專利名稱：生物酶制劑的保藏方法
技術領域：
本發明涉及的是一種生物工程技術領域的方法，具體是一種生物酶制劑的保藏方法。
背景技術：
β -半乳糖苷酶(β -galactosidase,EC3. 2. 1. 23)，學名β -半乳糖苷半乳糖水解酶，是一種白色粉末，無味無嗅，溶解后是一種淺棕色液體。β -半乳糖苷酶在特定條件水解半乳糖苷鍵，能夠將乳糖水解成容易被小腸吸收的葡萄糖和半乳糖。同時半乳糖苷酶還具有轉半乳糖苷的作用，將半乳糖轉移到乳糖的半乳糖基上生成的一類含有2 5個單糖分子的低聚半乳糖，分子式為(Gal)n-Glu, η = 2 4。β -半乳糖苷酶水解乳糖和轉糖苷作用如圖1所示。由于半乳糖苷酶具有轉半乳糖苷的作用，在分解乳糖同時可以通過調控反應，生成各種低聚半乳糖。近年來很多研究表明低聚半乳糖具有許多獨特的生理功能，例如1)促使雙歧桿菌的增殖，從而抑制有害細菌；2)減少有毒發酵產物及有害細菌酶的產生、抑制病原菌和腹瀉，攝入低聚半乳糖，可有效地減少有毒發酵產物及有害細菌酶的產生。3)防止便秘；4)增強免疫力、抗腫瘤；5)保護肝功能；6)合成維生素、促進鈣的消化吸收；7)低能量、不會引起齲齒。因此，低聚半乳糖作為一種食物配料可廣泛應用于乳制品、 乳酸菌飲料、雙歧桿菌酸奶、谷物食品和保健食品中，尤其是應用于嬰幼兒和老年人的食品中。迄今為止，功能性低聚半乳糖及其產品都是采用半乳糖苷酶作為外源乳糖酶對乳糖進行水解以及更進一步的催化反應而得到相關產品。在這樣的背景下，近年來使用β -半乳糖苷酶生產乳糖分解牛奶和功能性低聚半乳糖產品成為一個新的研究熱點。那么有關半乳糖苷酶的來源和應用成為這方面的研究的基礎和關鍵性工作。半乳糖苷酶存在于植物(杏、桃、蘋果等)，細菌(大腸桿菌、 乳酸菌等)，真菌(米曲霉、黑曲霉、脆壁酵母、乳酸酵母、熱帶假絲酵母等)，放線菌以及哺乳動物(尤其是嬰兒)的腸道中。目前只有來源于微生物的半乳糖苷酶有工業應用價值利用微生物發酵法獲取半乳糖苷酶，酶源豐富，安全性有保證，生產周期短，可實現規模化工業生產，且不受季節、地理位置等因素的影響。與其他來源相比，微生物來源的 β -半乳糖苷酶成本較低，活力4000-6000U/g，售價約為30-60元/克。β -半乳糖苷酶的有限來源和價格就決定了一次性使用液體或者固體的酶勢必大大增加生產成本。因此進過許多科學家的努力，現在固定化半乳糖苷酶已經產業化生產和銷售。世界各大酶制劑公司和食品配料公司，例如丹麥的DANISC0公司、HANSEN公司、 荷蘭Quest公司和日本的住友化工都有供應。根據很多人的研究結果，由于酶的來源不同， 其生物化學反應條件、分解乳糖能力和生成低聚半乳糖的種類也不同，生成數量隨時間變化。理論上講使用固定化β -半乳糖苷酶生產乳糖分解牛奶和低聚半乳糖產品時，固定化酶是可以反復長時間連續性使用，降低生產成本。但是由于微生物來源的半乳糖苷酶的最適反應溫度(30_40°C )幾乎都是其來源微生物的最適生長溫度。生產者為加快反應速度，提高生產效率，一般都將酶觸反應溫度定在最適反應溫度范圍內。加上反應底物乳糖溶液、乳清和牛奶都是富含微生物生長的所需要的各種營養物質，例如蛋白質、碳水化合物和水等，而整個反應體系不可能做到無菌操作。因此，在酶觸的反應過程中分解乳糖，生成低聚半乳糖同時，不可避免地有微生物增殖，破壞反應體系，使酶的活力降低，一定時間后使酶失去活性，反應停止。另外，在酶觸的反應過程中底物中的蛋白質、微量脂肪、各種雜質、鹽類及其離子，都有可能附著在固定化酶表面，或者進入固定化酶微觀體系內，阻礙或者影響酶觸的反應。由于以上原因，固定化β -半乳糖苷酶在使用一段時間后，必須進行有效的清洗消毒處理，恢復其活力，才能實現反復長時間使用，保持生產的連續性，降低生產成本。如果不連續使用情況下，要尋找一種有效的保存方法，避免微生物污染，保持其活力。然而迄今為止，專一用于生物酶制劑在使用后的清洗消毒、活力恢復和保存的方法未見報道。通常參考食品工業常用的清洗消毒方法，主要有熱水清洗消毒、無機酸堿法、 高壓滅菌法和紫外線殺菌法等。但是由于固定化半乳糖苷酶是一種具有生物活性的酶制劑，食品工業常用的熱水、氫氧化鈉和硝酸、高壓和紫外線殺菌法在殺滅微生物的同時， 也很容易使半乳糖苷酶變性而失去活性。因此，采用相對溫和的復合有機酸堿法對固定化酶進行清洗消毒處理，配合使用有機殺菌劑在中性條件下保存是一個最好的選擇。早在十九世紀八十年代開始，許多科學家就開始研究各種復合型清洗劑和有機鹽類殺菌劑及其在食品生產中應用技術。復合型清洗劑主要是以堿性物質為主，同時含有表面活性劑和螯合劑。表面活性劑通常是油水兩親，它們都是含有疏水基團和親水基團的有機化合物。疏水基團排斥水，但能夠和油脂和油溶性物質相吸。同一分子親水基團將和水以及水溶性物質相吸引。因此在水溶液中表面活性劑就會帶著疏水基團吸引的油脂或者油溶性物質溶于水。同時他們還減少了在液液界面的吸附油和水之間的界面張力。這樣就能清除物體表面殘留的油脂或者油溶性物質。螯合劑通常是由一個簡單正離子和幾個中性分子或離子結合而成含有配離子的化合物。其結構中經常具有的五或六元環結構，在與蛋白質以及金屬離子結合時，配離子就像螃蟹一樣用兩只大鉗緊緊夾住集合物，因此能夠將物體表面殘留的蛋白質清楚。現代有機酸消毒劑是指含過氧乙酸和過氧辛酸的復合型消毒劑，可作為間接食品添加劑和食品接觸表面的殺菌劑。它是一種強有力的廣譜殺菌劑，對革蘭氏陽性和陰性菌、 酵母菌、霉菌、厭氧菌和產孢子菌以及藻類均有效。已通過了美國環保局注冊認可，同時還可與冷卻水中的一些常用的阻垢緩蝕劑，如螯合劑有很好的相容性。復合型機酸消毒劑具有分解產物無毒、對人體無害和殺菌效率高等多種優點。分解后主要產物為水、醋酸鹽、辛酸鹽和新生態氧，不會污染環境，是一種很有開發前景的食品工業用殺菌劑。十二烷基三甲基氯化銨是一種有機胺鹽，具有陽離子型化合物的性質，由于它的殺菌性能及表面活性作用，穿透性強，是一種良好的殺菌劑，這類殺菌劑的作用機理主要是陽離子通過靜電力、氫鍵力以及表面活性劑分子與蛋白質分子間的疏水結合等作用，吸附帶負電的細菌體，聚集在細菌細胞壁上，產生室阻效應，導致細菌生長受抑而死亡；同時其憎水烷基還能與細菌的親水基作用，改變膜的通透性，繼而發生溶胞作用，破壞細胞結構， 引起細胞的溶解和死亡。這類殺菌劑具有高效、低毒、不易受PH值變化的影響、使用方便、對粘液層有較強的剝離作用、化學性能穩定、分散及緩蝕作用較好等特點；已廣泛應用于油田水、工業冷卻水等方面。
發明內容
本發明針對現有技術存在的上述不足，提供一種生物酶制劑的保藏方法，為使用后的固定化β -半乳糖苷酶提供一種清洗消毒和保存方法，恢復其活力，實現固定化酶反復長時間使用，保持生產的連續性，降低生產成本。在不連續使用情況下，采用本發明的保存方法，能夠避免微生物污染，有效地保持固定化酶活力。本發明克服固定化半乳糖苷酶使用過程中因為受微生物污染以及蛋白質、脂肪和礦物質的影響，致使固定化酶活力低下，影響反應速度和生產效率，造成生產成本高的問題，實現了乳糖分解牛奶和含低聚半乳糖產品的可靠、有效、便捷的固定化酶清洗消毒和保存。本發明是通過以下技術方案實現的，本發明通過對固定化半乳糖苷酶進行清洗消毒和降溫保存，實現生物酶制劑的保藏。所述的固定化β -半乳糖苷酶是指用于分解牛奶中乳糖的固定化β -半乳糖苷酶，且該固定化β -半乳糖苷酶經連續使用12小時。所述的固定化半乳糖苷酶通過以下方式得到將殼聚糖珠與戊二醛在攪拌環境下交聯反應后得到活化的殼聚糖珠，將β-半乳糖苷酶與活化的殼聚糖珠混合后降溫 4°C并過夜，至實現固定。所述的清洗消毒是指依次用美普溶液和沃泰克斯溶液對固定化β -半乳糖苷酶進行清洗消毒，具體步驟為先用20 25°C去離子水沖洗8 10分鐘，然后用濃度為 0. 1-0. 5% Wt.的美普溶液，以2-3L/h的清洗速度清洗5 6min，清洗溫度為20_25°C ；再用10 15°C的去離子水沖洗8 10分鐘；最后用濃度為0. 15-0. 25% wt.的沃泰克斯殺菌液，以l_2L/h的流速消毒2 3min，消毒溫度為10_15°C。所述的美普溶液以及沃泰克斯殺菌液均采用市售(藝康化工有限公司)的有效成分為氫氧化鈉為主、同時含有表面活性劑和螯合劑的美普溶液以及有效成分為過氧乙酸和過氧辛酸的沃泰克斯殺菌液。所述的降溫保存是指將清洗消毒后的固定化半乳糖苷酶經沖洗后置于 4-6 0C、ρΗ值6. 0-7. 0的季銨鹽溶液中進行保存。所述的沖洗是指采用4 6°C的滅菌去離子水沖洗至ρΗ呈中性。所述的季銨鹽溶液是指濃度為30-50ppm，溶劑為去離子水，溶質為十二烷基三甲基氯化銨的季銨鹽溶液。本發明通過離子交換和梯度洗脫的方法，配合脈沖安培檢測系統檢測乳糖和低聚半乳糖以測試上述方法的效果，檢測環境設置為室溫環境檢測，流速lmL/min，進樣體積 20μ L，采用梯度洗脫法，通5psi氮氣檢測，使用四電位脈沖安培檢測器，采用波形檢測法， 其檢測電壓分別為El = +0. 10V、E2 = -2. 00V、E3 = +0. 60V和E4 = -0. IOV。使用的試劑是色譜級超純水、125mmol/L Na0H、2mol/L乙酸鈉、乳糖。本發明采用乳糖為標準物質在一定濃度范圍內進行了檢測，重復三次取其平均值并制作標準曲線。根據所測得的數據，繪制標準曲線，建立線性相關方程為y = 1.70011 Xx-O. 00075，相關系數R2為0. 99990，在相應濃度范圍內乳糖濃度和峰面積之間呈
5現良好的線性關系(見圖2)。固定化β -半乳糖苷酶活力及其活力恢復定義如下用固定化β -半乳糖苷酶在 25°C條件下處理10%的乳糖溶液，流速為lL/h，在一小時內每升固定化酶分解乳糖的量定
義為固定化酶活力。
:反應前1轄含量(姊)一反應后乳靖+含量( ^) ι - ;S3(Lii)
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堡(ι.)固定化酶活力恢復是指固定化β -半乳糖苷酶使用一段時間后，采用發明的清洗
消毒處理后酶活力恢復到使用前的百分數，計算方法如下本發明采用的預處理方法是遵照國標GB 12693-2010食品安全國家標準一乳制品良好生產規范，對于含脂肪的牛奶先進行脫脂處理，去掉脂肪和雜質。對于所有反應底物都采用瞬間短時間殺菌方法，冷卻，測定蛋白質、脂肪和碳水化合物，待用。本發明方法適用于使用后的固定化β -半乳糖苷酶生產乳糖分解牛奶和含低聚半乳糖產品的生產，即含蛋白質、脂肪、礦物質的牛奶，或者含有乳糖和礦物質的乳清以及只含乳糖的溶液。針對以上三種底物，用固定化半乳糖苷酶分解乳糖，生成低聚半乳糖。本發明的技術效果包括1)本發明方法中使用的試劑在規定的濃度范圍內全都是經過有關部門注冊認可， 對人體無害的物質。分解后主要產物為水、醋酸鹽和辛酸鹽等，不會污染環境，同時是一種強有力的廣譜殺菌劑，對革蘭氏陽性和陰性菌、酵母菌、霉菌、厭氧菌和產孢子菌均有很好的殺滅性。2)能夠地降低生產成本。在能夠固定化酶使用一段時間后，采用方明的清洗消毒處理能很好地恢復酶活力，可連續使用30天以上；采用發明的保存方法能夠保持酶活力， 使酶固定化酶能夠持續使用較長時間，降低了生產成本。3)能夠進行機械化連續操作。發明的固定化β -半乳糖苷酶清洗消毒和保存方法使用的全部是溶液，在設定的溫度條件下，可全部采用機械化連續操作，提高了清洗消毒生產效率。
圖1為β -半乳糖苷酶水解乳糖和轉糖苷作用機理。圖2為測定乳糖標準曲線圖。圖3為固定化乳糖酶清洗消毒操作系統和工藝流程圖。圖4為生產乳糖分解牛奶后固定化酶活力恢復示意圖。圖5為處理乳清后固定化酶活力恢復示意圖。圖6為處理乳糖溶液后固定化酶活力恢復示意圖。
具體實施例方式下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例1 對生產乳糖分解牛奶用的固定化β -半乳糖苷酶的應用結果β-半乳糖苷酶的固定化方法稱取2g殼聚糖珠一加入20ml 0. 5%戊二醛一交聯 40min(30°C,80rpm)—水洗得到活化的殼聚糖珠一加入IOml的lmg/ml酶液，固定過夜一水洗一4°C下保存。用固定化β -半乳糖苷酶生產乳糖分解牛奶采用脫脂牛奶，經過超高溫(140°C， 4s)殺菌處理后，測定乳糖、蛋白和脂肪含量，冷卻作為反應底物。使底物牛奶以lL/h流速通過反應器與固定化酶反應，經過4-5次循環，分解乳糖，測定剩余乳糖含量，計算乳糖分解率。當乳糖分解達到80%以上，換一批新的底物牛奶再進行操作，每天連續操作12小時。本實施例通過以下方式實現生物酶制劑的保藏第一步、建立固定化乳糖酶清洗消毒系統如圖3所示，帶有攪拌器8的物料回收缸2與帶有攪拌器8的物料缸1通過物料循環泵7相連，物料缸1的出口通過供料泵6與恒溫水浴缸5的入口相連，恒溫水浴缸5的測試端入口和測試端出口分別與反應器3相連， 反應器3的入液端和出液端分別與恒溫水浴缸5和物料回收缸2相連，所述的物料缸1采用IOL不銹鋼材質保溫物料缸所述的物料回收缸2采用IOL不銹鋼材質保溫物料回收缸所述的反應器3采用不銹鋼材質帶恒溫水循環夾套反應器(66mmX 300mm)；所述的恒溫水浴缸5采用6L不銹鋼材質保溫恒溫水浴缸所述的供料泵6采用J-X型柱塞式供料泵(0-12L/可調節精密計量泵、壓力 0-25MPa)所述的物料循環泵7采用⑶-2恒溫水循環泵OL/h)；所述的攪拌器8采用LXllO型低速攪拌器(lO-llOrpm/min)。第二步、固定化β -半乳糖苷酶的清洗消毒和保存每天當固定化β -半乳糖苷酶連續使用12小時后，對固定化進行清洗消毒處理，采用30ppm季銨鹽溶液中在4-6°C過夜保存。在第二天再使用相同的底物反應1小時，測定底物中乳糖含量，計算固定化酶活力和恢復情況。連續反復操作，直至固定化酶活力降低到開始使用時的50%為止。結果見圖4。實驗結果說明用固定化β -半乳糖苷酶生產乳糖分解牛奶時，采用本發明對使用 12小后的固定化β -半乳糖苷酶進行清洗消毒處理，可以持續使用30天以上，平均固定化活力能夠恢復80%以上。如果不連續使用時，將固定化半乳糖苷酶保存在4 6°C、 30ppm季銨鹽中可保持其活力。實施例2 對處理乳清用固定化β -半乳糖苷酶的應用結果β -半乳糖苷酶的固定化方法與實施例1相同。用固定化半乳糖苷酶處理乳清生產低聚半乳糖采用脫鹽乳清粉，配置成乳糖含量為10%的乳清溶液，經過超高溫(140°C，4s)殺菌處理后，測定乳糖和蛋白含量，冷卻作為反應底物。使底物乳清以lL/h流速通過反應器與固定化酶反應，經過4-5次循環，分解乳糖生成低聚半乳糖。使用離子色譜，采用離子交換和梯度洗脫的方法，配合脈沖安培檢測系統檢測乳糖和低聚半乳糖當乳糖分解達到80%以上，換一批新的底物乳清再進行操作，每天連續操作12小時。固定化半乳糖苷酶的清洗消毒和保存每天當固定化半乳糖苷酶連續使用12小時后，采用表1的方法對固定化進行清洗消毒處理，采用30ppm季銨鹽溶液中在 4_6°C過夜保存。在第二天再使用相同的底物反應1小時，測定底物中乳糖含量，計算固定化酶活力和恢復情況。連續反復操作，直至固定化酶活力降低到開始使用時的50%為止。 結果見圖5。實驗結果說明用固定化β -半乳糖苷酶處理乳清生產低聚半乳糖時，采用本發明對使用12小后的固定化半乳糖苷酶進行清洗消毒處理，固定化活力可恢復85%以上， 可以持續使用50天。如果不連續使用時，將固定化β -半乳糖苷酶保存在4 6°C、30ppm 季銨鹽中可保持其活力。分析其主要是因為乳清溶液中不含脂肪、各種鹽離子和蛋白質含量比牛奶低，對固定化酶的活力影響有限，本發明的清洗消毒方法有效，能夠很好地恢復固定化酶活力，長時間反復使用，降低生產成本，使生產能夠連續化自動進行。實施例3 對處理乳糖溶液用固定化β -半乳糖苷酶的應用結果β -半乳糖苷酶的固定化方法與實施例1相同。用固定化半乳糖苷酶處理乳糖溶液生產低聚半乳糖采用乳糖，配置成乳糖含量為10%的溶液，經過超高溫(14(TC，4s)殺菌處理后，測定乳糖含量，冷卻作為反應底物。使底物乳清以lL/h流速通過反應器與固定化酶反應，經過4-5次循環，分解乳糖生成低聚半乳糖。使用離子色譜，采用離子交換和梯度洗脫的方法，配合脈沖安培檢測系統檢測乳糖和低聚半乳糖。當乳糖分解達到80%以上，換一批新的底物乳清再進行操作，每天連續操作12小時。固定化半乳糖苷酶的清洗消毒和保存每天當固定化半乳糖苷酶連續使用12小時后，采用表1的方法對固定化進行清洗消毒處理，采用30ppm季銨鹽溶液中在 4_6°C過夜保存。在第二天再使用相同的底物反應1小時，測定底物中乳糖含量，計算固定化酶活力和恢復情況。連續反復操作，直至固定化酶活力降低到開始使用時的70%為止。 結果見圖6。實驗結果說明用固定化β -半乳糖苷酶處理乳糖溶液生產低聚半乳糖時，采用本發明對使用12小后的固定化β -半乳糖苷酶進行清洗消毒處理，固定化活力可恢復70% 以上，可以持續使用90天。如果不連續使用時，將固定化半乳糖苷酶保存在4 6°C、 30ppm季銨鹽中可保持其活力。分析其主要是因為乳糖溶液中不含蛋白和脂肪、各種鹽離子含量比牛奶和乳清低，對固定化酶的活力影響有限，本發明的清洗消毒方法有效，能夠很好地恢復固定化酶活力，長時間反復使用處理乳糖溶液生產低聚半乳糖，降低生產成本，使生產能夠連續化自動進行。
權利要求
1.一種生物酶制劑的保藏方法，其特征在于，通過對固定化β-半乳糖苷酶進行清洗消毒和降溫保存，實現生物酶制劑的保藏；所述的固定化β-半乳糖苷酶是指用于分解牛奶中乳糖的固定化β-半乳糖苷酶，且該固定化β-半乳糖苷酶經連續使用12小時。
2.根據權利要求1所述的生物酶制劑的保藏方法，其特征是，所述的固定化半乳糖苷酶通過以下方式得到將殼聚糖珠與戊二醛在攪拌環境下交聯反應后得到活化的殼聚糖珠，將β -半乳糖苷酶與活化的殼聚糖珠混合后降溫4°C并過夜，至實現固定。
3.根據權利要求1所述的生物酶制劑的保藏方法，其特征是，所述的清洗消毒是指依次用美普溶液和沃泰克斯溶液對固定化半乳糖苷酶進行清洗消毒，具體步驟為先用 20 25°C去離子水沖洗8 10分鐘，然后用濃度為0. 1-0. 5% wt.的美普溶液，以2-3L/ h的清洗速度清洗5 6min，清洗溫度為20_25°C ；再用10 15°C的去離子水沖洗8 10 分鐘；最后用濃度為0. 15-0. 25% wt.的沃泰克斯殺菌液，以l_2L/h的流速消毒2 3min， 消毒溫度為10-15°C。
4.根據權利要求1所述的生物酶制劑的保藏方法，其特征是，所述的降溫保存是指將清洗消毒后的固定化β -半乳糖苷酶經沖洗后置于4-6°C、pH值6. 0-7. 0的季銨鹽溶液中進行保存。
5.根據權利要求4所述的生物酶制劑的保藏方法，其特征是，所述的沖洗是指采用 4 6°C的滅菌去離子水沖洗至pH呈中性。
6.根據權利要求4所述的生物酶制劑的保藏方法，其特征是，所述的季銨鹽溶液是指 濃度為30-50ppm，溶劑為去離子水，溶質為十二烷基三甲基氯化銨的季銨鹽溶液。
全文摘要
一種生物工程技術領域的生物酶制劑的保藏方法，通過對固定化β-半乳糖苷酶進行清洗消毒和降溫保存，實現生物酶制劑的保藏；本發明針對用于分解牛奶中乳糖的固定化β-半乳糖苷酶，實現固定化酶反復長時間使用，保持生產的連續性，降低生產成本。在不連續使用情況下，采用本發明的保存方法，能夠避免微生物污染，有效地保持固定化酶活力。本發明克服固定化β-半乳糖苷酶使用過程中因為受微生物污染以及蛋白質、脂肪和礦物質的影響，致使固定化酶活力低下，影響反應速度和生產效率，造成生產成本高的問題，實現了乳糖分解牛奶和含低聚半乳糖產品的可靠、有效、便捷的固定化酶清洗消毒和保存。
文檔編號C12N9/38GK102286444SQ20111018647
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月5日 優先權日2011年7月5日
發明者余芳, 張少輝, 潘彬也, 鐘瑞強 申請人:上海交通大學