專利名稱：RNaseIII的突變基因在植物抗病中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種RNaseIII的突變基因在植物抗病中的應用。
背景技術：
玉米作為我國三大糧食作物之一，其常年種植面積約2000萬公頃，總產量達1200 億公斤。然而，近些年來，由于玉米病毒病逐漸加重，已成為玉米生產上的重要病害，尤其是玉米粗縮病。玉米粗縮病是由灰飛虱傳毒的一種病毒病害，廣泛分布于除非洲、北美外的熱帶、亞熱帶和溫帶的玉米產區。最早在意大利發現，之后在以色列、法國、瑞士、西班牙、德國、挪威、前捷克斯洛伐克、前南斯拉夫和阿根廷等國發生。在我國，50年代玉米粗縮病在新疆南部、甘肅西部曾嚴重發生，70年代流行于華北，近年來在我國東北、華北、西北、華中及長江以南部分地區大面積暴發、流行，具明顯的上升趨勢，成為我國玉米上的重要病害之一。據不完全統計，1996年全國玉米粗縮病發病面積233萬公頃，占玉米總種植面積的10% 以上，毀種絕收約4萬公頃，一般病田病株率達10-40%，平均減產10-30%。2007年山東省大面積爆發玉米粗縮病，全省發生面積約340萬畝，比往年都有所增加，嚴重時造成部分地塊近絕收。以上數據表明，玉米粗縮病已成為我國玉米上的重要病毒病害之一。RNaseIII家族是一類依賴于dsRNA的特異性的內切核酸酶，在真核生物或原核生物中都有發現，如細菌、酵母、線蟲、果蠅和人類等。此類酶在生物轉錄后調控中發揮著重要的作用在原核生物中，與rRNA前體的剪接，mRNA的代謝等生命過程密切相關；真核生物中，在性的發育或花的形成等生命活動起調控作用外，其缺失可造成生命的死亡。利用其切割dsRNA的特性，在生物體免疫，RNA干擾和植物抗病毒策略(PTR)等方面越來越發揮著重要功能。植物病毒多為單鏈正義RNA(ssRNA)，當病毒侵入植物體繁殖自身時，ssRNA復制形成dsRNA中間體，這正好是依賴dsRNA的內切核酸酶的靶向底物，RNaseIII結合到此結構，進行切割，形成小的RNA碎片。Court等于1993年提出因為植株基因組RNA很多都形成莖環狀的二級結構，導入野生型的RNaseIII將會對植物的正常生長有很大危害。他們將大腸桿菌中的RNaseIII基因(rnc)中的第117個氨基酸由谷氨酸突變為賴氨酸后，這種突變體(rnC70)就只能結合雙鏈RNA，而不能切割。目前還未有抗RBSDV的玉米品種，一旦感染玉米粗縮病，目前還沒有好的根治辦法，且抗性種質資源匱乏，因此開發轉基因玉米抗病新品種來從根本上控制玉米粗縮病的爆發顯得尤為重要和迫切。
發明內容
本發明的目的是提供一種培育轉基因植物方法。本發明提供的方法，為將RNaseIII突變體的編碼基因導入目的植物，獲得抗粗縮病的轉基因植物；所述RNaseIII突變體的氨基酸序列為序列表中的序列4。所述RNaseIII突變體的編碼基因(rnc70)為序列表中的序列1。所述目的植物為雙子 葉植物或者單子葉植物。所述雙子葉植物為玉米。所述粗縮病由下述致病菌引起水稻黑條矮縮病毒(Rice blackstreaked dwarf virus, RBSDV)。所述RNaseIII突變體的編碼基因(rnc70)通過表達載體導入所述目的植物，所述植物表達載體具體為PAM2025。本發明的實驗證明，本發明將RNaseIII突變體的編碼基因(rnc70)導入玉米中， 得到轉基因玉米新品種，該新品種對于常見玉米病毒病具有較強抗性，在大田栽培過程中， 在相同的病毒病危害情況下，本發明培育的轉基因玉米新品種與非轉基因或感病對照組相比具有明顯的抗病效果，從而對于減少病毒病危害，保障玉米穩產具有重要意義。
圖1為轉rnc70玉米植株的獲得圖2為轉rnc70玉米植株基因組PCR檢測結果圖3為轉rnc70玉米植株的PCR-Southern檢測
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、轉rnc70玉米的獲得一、重組農桿菌的獲得1、植物表達載體向農桿菌感受態細胞的轉化取200 μ 1感受態農桿菌LBA4404(張榮，王國英，張曉紅，趙虎基.根癌農桿菌介導的玉米遺傳轉化體系的建立.農業生物技術學報，2001，9(1) :45-48，公眾可從中國農業大學和河北省農林科學院植物保護研究所獲得)，加入lygpAM2025質粒(Mitra，Α.， Higgins, D. W. , Langenberg, W. G. , Nie, H. , Sengupta, D. N. , and Silverman, R. H. (1996). A mammalian 2—5A system functions as an antiviral pathway in transgenic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences93 (13)，6780-6785，公眾可從中國農業大學和河北省農林科學院植物保護研究所獲得，該質粒含有RNaseIII突變體的編碼基因rnCC70，該基因的核苷酸序列為序列表中的序列1，也可以人工合成序列1，RNaseIII突變體的氨基酸序列為序列表中的序列4.)，冰浴30min，液氮中速凍lmin，37°C水浴5min，然后加入Iml YEB培養基(含有125mg/L鏈霉素)，28°C慢速振蕩培養4h ；IOOOrpm離心30 秒，棄上清，加入0. Iml YEB培養基重新懸浮細胞，涂布于含有適當濃度的抗生素的YEB平板上，28°C培養約48h，得到重組農桿菌。2、陽性克隆的鑒定和保存挑取上述獲得的重組農桿菌在含有相應抗生素的YEB平板上劃線，28°C過夜培養，挑少許菌于含有2-3ml YEB液體培養基的指形管中，28°C過夜搖菌。用堿裂解法提質粒， 利用BamH I對提取的質粒進行單酶切鑒定，酶切后得到約681 bp大小的條帶對應的質粒為酶切鑒定陽性質粒；同樣，利用引物PRN3-3 :5，-CAACGGAAGCTGGGCTACAC-3，(序列2)禾口 PRN3-4 5 ‘ -TTGAACCTGTGCCAACCACC-3 ‘(序列 3)對質粒進行 PCR 鑒定，擴增得到約 592 bp 的片段的為PCR鑒定陽性質粒，將PCR鑒定結果與酶切鑒定結果均為陽性質粒即為陽性質粒。將含有該陽性質粒的重組農桿菌菌液加入甘油至終濃度為15%，混勻后保存于_70°C，或者將劃線的平板4°C保存，每隔一個月繼代一次，并命名為LBA4404/pAM2025。二、轉rnc70玉米的獲得1、農桿菌菌液的制備挑取繼代3天后LBA4404/pAM2025單菌落，在加有相應抗生素的液體YEB培養基中，以250rpm進行振蕩培養，在28°C培養至對數生長期后，將菌液置于離心管中，在 5000rpm下離心5min并收集菌體，將收集的菌體用含ΙΟΟμπιοΙ/L As (乙酰丁香酮)的 D-inf液體培養基洗1-2次，最后將菌體重懸浮于添加100 μ mol/L As的D-inf液體培養基中，OD值約0. 35-0. 45，放置0. 5h可用于轉化，得到農桿菌菌液。D-inf液體培養基配方
權利要求
1.一種培育轉基因植物方法，為將RNaseIII突變體的編碼基因導入目的植物，獲得抗粗縮病的轉基因植物；所述RNaseIII突變體的氨基酸序列為序列表中的序列4。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述RNaseIII突變體的編碼基因為序列表中的序列1。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物或者單子葉植物。
4.根據權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述單子葉植物為玉米。
5.根據權利要求1-4任一所述的方法，其特征在于所述粗縮病由下述致病菌引起水禾S漂條矮縮病毒(Rice blackstreaked dwarf virus)。
6.根據權利要求1-5任一所述的方法，其特征在于所述RNaseIII突變體的編碼基因通過表達載體導入所述目的植物。
全文摘要
本發明公開了一種RNaseIII的突變基因在植物抗病中的應用。本發明提供一種培育轉基因植物方法，為將RNaseIII突變體的編碼基因導入目的植物，獲得抗粗縮病的轉基因植物；所述RNaseIII突變體的氨基酸序列為序列表中的序列4。本發明的實驗證明，本發明培育的轉基因玉米新品種對于常見玉米病毒病具有較強抗性，在大田栽培過程中，在相同的病毒病危害情況下，本發明培育的轉基因玉米新品種與對照組相比具有明顯的抗病效果，從而對于減少病毒病危害，保障玉米穩產具有重要意義。
文檔編號C12N15/84GK102250945SQ20111018729
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月5日 優先權日2011年7月5日
發明者于嘉林, 劉賀, 張志燕, 張永亮, 徐佳凌, 曹修嶺, 李大偉, 田蘭芝, 苗洪芹, 路銀貴, 邸墊平, 韓成貴 申請人:中國農業大學, 河北省農林科學院植物保護研究所