一種采用固定化酶制備l-鳥氨酸的方法

專利名稱：一種采用固定化酶制備l-鳥氨酸的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術生產氨基酸的技術領域，涉及通過固定化酶法制備L-鳥氨酸及D-精氨酸的方法。
背景技術：
L-鳥氨酸學名為α，δ-二氨基戊酸，其不參與人體內蛋白質合成，但具備極其重要的生理功能。L-鳥氨酸存在于生物體多種組織和細胞中，在生物體代謝中起到重要作用， 是尿素生成的中間產物，參與產尿素的鳥氨酸循環，也是精氨酸、瓜氨酸等多種氨基酸代謝的前體物質，具有解毒作用，對人體肝臟細胞具有重大意義。L-鳥氨酸的制備方法包括化學合成法、直接發酵法和水解精氨酸法等幾種方法。 隨著鳥氨酸在食品工業和醫藥工業上的應用日益廣泛，對生產鳥氨酸方法的研究就具有重大的理論意義和經濟意義。水解精氨酸法包括堿水解法和酶水解法，其中，酶水解法具有很強的專一性，其反應過程簡單，副產物少，反應條件溫和，并且避免使用氰化氫等有毒化學品，底物轉化率高， 生成的L-鳥氨酸純度高，利于后續分離，因此利用精氨酸作為底物，在精氨酸酶的催化下生成L-鳥氨酸的酶水解方法受到廣泛的重視，是目前國內廠家生產L-鳥氨酸的常用方法。Makryaleas等人研究了精氨酸酶水解精氨酸制備L-鳥氨酸的方法，在pH 8. 0 10. 0時轉化率可高達99%。2005年，焦慶才等對L-精氨酸酶固定化生產L-鳥氨酸進行了研究，L-精氨酸的轉化率達到95%，并且采用該種固定化酶法相對于傳統酶法水解，在產物與催化劑的分離和工業化生產的連續控制等方面具有明顯的優勢。張鵬等利用糞腸球菌產生的精氨酸酶轉化生產L-鳥氨酸，產量可高達112 g/L，轉化率高達99. 5%。現有的生物酶法轉化盡管可達到一定高的轉化率，但采用可溶性酶催發反應，產物回收難度大、成本較高；而采用現有固定化方法，大多參入大量的化學試劑，對酶活力影響較大，且污染相對嚴重，本研究開發的固定化方法微生物偶聯方式，可避免酶活力損失嚴重、成本高、污染重等缺點。D-精氨酸是一種非蛋白質氨基酸，天然原料人工合成，研究表明D-精氨酸具有抗高血壓的功效；D-精氨酸的重要生理功能還表現在可抑制癌癥擴散，治療生長激素過多釋放造成的紊亂等方面。

發明內容
本發明的目的是為L-鳥氨酸及D-精氨酸的綠色生產提供一種固定化酶法合成方法。本實驗室構建了融合表達精氨酸酶的重組表達載體pET21a⑴-Argl和 pET3^-Argl并轉化至五cWi BL21 (DE3)，進行高效表達，獲得高活力的精氨酸酶和纖維素結合域-精氨酸酶(CBD-ARG)。通過CBD特異性識別纖維素的特性，對精氨酸酶進行了固定化，并優化交聯劑及其濃度，隨后對固定化的精氨酸酶反應條件進行了初步研究，為固定化酶法制備L-精氨酸和D-精氨酸的生產工藝奠定了基礎。本發明涉及基因工程菌大腸桿菌BL21(DE;3)-pET35b-Argl和 BL21(DE3)-pET21(+)-Argl，以底物L-精氨酸出發，經表達的精氨酸酶或者固定化的基因工程菌表達的精氨酸酶直接水解L-精氨酸，制備L-鳥氨酸；或者以底物DL-精氨酸出發，經固定化的基因工程菌表達的精氨酸酶直接水解L-精氨酸，制備L-鳥氨酸，同時保留 D-精氨酸。本發明首先自行構建了高效融合表達纖維素結合域-精氨酸酶的基因工程菌株大腸桿菌BL21 (DE3)-pET35b-Argl，即以小鼠肝臟mRNA反轉錄制備的cDNA為模板進行 PCR擴增精氨酸酶基因，構建pET21 (+) -Argl表達載體，并在大腸桿菌BL21 (DE3)中進行表達，隨后將確認的Argl基因轉入pET3^3，構建BL21 (DE3)-pET35b-Argl,并在大腸桿菌 BL21(DE3)中進行表達，其中大腸桿菌BL21(DE3)以及對應的表達載體pET21a (+)、ρΕΤ3^ 均為文獻報道和商業化可利用的表達體系。
本發明提供的固定化酶法制備L-鳥氨酸的方法，具體包括
以固定化的重組表達的精氨酸酶為酶源，酶促反應過程中，以L-精氨酸為底物，在25 至50°C下，ρΗ值為6至11，經酶法轉化反應1至5 h，在0. 1至10 mM Mn2+存在的條件下， 在每升催化反應液中底物L-精氨酸加入量為10至50 g，固定化酶0. 5 mL至5 mL,產生 L-鳥氨酸，進一步分離獲得L-鳥氨酸；分離純化方法是，過濾去除固定化酶后重結晶，沉淀獲得L-鳥氨酸。經酶法轉化反應0. 5 h至5 h，
或在相同條件下，以DL-精氨酸為底物，拆分80 g/L的DL-精氨酸制備D-精氨酸和 L-鳥氨酸。純化方法是大孔吸附樹脂001X7層析方法。本發明優選轉化溫度為37°C ；優選轉化ρΗ值為8. 0 ；優選轉化時間為2 h ；底物 L-精氨酸的用量優選為40 g/L ；Mn2+濃度為ImM ；固定化酶優選用量為2 mL/L。固定化酶源可重復使用15次以上，且在最佳的反應條件和體系下，前10次使用， 其催化底物轉化率均達到90%以上。所述用于固定化的重組表達的精氨酸酶來自以上構建的基因工程菌株大腸桿菌 BL21(DE3)-pET35b-Argl的細胞裂解液，重組菌株中的表達載體為pET3^-Argl重組表達載體，重組菌體細胞中表達有高活性的融合蛋白纖維素結合域-精氨酸酶，該重組菌株具備表達精氨酸酶、并能進行L-精氨酸轉化為L-鳥氨酸的反應，及以DL-精氨酸為底物拆分制備D-精氨酸和L-鳥氨酸。所述的固定化的重組表達的精氨酸酶是以上述的重組菌株的細胞裂解液為起始酶源，經過纖維素磁球吸附，實現吸附和固定化。固定化酶載體為纖維素載體，交聯劑為戊二醛或DMP。纖維素載體的材料為纖維素，粒徑大小為5 100微米，蛋白吸附能力為20 mg/mL，優選的交聯劑為DMP，最佳濃度為 0. 1%。纖維素載體包含自制的微球載體或非可溶性纖維素材料。在本發明實施例中，采用柱前衍生化HPLC法來測定DL-精氨酸及L-鳥氨酸，衍生化試劑為Marfey試劑，即1_氟_2，4_ 二硝基苯基_5_L_丙氨酰胺(FDAA)。柱前衍生化方法如下以100 μ L 10 mmol/L Na2CO3溶液(ρΗ 9)溶解氨基酸，使其終濃度為10 40 mmol/L，隨后加入到1%的FDAA 200 μ L丙酮溶液中，40°C孵育1 h后，加入2NHC1 20 μ L終止反應，20 mL 進樣分析。色譜柱C18 色譜柱(Phenomenex Luna 5μ , 100Α, 250X4. 6mm)； 進樣體積20 mL。流動相水(含0. P/oTFA)乙腈(含0. 1%TFA)=45 :55為流動相；室溫； 流速為1 mL/min ；檢測波長340 nm。
本發明的有益效果
本發明以L-精氨酸或DL-精氨酸為底物，利用固定化的高效融合表達的CBD-ARGl為酶源，酶法制備L-鳥氨酸或D-精氨酸。由于采用固定化酶直接進行酶法合成，方便易行， 催化效率高，發酵成本低，產物容易分離，因此本發明在L-鳥氨酸和D-精氨酸的工業化生產領域具有良好的產業化前景。


圖1是氨基酸的HPLC檢測； 圖2是交聯劑的優化， ■為DMP ;·為戊二醛； 圖3是催化條件的優化，分別是
反應溫度與L-精氨酸轉化率的關系；pH與L-精氨酸轉化率的關系；反應時間與L-精氨酸轉化率的關系；底物L-精氨酸對L-精氨酸轉化率的關系；固定化酶與L-精氨酸轉化率的關系；Mn2+與L-精氨酸轉化率的關系； 圖4是固定化酶穩定性考察。
具體實施例方式實施例1
精氨酸酶基因的克隆及表達
麻醉小鼠，取肝臟100 mg，提取mRNA后進行反轉錄PCR，1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶后，連接pET21a(+)載體，構建pET21a(+)-Argl，并轉入BL21 (DE3)，獲得基因工程菌 BL21(DE;3)-pET21a(+)-Argl，取一個精氨酸酶工程菌單菌落接種于LB培養基，37 °C培養過夜以獲得飽和培養物，將飽和培養物以1%接種于含Amp(100 μ g/ml)的LB培養基中， 37°C繼續培養OD6tltl達到0. 5時，添加IPTG至終濃度0. 1 mmol/L, 37°C誘導2 h誘導表達精氨酸酶。確認表達產物具備催化L-精氨酸轉化為L-鳥氨酸活性后，將Argl連接至pET3^3， 構建pET35b-Argl載體，并轉入BL21 (DE3)，獲得基因工程菌BL21 (DE3)-pET35b_Argl，誘導表達后確認表達產物具備催化L-精氨酸轉化為L-鳥氨酸活性。
實施例2
反應液中L-鳥氨酸及DL-精氨酸的高效液相色譜法檢測
以100 μ L 10 mmol/L Na2CO3溶液(pH 9)溶解DL-精氨酸及L-鳥氨酸，使其終濃度為10 40 mmol/L，隨后加入到1%的FDAA 200 μ L丙酮溶液中，40°C孵育1 h后，加入2N HCl 20 μ L終止反應，20 mL進樣分析。色譜柱C18色譜柱(Phenomenex Luna 5μ , 100Α, 250X4. 6mm)；進樣體積:20 mL。流動相水乙腈(含0. 1%TFA)=1 1為流動相；室溫；流速為1 mL/min ；檢測波長340 nm。
反應液離心取上清液，按上述方法衍生后進行HPLC分析，與鳥氨酸標準曲線比對，計算底物溶液中L-精氨酸的摩爾轉化率。實施例3 纖維素載體的制備
取10 g脫脂棉，浸泡于200 mL 19%的NaOH，室溫靜置2 h，去除堿液，分散后，室溫避光靜置3 d，加8mL CS2，立即密閉震動，210 rpm室溫振蕩過夜，向其中加入50 mL 6%的NaOH， 充分溶解纖維素膠后，210 rpm室溫振蕩直至得到均一的纖維素黃膠液。取20 mL纖維素黃膠液，加入50 mL有機相(氯苯四氯化碳=9:2)。13000 rpm勻漿anin，隨后將勻漿液加入 400 mL有機相中，75°C 300 rpm機械攪拌2 h，冷卻后洗滌獲得纖維素載體(產品的粒徑分布主要在5 100微米)。實施例4 精氨酸酶的固定化
分別取10 mL纖維素微球載體，加入到50 mL實施例1構建的基因工程菌 BL21 (DE3)-pET35b-Argl的裂解液中，4°C振蕩過夜。磷酸鈉緩沖液洗滌后，加入不同濃度的戊二醛或DMP交聯，隨后以IM Gly封閉10 h，磷酸鈉緩沖液洗滌，確認最佳的交聯劑為 DMP，濃度為0. 1%，4°C保存備用。將纖維素磁性微球替換為棉花等纖維素材料，具備相同的固定化結果。實施例5
固定化精氨酸酶反應條件優化
以上述實例4中固定化酶為酶源，分別在每升反應體系中加入底物L-精氨酸為1(Γ50 g ；Mn2+為0. 1 mTlO mM ；轉化溫度為25 50°C ；轉化pH值為6 11 ；轉化時間為0. 5 4 h，固定化酶為0.5、mL/L。(以上各參數具體取值如圖3中各點所示，此處略)考察不同的轉化條件對L-精氨酸轉化率的影響，并采用實施例2中的方法檢測L-鳥氨酸的含量，計算L-精氨酸的轉化率。如圖3所示，分別考察反應溫度與L-精氨酸轉化率的關系；固定化酶ImL ；底物L-精氨酸用量為 20g ；Mn2+為2mM ；轉化pH值為7 ；轉化時間為Ih。考察pH與L-精氨酸轉化率的關系；固定化酶ImL ；底物L-精氨酸用量為20g ；Mn2+ 為2mM ；轉化時間為Ih ；轉化溫度為37°C。考察反應時間與L-精氨酸轉化率的關系；固定化酶ImL ；底物L-精氨酸用量為 20 ；Mn2+為2mM ；轉化pH值為8 ；轉化溫度為37°C。考察底物與L-精氨酸轉化率的關系；固定化酶ImL ；Mn2+為2mM ；轉化溫度為37°C; 轉化PH值為8;轉化時間為池。考察固定化酶與L-精氨酸轉化率的關系；底物L-精氨酸用量為40g ；Mn2+為2mM ； 轉化PH值為8 ；轉化時間為池；轉化溫度為37°C。
考察Mn2+與L-精氨酸轉化率的關系；固定化酶2mL ；底物L-精氨酸用量為40g ；轉化溫度為37°C ；轉化pH值為8 ；轉化時間為池。確認最佳轉化條件反應溫度，37 1;反應體系？!1，8 ；反應時間，2 h ；底物濃度，40 g/L L-精氨酸；固定化酶用量，2 mL/L ;Mn2+濃度，1 mM。
在最適酶促反應條件下，L-精氨酸的轉化率約為97. 3%。實施例6
酶的穩定性考察
單次催化反應結束后過濾分離固定化酶和產物L-鳥氨酸，回收的固定化酶重復用于下一次催化反應。反復使用20次，固定化酶的重復實驗結果表明，L-精氨酸轉化率可達 80%以上，且前15次底物L-精氨酸的轉化率均在85%以上，前10次底物L-精氨酸的轉化率均在90%以上(圖4)。實施例7
L-鳥氨酸的制備及分離
以實施例5確定的最佳條件，以固定化酶為酶原酶法制備L-鳥氨酸，隨后過濾，收集上清液，采用重結晶方法制備L-鳥氨酸，100 mL體系中加入0.2 mL固定化酶，經10次連續反應，可制備L-鳥氨酸白色粉末28. 24 g，采用HPLC檢測，產物純度達到98. 9%。實施例8 DL-精氨酸的拆分
以實施例5確定的最佳條件，以固定化酶為酶原酶法拆分DL-精氨酸，隨后過濾，收集上清液，采用大孔吸附樹脂001X7層析分離，制備L-鳥氨酸和D-精氨酸，100 mL體系中加入0.2 mL固定化酶，經10次連續反應，可制備L-鳥氨酸白色粉末對.65 g，D-精氨酸 35. 44 g，采用HPLC檢測，產物純度均達到98. 1%以上。
權利要求
1.一種采用固定化酶制備L-鳥氨酸的方法，其特征在于該方法包括以固定化的重組表達的精氨酸酶為酶源，以L-精氨酸為底物，在25至50°C下，pH值為 6至11，經酶法轉化反應0.5至5 h，在0.1至10 mM Mn2+存在的條件下，在每升催化反應液中底物L-精氨酸加入量為10至50 g，固定化酶0.5 mL至5 mL，產生L-鳥氨酸，進一步分離獲得L-鳥氨酸；或在相同條件下，以DL-精氨酸為底物，拆分20至80 g/L的DL-精氨酸制備D-精氨酸和L-鳥氨酸。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述重組表達的精氨酸酶來自構建的基因工程菌株大腸桿菌BL21 (DE3) -pET35b-Argl的細胞裂解液，重組菌株中的表達載體為 pET35b-Argl重組表達載體，重組菌體細胞中表達有高活性的融合蛋白纖維素結合域_精氨酸酶，該重組菌株具備表達精氨酸酶、并能進行L-精氨酸轉化為L-鳥氨酸的反應，及以 DL-精氨酸為底物拆分制備D-精氨酸和L-鳥氨酸。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的固定化的重組表達的精氨酸酶是以權利要求2所述的重組菌株的細胞裂解液為起始酶源，經過纖維素磁球吸附，完成固定化，得到固定化的重組表達的精氨酸酶。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于固定化酶載體為纖維素載體，交聯劑為戊二醛或DMP，濃度為0. 0廣1%。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于優選轉化溫度為37°C；優選轉化pH值為 8.0;優選轉化時間為2 h;底物L-精氨酸的用量優選為40 g/L;Mn2+濃度為ImM;固定化酶優選用量為2 mL/L。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于固定化酶源可重復使用15次以上，且在最佳的反應條件和體系下，前10次使用，其催化底物轉化率均達到90%以上。
7.根據權利要求4所述的方法，其特征在于纖維素載體的材料為纖維素，粒徑大小為 5^100微米，蛋白吸附能力為20 mg/mL，優選的交聯劑為DMP，最佳濃度為0. 1%。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于纖維素載體包含自制的微球載體或非可溶性纖維素材料。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于以L-精氨酸為底物制備的L-鳥氨酸的純化方法是采用重結晶的方法，沉淀獲得L-鳥氨酸。
10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于以DL-精氨酸為底物制備的D-精氨酸和L-鳥氨酸的純化方法是大孔吸附樹脂001X7層析方法。
全文摘要
一種采用固定化酶制備L-鳥氨酸的方法。采用構建的精氨酸酶基因工程菌BL21(DE3)-pET35b-Arg，將其誘導表達，破碎細胞，收集上清液，對精氨酸酶的最適反應條件和固定化條件進行了研究。將自制的纖維素微球載體加入到細胞裂解液中，通過CBD的特異性吸附，實現精氨酸酶的固定化，采用交聯劑交聯之后，優化催化反應條件，最佳的催化反應條件為，pH8；反應時間2h；底物L-精氨酸濃度，40g/L；固定化酶濃度，2mL/L；Mn2+濃度，1mM。在最適反應條件下，重復使用10次，底物L-精氨酸的轉化率均達到90%以上。
文檔編號C12P13/10GK102286563SQ20111020207
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月19日 優先權日2011年7月19日
發明者侯潔, 張奇, 李鳴, 白芳, 白鋼 申請人:南開大學