可以通過二個抗原結合位點分別集合效應細胞 (Τ細胞，NK細胞，巨噬細胞)和靶細胞(腫瘤細胞)，使二者彼此靠近并得到募集，從而使二中細胞發生相互作用而誘導靶細胞溶解。BsAb的這種特性可使效應細胞獲得抗體依賴的溶解能力。本發明構建的雙特異性融合蛋白抗體既利用了 EGFR單抗阻斷了 EGFR和EGF之間的偶聯，進而抑制一系列由此引發的信號通路所導致的血管生成，腫瘤增殖。同時，我們也利用了 IgE的特殊的抗腫瘤活性，將效應細胞集聚到腫瘤細胞組織周圍，有效的利用了效應細胞發揮的ADCC和ADCP這樣的功能，抑制腫瘤的生長，二者各種行使其功能互不干擾。 而我們的也驗證了當把這2個抗體通過Linker連接在一起形成融合蛋白抗體后，它們的各自的功能并沒有因此受到影響。過去30年抗體藥物的發展趨勢是從鼠源型抗體到嵌合型抗體再到人源型抗體甚至全人抗體，大家都在積極尋找免疫原性更加低的藥物，避免HAMA 反應的產生，IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白的IgE-Fc序列為全人序列，免疫原性低，而且整個融合蛋白的分子量低于其他抗體類藥物。參考文獻1.Sly RM(1999)Changing prevalence of allergic rhinitis and asthma. 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inhibition of murine for the mammary tumor
權利要求
1.一種融合蛋白質，其特征在于由抗人表皮生長因子受體的單鏈抗體EGFR scFv與來自人免疫球蛋白IgE的Fc段IgE-Fc構成，EGFR scFv和IgE-Fc之間由連接肽相連。
2.如權利要求1所述的融合蛋白質，其特征在于所述人免疫球蛋白IgE的Fc段的氨基酸序列為(1)如序列表中SEQ ID NO. 4所述；或者O)在SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列中經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸所得功能相同或相似的多肽。
3.如權利要求1所述的融合蛋白質，其特征在于所述人抗人表皮生長因子受體的單鏈抗體的氨基酸序列為(1)如序列表中SEQ ID NO. 2所述。或者O)在SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列中經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸所得功能相同或相似的多肽。
4.如權利要求1所述的融合蛋白質，其特征在于所述連接肽為人免疫球蛋白鉸鏈區。
5.如權利要求4所述的融合蛋白質，其特征在于所述人免疫球蛋白鉸鏈區的氨基酸序列為:EPKSCDKTHTCPPCP0
6.如權利要求1所述的融合蛋白質，其特征在于所述抗人表皮生長因子受體的單鏈抗體EGFR scFv的內部有連接輕鏈和重鏈的連接肽，其氨基酸序列為GGGGSGGGGSGGGGS。
7.如權利要求1所述的融合蛋白質，其特征在于其氨基酸序列為 (1)如序列表中SEQ ID NO. 12所示；或者O)在SEQ ID No. 12所示的氨基酸序列中經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸所得功能相同或相似的蛋白質。
8.如權利要求1 7任一項所述的融合蛋白質，其特征在于還在N端連接有信號肽。
9.如權利要求8所述的融合蛋白質，其特征在于其氨基酸序列為 (1)如序列表中SEQ ID NO. 8所示；或者O)在SEQ ID No. 8所示的蛋白的氨基酸序列中經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸所得的與SEQ ID No. ？所示的融合蛋白質的功能相同或相似的蛋白質。
10.如權利要求1 9任一項所述的融合蛋白質，其特征在于通過人免疫球蛋白的Fc 片段形成二聚體蛋白形式。
11.編碼權利要求1 10任一項融合蛋白質的重組DNA。
12.根據權利要求11所述的重組DNA，其特征在于其核苷酸序列為(1)如序列表中的SEQ ID NO. 7或SEQ ID NO. 11所或者為SEQ ID NO. 7或SEQ ID NO. 11的簡并序列；或者O)在(1)限定的核苷酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且與(1)限定的核苷酸序列編碼功能相同或相似的蛋白質。
13.包含權利要求11或12所述重組DNA的重組載體。
14.根據權利要求13所述的重組載體，其特征在于，所述的重組載體為質粒載體或病毒載體。
15.包含權利要求14所述重組載體的重組體。
16.權利要求1 10任一項所述的融合蛋白質、權利要求13或14所述的重組載體、或者權利要求15所述的重組體在制備抗腫瘤藥物中的應用。
17.一種藥物組合物，包括權利要求1 10任一項所述的融合蛋白質、權利要求13或 14所述的重組載體、或者權利要求15所述的重組體及藥學上的輔料。
18.如權利要求11所述的藥物組合物，其特征在于，還包括至少一種其他的抗腫瘤藥物。
全文摘要
本發明涉及基因工程和蛋白質工程技術領域，具體地說，涉及提供編碼包含IgE Fc段和抗EGFR的單鏈抗體(scFv)重組融合蛋白的DNA、其所編碼的融合蛋白、該融合蛋白的生產方法、該融合蛋白的藥物用途、該融合蛋白的治療方法。本發明融合蛋白，其在體內外都具有良好的生物活性和穩定性，能夠阻斷靶向EGFR陽性腫瘤細胞，激活免疫細胞，特異殺傷腫瘤細胞，從而抑制腫瘤的生長，具有好的應用前景。
文檔編號C12N1/19GK102241774SQ20111014018
公開日2011年11月16日 申請日期2011年5月27日 優先權日2010年5月27日
發明者勾藍圖, 楊金亮, 魏于全 申請人:四川大學