專利名稱：雙孢蘑菇333號菌株scar-pcr鑒定方法
技術領域：
本發明涉及一種針對雙孢蘑菇品種的特異性SCAR-PCR檢測方法，更具體涉及一種雙孢蘑菇333號菌株的特異性SCAR-PCR檢測方法。
背景技術：
雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)屬蘑菇科蘑菇屬，別名蘑菇、洋蘑菇、白蘑菇。其味道鮮美，質地脆嫩，屬高蛋白低脂肪的營養食品。經常食用雙孢蘑菇，可以防止壞血病、預防腫瘤，促進傷口愈合和解除鉛、砷、汞等的中毒，兼有補脾、潤肺、理氣、化痰之功效，能防止惡性貧血，改善神經功能，降低血脂。我國是食用蘑菇生產大國，但是食用蘑菇的菌種互相串弓丨，流通量大使得菌種市場的管理比較混亂，同物異名、同名異物的現象較為普遍，品種知識產權得不到有效保護。 自DNA雙螺旋結構發現以來，伴隨著分子生物學的發展許多生物技術已經用于食用蘑菇的分類鑒定研究。目前，常用的技術有隨機擴增多態性DNA(RAPD)、限制性片段長度多態性 (RFLP)、序列特異擴增區域(SCAR)、ITS序列分析等。繼同核不育單孢分離物配對雜交育種、原生質體融合等細胞水平的育種技術之后，雙袍蘑菇的遺傳育種已達到分子水平，其成果主要有同工酶電泳法鑒定種性，染色體混合標記連鎖圖的建立，纖維素酶、漆酶基因的克隆，性因子的定位等。而每個成果的取得都離不開各種遺傳標記在該物種研究上的應用及不斷更新。隨機擴增多態DNA (RAPD)技術在生命科學的許多研究領域已得到廣泛應用，包括遺傳多態性研究、分類研究、遺傳關系分析、某些特定基因標記、作連鎖圖譜等。這種以 PCR反應為基礎的技術克服了同工酶和RELP技術的一些缺點，具有快速、安全、簡便、靈敏度高、需樣量少的特點。該方法可用于鑒定不同類型的菌株，而不能對同一菌株進行檢測。各國對本國特產物種的保護已經成為國際貿易技術壁壘的新趨勢。為了使得我國農產品物種資源免遭國外侵犯，對雙孢蘑菇菌種資源權益保護，勢在必行。因此建立雙孢蘑菇菌種鑒別技術，十分必要。序列特異擴增區域(SCAR)的PCR擴增技術已被應用于香菇等食用菌菌種的鑒別， 但在雙孢蘑菇菌株鑒別上的應用，尚未見報道。
發明內容
本發明基于分子標記技術，建立一種雙孢蘑菇333號菌株的SCAR-PCR鑒定方法。本發明的蘑菇333由福建省蘑菇菌種研究推廣站提供，該菌種是目前國內主栽菌株，具有較強的適應能力，我國不管南方、北方都栽培有較大的面積。本發明的一種雙孢蘑菇333號菌株的特異性SCAR-PCR鑒定方法，是利用SCAR分子標記對雙孢蘑菇333號菌株進行PCR擴增。利用特異引物對蘑菇333的基因組DNA進行SCAR-PCR擴增，能特異性地擴增出 389 bp的產物；所述特異引物的核苷酸序列為MR333-F :5’ - AGGAAGGAAAGCACCAAATGG -3，； MR333-R 5' - CGCAACCCGTATTCAACTCC -3，。所述SCAR-PCR擴增的條件為94°C預變性5 min, 94°C變性1 min,退火68. 0°C 1 min，72°C延伸1 min，40個循環，最后72°C延伸10 min，4°C保存。反應體系為10 X Taq buffer 2.0 μ L，7 《酶 1. 5 U，模板 DNA 100 ng，MgCl2 3.5 mmol/L, dNTPs 300 μ mol/L, 上游引物0.5 ymol/L，下游引物0. 5 口11101/1，用(1(1!120將總體積補至2(^1^本發明的方法用于特異性地鑒別出雙孢蘑菇333號菌株，該方法耗時短，操作簡便，特異性強，只針對蘑菇333特異性擴增出389 bp的產物，可以更大地保護雙孢蘑菇的菌種資源。
圖1為40個雙孢蘑菇SCAR-PCR擴增產物圖譜。
具體實施例方式試劑來源10 X Taq buffer與7 《酶、dNIPs購自上海生工有限公司，引物委托上海生工有限公司合成，DNA序列委托廣州英韋創建生物科技有限公司測試。1.引物合成
根據SRAP-PCR擴增產物序列，應用I^rimer Premier 5. 0自動設計了 SCAR引物，并用 Oligo 6進行分析評價。共設計了 5對引物，成功擴增出PCR產物的只有1對，序列如表1。表1 SCAR-PCR引物及其退火溫度
權利要求
1.一種雙孢蘑菇333號菌株SCAR-PCR鑒定方法，其特征在于利用SCAR分子標記對雙孢蘑菇333號菌株進行PCR擴增。
2.根據權利要求1所述的雙孢蘑菇333號菌株SCAR-PCR鑒定方法，其特征在于利用特異引物對蘑菇333的基因組DNA進行SCAR-PCR擴增；所述特異引物的核苷酸序列為MR333-F :5’ - AGGAAGGAAAGCACCAAATGG -3，；MR333-R 5' - CGCAACCCGTATTCAACTCC -3，。
3.根據權利要求2所述的雙孢蘑菇333號菌株SCAR-PCR鑒定方法，其特征在于利用所述特異引物對蘑菇333的基因組DNA進行SCAR-PCR擴增，特異性地擴增出389 bp的產物。
4.根據權利要求2所述的雙孢蘑菇333號菌株SCAR-PCR鑒定方法，其特征在于所述 SCAR-PCR擴增的條件為94°C預變性5 min，94°C變性1 min，退火68. 0°C 1 min，72°C延伸 1 min，40個循環，最后72°C延伸10 min，4°C保存。
5.根據權利要求2所述的雙孢蘑菇333號菌株SCAR-PCR鑒定方法，其特征在于所述 SCAR-PCR擴增的反應體系為10 X Taq buffer 2.0 μ LJa《酶 1.5 U，模板DNA 100 ng, MgCl2 3.5 mmol/L,dNTPs 300 μ mol/L，上游引物 0. 5 μ mol/L，下游引物 0. 5 ymol/L，用 ddH20將總體積補至20 μ L0
全文摘要
本發明提供了一種雙孢蘑菇333號菌株SCAR-PCR鑒定方法，其特征在于利用SCAR分子標記對雙孢蘑菇333號菌株進行PCR擴增。本發明的方法用于特異性地鑒別出雙孢蘑菇333號菌株，該方法耗時短，操作簡便，特異性強，只針對蘑菇333特異性擴增出389bp的產物，可以更大地保護雙孢蘑菇的菌種資源。
文檔編號C12Q1/04GK102242208SQ20111018590
公開日2011年11月16日 申請日期2011年7月5日 優先權日2011年7月5日
發明者江樹勛, 邵碧英, 陳文炳 申請人:福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心