專利名稱：一種p2y1穩定表達細胞系的建立及其在藥物篩選中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程領域和醫藥技術領域，具體涉及ー種P2Y1穩定表達細胞系及其在藥物篩選中的應用。
背景技術：
人類血小板包括三種不同的ADP受體Ρ2Υ1、Ρ2Υ12和Ρ2Χ1。Ρ2Χ1是配體門控離子通道，Ρ2Υ1、Ρ2Υ12是與不同的兩種G蛋白偶聯受體(GPCR)。Ρ2Υ1屬于G蛋白偶聯受體中的Gi類，其中Ρ2Υ1、Ρ2Υ12是ADP作用的受體，也是ADP受體阻滯劑作用靶點。ADP與Ρ2Υ1受體結合后，Ρ2Υ1受體與Gq蛋白藕連激活磷酯酶C從而導致Ca2+從細胞外流入細胞內，細胞內Ca2+濃度的升高激活了蛋白激酶C引起血小板變形和聚集。P2Y1 受體是第一個被克隆出來的P2受體，在P2Y1受體缺失的小鼠中，ADP不能引起血小板的聚集。用選擇性的P2Y1受體拮抗劑A2P5P或A3P5P對ADP受體的研究中發現P2Y1受體的激活導致迅速和短暫的血小板聚集，說明P2Y1受體在血小板聚集的早期發揮重要的作用。但這些拮抗劑對ADP誘導的腺苷酸環化酶抑制并沒有效果，有研究表明P2Y1受體不能充分地誘導所有與ADP有關的血小板聚集.說明一定有另外ー種受體介導ADP對血小板的這種功倉^:。
發明內容
本發明的目的是提供ー種P2Y1穩定表達細胞系的制備方法。本發明提供的P2Y1穩定表達細胞系的制備方法，包括以下步驟I)將P2Y1基因的編碼序列插入到真核表達載體的多克隆位點，得到重組表達載體；2)將步驟I得到的重組表達載體導入宿主細胞中，篩選得到穩定表達P2Y1的細胞系O上述真核表達載體具體可為pTagLite-Snap、pEGFP_N3等。為了便于對表達的P2Y1進行細胞定位，可在真核表達載體上加入能于宿主中表達并產生顏色變化的酶或發光化合物的基因，如SNAP、GFP、YFP等。上述宿主細胞可為Hela細胞、MDA-MB-231細胞、MCF-7細胞等。利用上述方法制備的P2Y1穩定表達細胞系也屬于本發明的保護范圍。本發明的另ー個目的是提供ー種篩選預防和/或治療缺血性腦卒中、心肌梗死等藥物的細胞模型。實驗證明，本發明的P2Y1穩定表達細胞株對P2Y1阻斷劑和P2Y1抗體敏感，作用顯著。本發明的P2Y1穩定表達細胞系為深入探索P2Y1在高血壓中的作用提供實驗技術平臺，可用于篩選預防和/或治療缺血性腦卒中、心肌梗死等藥物。
圖I為重組表達載體pTagLite-Snap_P2Yl的構建流程2為各穩定表達P2Y1細胞系的P2Y1表達量實驗結果圖3為P2Y1穩定表達細胞系對P2Y1抑制劑的敏感性分析實驗結果
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進ー步說明，實施例僅為解釋性的，絕不意味著以任何方式限制本發明的范圍。本發明的P2Y1穩定表達細胞系的具體構建流程如圖I所示。實施例I. 重組真核表達載體pTagLite-Snap_P2Yl的構建下述實驗過程中所用的DNA引物由上海生エ生物技術有限公司合成。根據P2Y1蛋白編碼框的cDNA序列，設計PCR引物如下正向引物5，-ACTGATATCATGACCGAGGTGCTGTGGCCGGCTG-3，(下劃線處為限制性內切酶的識別位點)；反向引物5 ' -AACGAGCTCCAGGCTTGTATCTCCATTCTGCTTG-3 '(下劃線處為限制性內切酶的識別位點)。取人臍靜脈內皮細胞HUVEC并提取總RNA，將其反轉成cDNA，以該cDNA為模板，利用上述引物進行PCR擴增。將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳純化和回收，用限制性內切酶EcoRV和Xho I對純化回收后的產物進行酶切，酶切產物再次進行瓊脂糖凝膠電泳純化和回收，得到P2Y1蛋白編碼框的cDNA序列。同時，將真核表達載體pTagLite-Snap (購自Cisbio公司)也用EcoRV和XhoI進行雙酶切，酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳純化和回收。用DNA連接酶連接上述擴增得到的P2Y1蛋白編碼框的cDNA序列和真核表達載體pTagLite-Snap酶切后的產物，連接產物轉化大腸桿菌(E. coli Top 10)感受態細胞，并涂布于含有氨芐青霉素的LB平板上，挑取單克隆進行PCR檢測。對PCR產物進行測序，以檢測陽性克隆中插入序列的正確。測序結果表明，插入的1119bp的P2Y1蛋白編碼框的cDNA序列與GenBank AccessionNumber匪002563. 2的自5'端第837位-第1955位的序列一致。將得到的重組表達載體命名為 pTagLite-Snap-P2Yl。實施例2.P2Y1穩定表達細胞系的建立將上述步驟一得到的重組大腸桿菌利用Wizard Plus SVMinipreps (購自Promega)提取質粒，得到高純度的重組表達載體pTagLite_Snap-P2Yl,將重組表達載體pTagLite-Snap-P2Yl 利用 Lipofectamine 2000 (購自 Invitrogen)轉染 HeLa 細胞，繼續培養轉染后的HeLa細胞24小時以上。用G418 (濃度為I μ g/ml)對重組HeLa細胞進行篩選，經多次篩選后，得到P2Y1的穩定表達細胞系。將各株P2Y1穩定表達的Hela細胞株保存于液氮中。選取四個P2Y1穩定表達細胞株，利用抗P2Y1的抗體(購自AbCam公司)進行蛋白免疫印跡實驗，結果如圖2所示。其中，A-D分別表示不同的ET2的穩定表達細胞株的P2Y1表達量，Blank為轉入真核表達載體pTagLite-Snap的空白對照細胞,anti_Tubulin表示參照。結果表明，各P2Y1的穩定表達細胞株均有不用程度的P2Y1表達。實施例3.P2Y1穩定表達細胞系對P2Y1抑制劑(Clopidogrel)的敏感性分析選用上述實施例2的P2Y1穩定表達細胞、轉入真核表達載體pTagLite-Snap的細胞進行P2Y1抑制劑敏感性試驗。將P2Y1穩定表達細胞、轉入真核表達載體pTagLite-Snap的細胞培養于DMEM+10%胎牛血清的培養基里，將處于旺盛生長期的細胞(一般在傳代后20小時左右)經膜蛋白酶消化重懸后，進行細胞計數，以每孔IO3到IO4個細胞的量接種于96孔板中進行擴増，且每孔細胞數目均勻。24小時后，分別加入P2Y1抑制劑(Clopidogrel)。抑制齊Li (Clopidogrel)的濃度分別為 10、20、30、40 和 50nM。而后按照 ETcell-based Assay Kit (購自Cisbio)說明書進行HTRF (均相時間分辨突光)實驗,在加入抑制劑后的細胞孔板中加入標記的一抗和_■抗，鮮育30min后在sunrise酶標僅(TECAN公司產品)上于665和620nm波長處讀取吸光值，進行數據分析，具體結果如圖3所示。·
權利要求
1.P2Y1穩定表達細胞系的制備方法，包括以下步驟 1)將P2Y1的編碼基因插入真核表達載體的多克隆位點，得到重組表達載體； 2)將步驟I得到的重組表達載體導入宿主細胞中，篩選得到穩定表達P2Y1的細胞系。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述真核表達載體為pTagLite-Snap或PEGFP-N3。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞為HeLa細胞、MDA-MB-231細胞或MCF-7細胞。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的方法制備的P2Y1穩定表達細胞系。
5.根據權利要求4所述的P2Y1穩定表達細胞系，其特征在于，所述P2Y1穩定表達細胞系為SNAP-P2Y1穩定表達的HeLa細胞系。
6.權利要求4-5中任一項所述的P2Y1穩定表達細胞系在篩選預防和/或治療針對此靶點藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供的P2Y1穩定表達細胞系的制備方法，從而提供一種篩選預防和/或治療高血壓、缺血性心臟病的藥物的細胞模型。
文檔編號C12N15/85GK102827871SQ20111016142
公開日2012年12月19日 申請日期2011年6月16日 優先權日2011年6月16日
發明者譚初兵, 付剛, 周植星, 徐為人 申請人:天津藥物研究院