一種重組植物ta-siRNA基因及應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種提供一種重組植物ta-siRNA基因，所述重組植物ta-siRNA基因按如下方法制備：根據植物ta-siRNA基因設計特異性引物，以植物總RNA為模板進行PCR擴增，獲得含植物ta-siRNA基因的擴增產物；再根據植物病毒的基因序列設計長度為21個核苷酸的siRNA序列，將一個或多個siRNA序列拼接成siRNA串聯序列，然后將siRNA串聯序列替換植物ta-siRNA基因中產生ta-siRNA的區域，獲得重組植物ta-siRNA基因；本發明通過對植物ta-siRNA基因進行改造，插入人工設計的不同病毒siRNA序列，從而使改造的植物ta-siRNA基因產生抗病毒的ta-siRNA，實現多重抗病毒的功效。
【專利說明】-種重組植物ta-s i RNA基因及應用 (一）
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種植物抗病毒基因工程技術，利用該技術可達到多重抗病毒的功 效。 (二）
【背景技術】
[0002] 植物病毒病害是三大植物病害之一，每年對全球農業造成巨大損失。近年來，由于 種植的集約化、品種的單一化造成植物病毒病害時有暴發流行。在田間，農作物要面對復雜 外界環境，不僅可能同時面對幾種病毒相繼或同時侵染，而且即使同一種病毒也可能由不 同差異的分離物組成。例如，煙草可被幾百種植物病毒侵染，水稻可被近二十種植物病毒侵 染（張仲凱，2001)。幾種病毒復合侵染往往會加重病毒的癥狀，造成更嚴重的經濟損失。多 病毒相繼侵染和復合侵染對抗病毒研究提出更嚴峻的挑戰，但是廣譜或多重抗病毒的研究 目前只有零星的報道，（Jan et al.，2000 ;Bucher et al.，2006)。相關的專利也少之又少， 目前僅有幾例相關的專利（W02010/123904, CN101519659)。
[0003] RNA沉默是一種普遍存在于真核生物體內的，發生在RNA水平的，基于核酸序列 特異性的相互作用來調控基因表達、抵御病毒、轉座子等外來入侵核酸的機制（Matzke et al.，2001)。RNA沉默啟始于細胞內的雙鏈RNA (dsRNA)的產生，包括植物自身通過RNA依 賴性RNA聚合酶（RDR)，DNA聚合酶（Polymerase)或病毒復制產生。這些sRNA在植物 體內Dicer等酶的作用下可在雙鏈部分產生21_24nt的小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)。siRNA 與 Argonaute (AGO)等蛋白一起組裝成 RNA 沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC)并將同源基因或病毒基因組沉默。由于RNA沉默是一種普遍存 在于真核生物體內的，發生在RNA水平的，基于核酸序列特異性的相互作用來調控基因表 達、抵御病毒、轉座子等外來入侵核酸的機制（Matzke et al.，2001)，并且目前發現幾乎所 有RNA病毒和DNA病毒都可以成為RNA沉默的靶標（Bisaro, 2006 ;Ribeiro et al.，2007)， 因此RNA沉默被認為在抗病毒方面具有重要的應用價值。事實上，基于植物RNA沉默機理 的轉基因培育抗病毒作物技術得到了較快的發展，其中抗黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus, CMV)、番木瓜環斑病毒（Papaya ringspot virus, PRSV)、辣椒花葉病毒（Paper mosaic virus, PMV)等黃瓜、番木瓜和辣椒品種已開始在全國多地推廣種植。
[0004] TAS基因是一類不編碼蛋白質的基因，這類基因轉錄產生的mRNA中含有一個 miRNA (例如miR390、miR173等）的結合序列，因此可被含有相應miRNA的RISC識別，隨后 在RDR6、DCL4等酶的作用下在miRNA結合位點的Y或:V的固定位置上進行切割，產生多 個21nt的siRNA (圖1)。這些siRNA又能與植物體內一些蛋白質編碼基因的mRNA結合，并 在RISC的作用下對其進行切割降解（Allen et al·，2005 ;Yoshikawa et al·，2005)。由于 這些siRNA是植物內源產生的，并且是反式（trans)起作用的，因此被命名為trans-acting siRNA(ta-siRNA)。生物信息學分析和實驗驗證，擬南芥基因組中包括8個TAS基因（TASla、 TASlb、TASlc、TAS2、TAS3a、TAS3b、TAS3c 和 TAS4)，這些 TAS 基因產生 ta-siRNA 的過程具 有高度保守、位置固定、產生高效（可同時產生多個）的特點（Allen and Howell，2010)。因 此，通過改造該基因 ta-siRNA產生相位的序列可實現同時沉默幾個基因或多重抗病毒。例 如，de la Luz Gutierrez-Nava等用不同長度FAD2基因（一種脂肪酶去飽和酶）片段甚至 一個人工設計的、與FAD2互補的21nt的siRNA替換TASlc基因中的一個ta-siRNA，將該 經過改造的人工TAS基因轉入擬南芥，轉基因擬南芥成功地產生相應ta-siRNA，并將內源 FAD2基因沉默，并且該人工TAS基因可被擬南芥穩定遺傳 （de la Luz Gutierrez-Nava et al.，2008)。W02007/039454描述了將ta-siRNA初級轉錄產物中的位相用siRNA替換，以沉 默或減弱植物內源基因的表達，包括玉米八氫番茄紅素去飽和酶基因，擬南芥PDS基因。 (三）
【發明內容】
[0005] 本發明目的是通過對植物ta-siRNA基因進行改造，插入人工設計的不同病毒 siRNA序列，從而使改造的植物ta-siRNA基因（重組植物ta-siRNA基因）產生抗病毒的 ta-siRNA，實現多重抗病毒的功效。
[0006] 本發明采用的技術方案是：
[0007] 本發明提供一種重組植物ta-siRNA基因，所述重組植物ta-siRNA基因按如下方 法制備：根據植物ta-siRNA基因設計特異性引物，以植物總RNA為模板進行PCR擴增，獲 得含植物ta-siRNA基因的擴增產物，然后將擴增產物插入至植物表達載體中，獲得含植物 ta-siRNA基因的表達載體；再根據植物病毒的基因序列設計長度為21個核苷酸的siRNA 序列，將一個或多個siRNA序列拼接成siRNA串聯序列（采用全基因合成法合成siRNA串 聯序列），然后將siRNA串聯序列替換含植物ta-siRNA基因表達載體的植物ta-siRNA基因 中產生ta-siRNA的區域，獲得重組植物ta-siRNA基因；所述替換的方法為：在siRNA串聯 序列5'端加入限制性內切酶2識別位點，3'端加入限制性內切酶3識別位點，用全基因合 成法合成完整序列，用限制性內切酶2和3消化以釋放該片段，并插入至同樣經過限制性內 切酶2和3消化的植物ta-siRNA基因表達載體中，得到重組植物ta-siRNA基因表達質粒。
[0008] 進一步，所述ta-siRNA序列由1?8種植物病毒的siRNA序列合成，優選3種，更 優選黃瓜花葉病毒、蕪菁花葉病毒或馬鈴薯X病毒。
[0009] 進一步,所述重組植物ta-siRNA基因可通過植物表達載體進行表達，并產生和 siRNA 序列一致的 ta-siRNA。
[0010] 本發明還提供一種重組植物ta-siRNA基因在制備多重抗病毒轉化體中的應用， 具體所述的應用為：
[0011] ⑴引物設計
[0012] 根據GenBank中植物ta-siRNA基因的序列設計特異性引物。其中，正向引物從 ta-siRNA基因的mRNA序列的Y端開始，并在Y端加入一個限制性內切酶序列（限制性 內切酶1識別位點）。反向引物從ta-siRNA基因 Y至:V方向第一個ta-siRNA的末端開 始，但3'端最后6個堿基以一個限制性內切酶的序列進行替換（限制性內切酶2識別位 點），并再加入另一個限制性內切酶序列（限制性內切酶3識別位點）。
[0013] (2)植物ta-siRNA基因的克隆
[0014] 以植物總RNA為模板，用步驟⑴設計的引物進行RT-PCR擴增，獲得植物 ta-siRNA基因的序列，插入至T載體中，并進行序列測定分析。
[0015] (3)植物ta-siRNA基因表達載體的構建
[0016] 用限制性內切酶1和3消化步驟（2)中獲得的質粒，以釋放ta-siRNA序列。將釋 放的ta-siRNA序列插入經過同樣限制性內切酶酶切的植物雙元表達載體中，獲得含植物 ta-siRNA基因的表達載體。
[0017] (4)抗病毒siRNA的設計與組裝
[0018] 從GenBank中下載目標病毒的基因組序列，用WMD3_Web microRNA designer (Plant J.，2008, 53:674-690)設計針對上述病毒的候選高效siRNA。用 TargetSearch和Blastn程序以設計的siRNA搜索植物的基因組和轉錄組，去除可能與之基 因組序列匹配并造成錯靶沉默的siRNA，最終獲得高效、特異性的抗病毒siRNA序列。
[0019] (5)重組植物ta-siRNA基因表達質粒的構建
[0020] 將設計的抗病毒siRNA組裝成siRNA串聯序列，并在5'端加入限制性內切酶2識 別位點，3'端加入限制性內切酶3識別位點。用全基因合成法合成完整序列，用限制性內 切酶2和3消化以釋放該片段，并插入至同樣經過限制性內切酶2和3消化的植物ta-siRNA 基因表達載體中，得到重組植物ta-siRNA基因表達質粒。
[0021] (6)重組植物ta-siRNA基因表達質粒的表達與檢測
[0022] 將重組植物ta-siRNA基因表達質粒通過電擊法導入農桿菌中，用花浸染法（擬 南芥，參考文獻：Weigel 和 Glazebrook，Arabidopsis. A laboratory Mannal, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002)或組培法（其它作物）將重組植物ta-siRNA基因表達質 粒轉化至目的植物的基因組中，獲得轉化植物。用RT-PCR、RACE或Northern blot對重組 植物ta-siRNA基因的表達進行檢測。
[0023] (7)抗病性性分析
[0024] 用農桿菌浸染法、機械接種法或介體昆蟲法接種目的病毒，經過一定時間后對轉 基因植株中病毒的復制進行檢測，獲得轉基因植株的抗病性信息，完成多重抗病毒體系的 構建。
[0025] 與現有技術相比，本發明的有益效果主要體現在：
[0026] 本發明通過對植物ta-siRNA基因進行改造，插入人工設計的不同病毒siRNA序 列，從而使改造的植物ta-siRNA基因（重組植物ta-siRNA基因）產生抗病毒的ta-siRNA， 實現多重抗病毒的功效。 (四）【專利附圖】
【附圖說明】
[0027] 圖1擬南芥AtTASla基因轉錄產物與miR173的作用以及產生ta-siRNA區域的示 意圖。
[0028] 圖2重組植物ta-siRNA基因表達載體（p2300-AtTASl)的構造，LB為T-DNA左邊 界；35S-Ter為35S終止子；nptll為卡那霉素抗性基因；35S為花椰花花葉病毒（CaMV)35S 啟動子；MCS為多克隆位點；0CS為0CS終止子；RB為T-DNA右邊界。
[0029] 圖3轉基因擬南芥ta-siRNA表達的檢測；A，重組植物ta-siRNA基因的構造；1 - 6分別為6個不同的抗病毒siRNA序列；B，抗病毒ta-siRNA的Northern blot檢測。
[0030] 圖4為擬南芥轉化株系TCT2-7對CMV、PVX和TuMV的抗性分析；A，qRT-PCR檢 測CMV、PVX和TuMV病毒在野生型和轉基因 PCT2-7擬南芥中的積累量（每種病毒共接 種10株轉化擬南芥植株，其中對3株植株進行病毒積累量的檢測）；其中WT+CMV，WT+PVX 和WT+TuMV分別表示野生型擬南芥接種CMV、PVX和TuMV后病毒的含量，PCT2-7+CMV， PCT2-7+PVX，PCT2-7+TuMV分別表示轉基因擬南芥PCT2-7分別接種CMV、PVX和TuMV后病 毒的含量；B，PCT2-7轉基因擬南芥株系接種CMV后的表型。 (五）【具體實施方式】
[0031] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于 此：
[0032] 實試例1
[0033] 含ta-siRNA的擬南芥重組基因（AtTASla)且同時抗黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus, CMV)、馬鈴薯 X 病毒（Potato virus X)和芫菁花葉病毒（Turnip mosaic virus, TuMV) 3 種病毒
[0034] 1、用液氮將3周大小的野生型擬南芥植株（Arabidopsis thaliana)組織研磨至 粉末，用 TRIzol (Invitrogen 公司）提取擬南芥的總 RNA，用 01igodT18_2(l(購自 Invitrogen 公司）為引物進行反轉錄（RT)合成的cDNA。
[0035] 2、根據擬南芥AtTASla基因（GenBank登錄號：EU419776,序列1所示）設計特異 性正向引物 TASl-KpnI-F : (5' ~CCGGTACCCTAACGGCTAAGCCTGAC~3,)(下劃線為 ΚρηΙ 酶切位 點）和反向引物 TASl-BamHI-R : (5' -GGGGATCCAAGGAGACTAGTGACTCATTCGCTTGT-3')(下劃 線分別為BamH I和Spe I酶切位點），以合成的cDNA為模板進行PCR擴增（反應體系為 50 μ L，反應條件為35個循環的94°C變性30秒，58 °C退火30秒，72 °C延伸50秒），獲得1 個大小為400bp的片段。將該片段回收后連接至pGEM-T載體（購自Promega公司）并進 行序列測定（上海桑尼公司，序列1)，將與擬南芥AtTASla基因序列一致的質粒命名為載體 pGEM-AtTASla。
[0036] 序列 1
[0037] 擬南芥 AtTASla 基因 mRNA 序列(GGTACC.ACTAGT 和 GGATCC 分別是 Κρη I，Spe I 和 BamH I的酶切位點）
[0038] GGTACCCTAACGGCTAAGCCTGACGTCATATACCAAAAAGAGTAAACATGAGCGCCGTCAAGCTCTGCA AGTACAATCTCATCTTACTCAAAAGTTGAGATAGGTTCTTAGATCAGGTTCCGCCTTTAGATCGAGTCATGGTCTTG TCTGATAGAAAGGTACTTTCTTTTACTTCTCTTGATTAGCGTCTATAGCTAGATTGAGATCGAGTTTGTGAGATGTT AGGTTCGATATCCCTGTCTATTTGTCACCAGCCATGTAGGAGTTTCGTCCCTTCCCCTCCCGTCGCCCTCTCTGTTT TTGGTATTCATTGGAATACGGAGATATATTTTCAAGAGGAGAAATATTGTTTTGTTGTGATTTTTCTCTACAAGCGA ATGAGTCACTAGTCTCCTTGGATCC 〇
[0039] RT-PCR擴增反應體系為50 μ L，其中10XPCR緩沖液5 μ L，Taq DNA聚合酶 1 μ L (2U)，正反向引物各 1 μ L (10mM)，模板 cDNAl μ L，dNTPluL (10mM)，滅菌水 40 μ L。
[0040] 3、用Kpnl和BamHI對載體pGEM-AtTASla進行雙酶切后以釋放其中AtTASla基因 片段，并連接于經過同樣酶切的P2300-35S載體，經測序（上海桑尼）鑒定正確后，命名為 表達載體 p2300-AtTASl (圖 2)。
[0041] 4、從GenBank中下載可以侵染擬南芥的3種植物病毒：黃瓜花葉病毒 (Cucumber mosaic virus, CMV)，完菁花葉病毒（Turnip mosaic virus, TuMV)，馬鈴薯 X 病毒（Potato virus X，PVX)的全基因組序列，用 WMD3_Web microRNA designer (Plant J.，2008, 53:674-690)設計針對上述病毒的候選siRNA。用TargetSearch和Blastn程序 對候選siRNA進行BlastN搜索水稻基因組和轉錄組，去除可能與水稻基因組序列匹配并造 成錯靶沉默的siRNA，最終獲得高效、特異性抗病毒候選siRNA(序列2-7)。
[0042] 序列 2
[0043] CMV RNA1 (HG917911) 2838_2858nt 反義序列
[0044] TTTAGCCGTAAGCTGGATGGA
[0045] 序列 3
[0046] CMV1 (HG917909) 129-149nt 反義序列
[0047] TTTATCGCCGTGGGAGGCTAC
[0048] 序列 4
[0049] PVX (EU571480) 5473-5493nt 反義序列
[0050] TAATGACTGCTATGATTGTTA
[0051] 序列 5
[0052] PVX(EU571480)4481-4501nt 反義序列
[0053] TGATGAGAATATCCATCTTAT
[0054] 序列 6
[0055] TuMV (AB747315) 385-405nt 反義序列
[0056] AACACGGCATTCGACCTAGGT
[0057] 序列 7
[0058] TuMV (AB747315) 2888-2908nt 反義序列
[0059] AATATTAGCCCTTGCTTCGAC。
[0060] 5、將抗病毒siRNA序列2-7進行組裝，并在5'端加入Spe I酶切位點，在3'端加 入BamH I酶切位點，完成抗病毒ta-siRNA串聯序列的設計（序列8)。采用全基因合成法合 成序列8,用Spe I和BamH I雙酶切后，分別插入經同樣限制性內切酶酶切的p2300-AtTASl 載體中，構建含ta-siRNA的表達質粒p2300-AtTASl :PCT，即獲得了含有ta-siRNA的重組植 物基因。
[0061] 序列 8
[0062] siRNA串聯序列(ACTAGT和GGATCC分別是Spe I和BamH I的酶切位點）
[0063] ACTAGTTTTAGCCGTAAGCTGGATGGATAATGACTGCTATGATTGTTAAACACGGCATTCGACCTAGGT TTTATCGCCGTGGGAGGCTACTGATGAGAATATCCATCTTATAATATTAGCCCTTGCTTCGACGGATCCo
[0064] 6、用電擊法將含ta-siRNA的表達質粒p2300_AtTASl :PCT轉化農桿菌 (Invitrogen)。取PCR鑒定陽性的菌用于擬南芥遺傳轉化。取花期的野生型擬南芥植株， 用花絮浸蘸法（Weigel 和 Glazebrook，Arabidopsis. A laboratory Mannal, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002)轉化擬南芥。轉化后擬南芥放于23°C培養箱中（光周期 18 :6)繼續生長，直至種子成熟，收取種子。將種子播種于Fafard營養土（購自加拿大Sun Gro Horticulture公司）中，待擬南芥長出2片真葉后，用40mg/mL的Kana(上海生工）溶 液進行噴施，每隔一天噴一次，直至90%以上擬南芥植株發黃死亡。將其中正常生長的擬南 芥移栽至新的花盤中，以Fafard營養土繼續培養。培養3周后，每株陽性植株各取1片葉 片提取總DNA，分別用根據35S啟動子和nptll基因設計的特異性引物（nptll-F: 5' -GGAGA 66〇^1'1^66〇^了6-3'和即《1-1?:5'-了41'111^^^460466041'-3'）進行？〇?擴增（反應體系為 50 μ L，反應條件為37個循環的94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸60秒），保存PCR 擴增結果為陽性的植株直至開花、結果，獲得轉基因 T1代種子。將T1代種子用質量濃度5% 次氯酸鈉水溶液消毒后平鋪于含50mg/mL的卡那霉素的MS培養基上培養至2片真葉。將在 含50mg/mL的卡那霉素的MS培養基上正常生長的擬南芥植株轉移至加拿大土中繼續生長 直至開花、結果，獲得轉基因 T2代種子。PCR擴增反應體系為50yL，其中10XPCR緩沖液 5μ L，TaqDNA聚合酶 1 μ L(2U)，正反向弓丨物各 1 μ L(10mM)，模板cDNAl μ L，dNTPluL(10mM)， 滅菌水40 μ L。
[0065] 7、對Τ2代植株再次用35S啟動子和nptII基因設計的特異性引物進行PCR擴增鑒 定（擴增引物，條件同步驟6中的PCR)。鑒定陽性的植株用TriZol (Invitrogen公司）提 取RNA，以磷32同位素標記的序列8為探針，用Northern blot對RNA進行檢測，結果表明重 組植物ta-siRNA基因中的抗病毒siRNA序列得到有效的表達（圖3)。對T2代植株用機械 接種法分別接種黃瓜花葉病毒，蕪菁花葉病毒和馬鈴薯X病毒。接種2周后，用Real-time RT-PCR對病毒的基因組進行檢測和分析。結果表明轉基因植株對所試的CMV、PVX和TuMV 都表現出高度的抗性，其中對CMV表現出免疫，即用Real-time RT-PCR在系統葉中不能檢測 到CMV病毒的基因組（圖4)。
[0001] _說明書核苷酸和氨基酸序列表_ SEQUENCE LISTING <110>浙江農林大學 <120> -種重鉬棺物ta-siRNA基閑及應用 <130> <160> 12 < 170> Patentln version 3.3 <210、 I <211> 26 <2I2> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 ccggtaccct aacggctaag cctgac 26 <2I0> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 ggggatccaa ggagactagt gactcattcg cttgt 35 <210> 3 <211> 20 <2I2> DNA ' 2I3> Arabidopsis thaliana <400> 3 ggagaggcta ttcggctatg 20 <210 4 <211> 16 ^2I2> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 4 tattcggcaa gcaggcat 16 <2I0> 5 <211> 402 <212 > DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 5 ggtaccctaa cggctaagcc tgacgtcata taccaaaaag agtaaacatg agcgccgtca 60 agctctgcaa gtacaatctc atcttactca aaagttgaga taggttctta. gatcaggttc 120
[0002] cgcctttaga tcgagtcatg gtcttgtctg atagaaaggt actttctttt acttctcttg 180 attagcgtct atagctagat tgagatcgag tttgtgagat gttaggttcg atatccctgt 240 ctatttgtca ccagccatgt aggagtttcg tcccttcccc tcccgtcgcc ctctctgttt 300 ttggtattca ttggaatacg gagatatatt ttcaagagga gaaatattgt tttgttgtga 360 tttttctcta caagcgaatg agtcactagt ctccttggat cc 402 <210> 6 <211 > 21 <2I2> DNA <213> Cucumber mosaic virus <400> 6 tttagccgta agctggatgg a 21 <210> 7 <211> 21 <2\2> DNA < 213> Cuciimber mosaic virus <400> 7 tttatcgccg tgggaggcta c 21 <210> 8 <211> 21 <2I2> DNA <21 .^> vims X <400 8 taatgactgc tatgattgtt a 21 <210> 9 <21l> 21 <2I2> Π)ΝΛ <213> Potato virus X <400 9 tgatgagaat atccatctta t 21 <210> 10 <2\\> 21 <2\2> DNA <2 IJ> Turnip mosaic virus <400> 10 aacacggcat tcgacctagg t 21 <210> 11 <21l> 21
[0003] <212> DNA <213> Turnip mosaic \ inis <40()> 11 aatattagcc cttgcttcga c 21 <2I0> 12 <21l> I3S <2I2> DNA <213> unknown <220> <223> 人工序列 <400> 12 actagtttta gccgtaagct ggatggataa tgactgctat gattgttaaa cacggcattc 60 gacctaggtt ttatcgccgt gggaggctac tgatgagaat atccatctta taatattagc 120 ccttgcttcg acggatcc 138
【權利要求】
1. 一種重組植物ta-siRNA基因，其特征在于所述重組植物ta-siRNA基因按如下方 法制備：根據植物ta-siRNA基因設計特異性引物，以植物總RNA為模板進行RT-PCR擴增， 獲得含植物ta-siRNA基因的擴增產物，然后將擴增產物插入至植物表達載體中，獲得含植 物ta-siRNA基因的表達載體；再根據植物病毒的基因序列設計長度為21個核苷酸的抗病 毒siRNA序列，將一個或多個抗病毒siRNA序列拼接成抗病毒siRNA串聯序列，然后用抗 病毒siRNA串聯序列替換含植物ta-siRNA基因的表達載體的植物ta-siRNA基因中產生 ta-siRNA的區域，獲得重組植物ta-siRNA基因。
2. 如權利要求1所述重組植物ta-siRNA基因，其特征在于所述抗病毒siRNA串聯序列 由1?8種抗病毒siRNA序列組成。
3. 如權利要求1所述重組植物ta-siRNA基因，其特征在于所述植物病毒為黃瓜花葉病 毒、蕪菁花葉病毒或馬鈴薯X病毒。
4. 如權利要求1所述重組植物ta-siRNA基因在制備多重抗病毒轉化體中的應用。
【文檔編號】A01H5/00GK104046628SQ201410223165
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年5月23日 優先權日:2014年5月23日
【發明者】武曉云, 馬新穎, 馮震, 詹琳琳, 蔡健宇 申請人:浙江農林大學