專利名稱：一種抗clcn7蛋白的單克隆抗體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫藥技術領域，具體而言本發明提供一種單克隆抗體，該抗體能特異識別C1CN7蛋白；以及所述抗體在制備用于治療各種骨骼和牙齒疾病的藥物中的應用，本發明還提供藥物組合物，其包含所述單克隆抗體作為活性成分。
背景技術：
抗體作為疾病預防、診斷和治療的制劑已有上百年的發展歷史。隨著基因工程抗體技術的發展和完善，抗體藥物已從鼠單克隆抗體發展到人鼠嵌合抗體、人源化抗體及人源抗體。截至2010年美國FDA已批準超過40個抗體藥物。此外還有超過120種抗體藥物處于臨床研究，超過500種抗體藥物處于臨床前研究。這些抗體主要應用于自身免疫性疾病、感染性疾病以及腫瘤的治療。氯離子通道是生物體內一種重要的陰離子通道，它們在細胞膜和胞內細胞器質膜的跨膜轉運中起著特定的生物學功能。ClC型氯 離子通道是一類分布廣泛的陰離子通道，參與細胞內囊泡的酸化、肌肉細胞的電壓穩定性等多種生理過程，其基因突變或功能異常都可導致多種疾病的發生。C1C-7是ClC型氯離子通道的成員，它主要位于后期內涵體、溶酶體和破骨細胞的豎起膜。在哺乳動物中，Cic型氯離子家族共有九個亞型，依據其細胞定位可以分為兩大類:第一類是存在于細胞膜，屬于原生質膜氯離子通道。它包含ClC-1，C1C_2和高同源性的CIC-ka和CIC-kb兩個異構體。另一類是存在于細胞器，屬于質子耦合Cl-轉運體。它包含C1C-3，C1C-4，C1C-5和C1C-6，C1C-7。這些ClC蛋白表達于不同器官的不同細胞類型中，只定位在細胞內的隔間上，從核內體到溶酶體。在小鼠和人，損失C1C-7或H+-ATP酶A3亞基會導致骨質，它是一種以有缺陷的骨吸收為特征的疾病，此外C1C-7基因敲除小鼠顯示出神經功能障礙和嚴重的溶酶體貯積病。在人和小鼠中，CLCN7基因突變會導致骨質和溶酶體貯積病。人CLCN7基因由大約26kb的基因組DNA編碼，定位于染色體16pl3。對基因組DNA序列的分析表明，人CLCN7基因包含25個外顯子，編碼含805個氨基酸的蛋白質H+/Cl-exchange transporter 7。人和小鼠的CLCN7基因似乎有相同的基因組組織，小鼠同源的C1C-7蛋白含有803個氨基酸，與人C1C-7蛋白有96.1 %相同。C1C-7蛋白具有組織特異性，可以在腦、肌肉、腎臟和睪丸的組織分析中檢測到它的轉錄，是一種廣泛表達的ClC氯離子通道家族的成員，主要位于后期內涵體，溶酶體，及破骨細胞。在破骨細胞，C1C-7可以配合H+-ATP酶酸化骨吸收陷窩。細胞內腔的酸化是由囊泡的H+-ATPase驅動的，它對于酶原活化、蛋白分撿、受體介導的內吞及突觸囊泡攝取神經遞質必不可少。破骨細胞的皺褶邊緣富含V-ATPase，破骨細胞通過它分泌氫離子來降解骨的礦物質，進行骨的吸收，是負責不斷重塑骨組織和維持鈣平衡的多核骨吸收細胞。破骨細胞的激活從骨基質的粘附開始，然后在豎起的邊界膜和礦化骨之間創建一個密閉的空間-一個陷窩。C1C-7可以通過晚期內體-溶酶體膜的胞外分泌插入到這個專門的質膜域，通過C1C-7的中和電流是高效的骨吸收陷窩酸化所必需的。骨吸收陷窩的酸化pH值接近于4.5，它由產生電的豎起邊境的H+-ATP酶介導，是骨的無機材料和有機骨基質溶解酶的化學溶解所必需的。酸化環境調動的骨組成的礦化成分主要是磷酸鈣，以暴露其隨后被酶降解的有機基質。通過內吞途徑進行大分子的降解過程中，溶酶體相當于細胞終端細胞器的胃。溶酶體含廣泛的水解酶，它的高效率的功能取決于酸性腸腔PH值的維持。雖然它是由V型質子ATP酶介導的酸化，但在允許散裝質子運輸途經中平行陰離子途徑是必不可少的。在溶酶體酸化中C1C-7是一個重要的CL-/H+逆向轉運體，它構成了溶酶體的主要Cl-通透性。盡管培養的神經元溶酶體的PH值不變，但CLCN7基因敲除小鼠顯示出嚴重的溶酶體貯積病。在破骨細胞中通過C1C-7轉基因的表達拯救他們的骨表型可以適度增加其壽命，并揭示了進一步進展的中樞神經系統的病理。Ostml是一個含有大量糖化的氨基末端區域和短胞質尾的I型膜蛋白。C1C-7需要Ostml作為B-亞基支持其骨吸收和溶酶體功能。由于在溶酶體高度糖化Ostml管腔域被切割，Ostml需要C1C-7達到溶酶體，而C1C-7可以在沒有Ostml的情況下達到它的目的地，但是C1C-7的穩定性取決于它與Ostml的組合。由于糖基化可以保護溶酶體膜蛋白不被降解，人們猜想高度糖化的Ostml蛋白質可以屏蔽唯一的缺乏N-連接糖基化位點的哺乳動物蛋白質C1C-7不被降 解。Ostml損失的病理觀察結果可能完全是由于隨后的C1C-7氯離子轉運不穩定。事實上，灰色致命的小鼠不僅有像Clcn7-/_老鼠表現出的骨質，也顯示出類似的溶酶體貯積病。2002年時Kornak等利用基因敲除建立Clcn7-/_小鼠模型，Clcn7-/_小鼠生后4周出現嚴重骨質硬化，貧血，肝脾腫大，視網膜和視神經退化。在小鼠中CLC-7的損失造成了嚴重的骨質，它是一種以有缺陷的骨吸收為特征的疾病。CLCN7基因敲除的小鼠雖然破骨細胞數量正常，但是由于它們不能酸化細胞的骨吸收陷窩而使得它們無法吸收骨。CLCN7基因敲除而患骨質的小鼠可通過破骨細胞特異性的轉基因表達C1C-7獲救。在人類惡性常染色體隱性遺傳的石骨癥(ARO)和“良性”的常染色體顯性遺傳骨癥II型(ADOII)也確定了 C1C-7的突變，這些表型以非骨吸收的破骨細胞為特征，顯示出簡陋的豎起邊界，這表明骨吸收陷窩在酸化過程中被干擾。其不同表型可以解釋為C1C-7氯離子通道功能減少的不同程度，因為C1C-7雜合子顯性負突變只能減少，但不能取消C1C-7的功能。CLCN7引起的ADOII的主要影像學特征為脊柱椎骨密度增高，呈典型的“夾心餅”征，額骨密度不均勻增高，出現濃淡相同的同心環狀波紋“骨中骨”現象。2003年ANNALISA等的研究結果表明:隱性C1CN7依賴的ARO可能與中樞神經系統受累有關，并很難預測，而雜合子C1C-7突變引起的表型，即使在同一個家庭表型范圍也很很廣，包括從早期重癥到幾乎無癥狀形式。除了其骨吸收的功能，CLC-7在生物體中還有其他重要的作用。2008年蘇營等人的研究表明小鼠牙胚發育過程中有Clcn7mRNA的表達，成釉細胞系LS8亦有Clcn7mRNA.小鼠牙胚鐘狀早期內釉上皮層細胞強陽性表達，鐘狀晚期成釉細胞、成牙本質細胞強陽性表達，研究結果提示CLC-7可能參與了牙釉質、牙本質的形成及礦化過程。另外，CLC-7缺陷小鼠顯示嚴重的視網膜變性。視覺障礙在嚴重的嬰幼兒骨癥患者是經常出現的，并且常常被歸因為骨質石化病中的視神經壓縮。最近的研究表明，CLC-7中斷導致以神經元蠟樣脂褐質(NCL)為典型特征的廣泛的中樞神經系統變性，它是人類的溶酶體貯積病的一個亞型。
本發明的特色是運用重組表達的CLCN7蛋白膜外區直接在非免疫鼠源ScFv噬菌體表面呈現表達庫中篩選，該抗體可以應用于與CLCN7蛋白密切相關的骨骼或牙齒相關疾病的治療領域。本發明提供的單克隆抗體命名為HX2，經過檢測單克隆抗體對特異性識別結合CLCN7蛋白。
發明內容
本發明的目的是提供一種單克隆抗體，所述單克隆抗體可與CLCN7蛋白特異性結合，從而可以用于制備治療骨骼和牙齒疾病的藥物。具體地，本發明提供以下:1.一種單克隆抗體，其特征在于，它的重鏈可變區由124個氨基酸殘基組成，序列如下(從N-端開始):
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Phe Val Arg Pro Gly Ala Leu Val LysLeu Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn lie Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val LysGln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp He Gly Trp He Asp Pro Glu Asn GlyAsn Thr lie Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Ser lie Thr Ala Asp Thr SerSer Asn Thr Ala Tyr Leu His Leu lie Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val TyrTyr Cys Ala Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val SerSer Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu編碼重鏈可變區的cDNA序列為(從5’端開始):gaggtgaagcttgtggagtctggggctgagtttgtgaggccaggggccttagtcaagttgtcctgcaaaggttctggcttcaacattaaagactactatatgcactgggtgaaacagaggcctgaacagggcctggagtggattggatggattgatcctgagaatggtaatactatatatgacccgaagttccagggcaaggccagtataacagcagacacatcctccaacacagcctacctgcacctcatcagcctgacatctgaggacactgccgtctattactgtgctagagactttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctcagccaaaacgacacccccatctgtctatccactg其輕鏈可變區由113個氨基酸殘基組成，序列如下(從N-端開始):Asp lie Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln AlaSer lie Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr LeuHis Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val SerAsn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr AspPhe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly lie Tyr Phe Cys SerGln Asn Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg編碼輕鏈可變區的cDNA序列為(從5’端開始):GACATTGTCATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTAGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAATTTATTTCTGCTC
TCAAAATACACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAACTGGAAATCAAACGG2.一種單克隆抗體，其特征在于，它的序列與權利要求書I所述的單克隆抗體的氨基酸序列有90%或90%以上的序列同源性。3.一種基因工程抗體，其特征在于，它所含有的重鏈和輕鏈可變區序列是與以上I和2所述的可變區的序列是一致的；該基因工程抗體可以是:人一鼠嵌合抗體(chimericantibodies);或者是人源化抗體(humanized antibody, HAb)或改形抗體(Reshapedantibody, RAb);或者是抗體的功能性片段Fab ;或者是單鏈抗體(single chain FVfragment, SCFv);或者是重鏈可變區和完整輕鏈的融合的抗體功能性片段VH-L ;或者是重鏈和輕鏈的一個或多個CDR的排列、串聯或組合而成的抗體功能性片段；或者是上述抗體或抗體功能片段和其他各種蛋白或多肽進行連接、拼接、融合而得到的類抗體的功能性的融合蛋白。4.如權利要求書1-2所述的單克隆抗體或權利要求書3所述的基因工程抗體，其特征在于，它與CLCN7蛋白具有特異的結合能力。5.如權利要求書1-4所述的單克隆抗體或基因工程抗體，其特征在于，它與CLCN7蛋白具有特異的結合能力，并用于骨骼和牙齒疾病的治療6.一種藥物組合物，其特征在于，它含有如權利要求書1-4所述的單克隆抗體或基因工程抗體；以及藥學上可接收的載體或緩沖液或添加劑或賦形劑。7.如權利要求書6所述的藥物組合物，其特征在于，它可用于治療各種骨骼和牙齒疾病。附圖表說明:
圖1.與恒定區連接后表達的全長HX2抗體的SDS-PAGE檢測。泳道I為經DTT還原后的HX2抗體重鏈和輕鏈；泳道2為蛋白標準分子量參考；泳道3為未還原的全長HX2抗體。
具體實施例方式為了更全面地理解和應用本發明，下文將參考實施例和附圖詳細描述本發明，所述實施例僅是意圖舉例說明本發明，而不是意圖限制本發明的范圍。本發明的范圍由后附的權利要求具體限定。實施例一、人源CLCN7蛋白重鉬表汰和鈍化設計引物(PrimerI:5/ GCATGCCATGGCCAACGTCTCTAAG和Primerfj' GTTCCTCGAGTTAGCGCTTGATCTCCACC)從人骨骼肌細胞cDNA中通過PCR擴增(PCR主要反應條件:94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸35秒；共 30個循環)，得到的目的片段經Ncol/Xhol雙酶切后連接到表達載體PHAT2的Ncol/Xhol位點之間，篩選陽性克隆后，經測序發現得到的序列與理論序列完全一致:
atggccaacgtctctaagaaggtgtcctggtccggccgggaccgggacgacgaggaggcggcgccgctgctgcggaggacggcgcggcccggcggggggacgccgctgctgaacggggctgggcctggggctgcgcgccagtcaccacgttctgcgcttttccgagtcggacatatgagcagcgtggagctggatgatgaacttttggacccggaTatggaccctccacatcccttccccaaggagatcccacacaacgagaagctcctgtccctcaagtatgagagcttggactatgacaacagtgagaaccagctgttcctggaggaggagcggcggatcaatcacacggccttccggacggtggagatcaagcgc ；其編碼的126個氨基酸殘基序列為:MANVSKKVSWSGRDRDDEEAAPLLRRTARPGGGTPLLNGAGPGAARQSPRSALFRVGHMSSVELDDELLDPDMDPPHPFPKEIPHNEKLLSLKYESLDYDNSENQLFLEEERRINHTAFRTVEIKR得到的重組質粒pHAT2-clcn7轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)中，從該轉化平板上挑單克隆于IOml新鮮培養基(含100ug/ml的氨芐青霉素)中37°C培養過夜；將過夜的IOml菌液轉入IL新鮮培養基(含100ug/ml的氨芐青霉素)于37°C培養4小時后，加入終濃度為0.5mM的IPTG誘導目的蛋白的表達，誘導6小時；于4°C 6000rpm離心收集菌體沉淀。將得到的菌體沉淀用60ml裂解緩沖液(25mM Tris, pH8, 500mMNaCl)重懸后，超聲裂解細菌； 15000rpm離心30分鐘(4°C )，收集上清，加入到經裂解緩沖液平衡好的Iml的N1-NTA填料中，上樣速度30ml/小時；再用裂解緩沖液清洗非親和結合的吸附蛋白；然后用IOml 洗脫緩沖液(25mM Tris, pH8,500mM NaCl,200mM imidazole)將目的蛋白洗脫下來，15% SDS-PAGE電泳分析純化結果。純化的蛋白脫鹽換到PBS緩沖體系中，_80°C凍存備用。實施例二、Panning篩選噬菌體表面呈現文庫是專利申請者之前構建的一個非免疫鼠源ScFv表達庫。本專利就是從該文庫中篩選能特異識別CLCN7蛋白的抗體。用CLCN7蛋白抗原包被塑料培養皿后，將重組噬菌體上清傾至其上，37°C培養2h，先后用PBS和PBST各洗板20次。然后將培養至對數生長期的TGl傾至免疫吸附后的培養皿上，37°C培養I小時。如此“吸附一洗脫一繁殖”的過程即為Panning篩選，再以M13K07超感染，就可生成富集克隆的噬菌體表面呈現文庫。以后按上述方法進行7輪篩選。實施例三、單個重組噬菌體克隆的抗原結合活性的鑒定1.制備單克隆重組噬菌體Panning篩選后，將TGI茵液按原液；I: 10 ；1: 100 ；1: 10004個稀釋度稀釋，鋪于SOBAG瓊脂板上，30°C倒置培養過夜。挑選90個單菌落，分別接種于IOOul的2XYTAG中，30°C培養過夜，取 20ul 培養物，加入 200ul 含 5X 10pfu/ml M13K07 的 2XYTAG 中，37°C振蕩培養2h，離心，用2XYTAK 200ul重懸沉淀，30°C培養過夜.離心后的上清即為單個重組噬菌體。2.ELISA 檢測抗原結合活性(Doui I lard, et al., Enzyme-linked ImmunosorbentAssay for Screening monoclonal antibody production using enzyme-labeled secondantibody,Meth.Enzymol,.92:168-74,1983)設I個陰性對照孔，I個陽性對照孔，90個待測孔。IOOu 10.5% BSA包被陰性對照孔，IOOul羊抗M13噬菌體抗體包被陽性對照孔，IOOul/孔(10ug/ml) CLCN7蛋白抗原包被待測孔。1% BSA 37°C封閉I小時。對照孔加M13噬菌體，待測孔加50ul待測上清與50ul封閉液的混合物，37°C孵育lh。用PBST洗板3次，各孔加IOOul工作濃度的HRP/羊抗M13噬茵體抗體，37°C反應I小時。PBST洗板4次，加新鮮配制的H202-ABTS，在410nm測每孔OD值。實施例四、陽性克隆的ScFv基因序列測定，真核表達和純化選擇篩選獲得的陽性克隆分別送公司進行DNA測序。設計引物將陽性克隆的輕重鏈可變區與鼠源IgG的對應的輕重鏈恒定區連接后插入到真核表達；然后分別轉染CHO細胞篩選穩定表達株。取Iml的ProteinG-sepharose FF介質到柱子中，經PBS平衡后，將收集的細胞培養上清經ProteinG-sepharose FF柱子純化，然后用PBS清洗50柱體積后，用IOOmMGlycine (pH3)將目的蛋白洗脫到IM Tris，pH8.5平衡液中。在分別透析到PBS緩沖液中。10% SDS-PAGE鑒定純化得到的抗體純品。實施例五、抗體的活性鑒定設I個陰性對照孔，I個陽性對照孔，4個待測孔。IOOul 10.5% BSA包被陰性對照孔，IOOul羊抗鼠抗體包被陽性對照孔，IOOul/孔(10ug/ml)CLCN7蛋白抗原包被待測孔。1% BSA 37°C封閉I小時。對照孔加IgG，待測孔加50ul待測抗體與50ul封閉液的混合物，37°C孵育lh。用PBST洗板3次，各孔加IOOul工作濃度的HRP/羊抗鼠抗體，37°C反應I小時。PBST洗板4次，加新鮮配制的H202-ABTS，在410nm測每孔OD值。結果發現只有一株抗體與抗原有很強的反應。命名為HX1。參考文獻Douillard, et al.， Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Screeningmonoclonal antibody production using enzyme-labeled second antibody, Meth.Enzymol,.92:168-74,1983 Leisle L et al.C1C-7 is a slowly voltage-gated 2C1/ΙΗ-exchanger andrequires Ostml for transport activity.EMBO J，2011，30:2140-2152Zhao Q et al.C1C-7:A potential therapeutic target for the treatment ofosteoporosis and neurodegeneration.BBRC，2009，384:277-279Lange PF et al.ClC_7requires Ostml as a b-subunit to support boneresorption and lysosomal function.Nature，2006，440:220-223Kasper D et al.Loss of the chloride channel C1C-7 leads to lysosomalstorage disease and neurodegeneration.EMBO J，2005，24:1079-1091Annalisa F et al.Chloride Channel C1CN7 Mutations Are Responsiblefor Severe Recessive, Dominant，and Intermediate Osteopetrosis.J.Bone, 2003,10:1740-1747蘇楠等.1I型常染色體顯性遺傳骨硬化癥一個家系的臨床和遺傳學分析.
中華骨質疏松和骨礦鹽疾病雜志，2011，4:18-22陳麗娥，謝浩.ClC型氯離子通道的研究.生命的化學，2010，30 =545-549張新偉.石骨癥的研究進展.國外醫學(輸血及血液學分冊)，2002，25 =453-45權利要求
1.一種單克隆抗體，其特征在于，它的重鏈可變區由124個氨基酸殘基組成，序列如SEQ ID NO:1所顯示；其輕鏈可變區由113個氨基酸殘基組成，序列如SEQ ID NO:2所顯示。
2.一種單克隆抗體，其特征在于，它的序列與權利要求書I所述的單克隆抗體的氨基酸序列有90%或90%以上的序列同源性。
3.一種基因工程抗體，其特征在于，它所含有的重鏈和輕鏈可變區序列是與權利要求書I和2所述的可變區的序列是一致的；該基因工程抗體可以是 人一鼠嵌合抗體(chimeric antibodies);或者是人源化抗體(humanized antibody, HAb)或改形抗體(Reshaped antibody, RAb);或者是抗體的功能性片段Fab ;或者是單鏈抗體(singlechain FV fragment, SCFv);或者是重鏈可變區和完整輕鏈的融合的抗體功能性片段VH-L ；或者是重鏈和輕鏈的一個或多個CDR的排列、串聯或組合而成的抗體功能性片段；或者是上述抗體或抗體功能片段和其他各種蛋白或多肽進行連接、拼接、融合而得到的類抗體的功能性的融合蛋白。
4.如權利要求書1-2所述的單克隆抗體或權利要求書3所述的基因工程抗體，其特征在于，它與C1CN7蛋白具有特異的結合能力。
5.如權利要求書1-4所述的單克隆抗體或基因工程抗體，其特征在于，它與C1CN7蛋白具有特異的結合能力，并用于骨骼和牙齒疾病的治療。
6.6.一種藥物組合物，其特征在于，它含有如權利要求書1-4所述的單克隆抗體或基因工程抗體；以及藥學上可接收的載體或緩沖液或添加劑或賦形劑。
7.如權利要求書6所述的藥物組合物，其特征在于，它可用于治療各種骨骼和牙齒疾病。
全文摘要
本發明提供了一種能特異性結ClCN7蛋白的單克隆抗體及其在治療骨骼和牙齒疾病中的功用。該單克隆抗體穩定性好、特異性強。本發明提供了該抗體的可變區序列。本發明還提供了一種藥物組合物。
文檔編號C07K16/46GK103183736SQ20111044355
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月27日 優先權日2011年12月27日
發明者安祺 申請人:北京和信非凡生物技術有限公司