專利名稱：一種利用miRNA-210為標志物的早期低氧檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物醫學技術領域，具體涉及一種利用miRNA-210為標志物的早期低氧檢測試劑盒及方法。
背景技術：
低氧是當前病理學研究的熱點，它包括高原低氧及多種疾病導致的體內器官缺氧等。高原低氧即隨著海拔升高，氧濃度逐漸降低，形成高原低壓低氧環境。高原低氧能導致人體產生一系列生理病理變化，即高原反應。疾病導致的體內缺氧則是由于血液供應不足導致的體內局部氧濃度較低，如心肌梗死，中風，粥樣動脈硬化等心腦血管疾病中，低氧也是重要的治病因素之一。另一方面，低氧也是實體瘤微環境的重要特征之一，是臨床上實體瘤對放療、化療產生耐受和預后效果差的重要原因。因此，不論是外界氧濃度的降低還是體內局部氧濃度的下降都對人體健康產生重要的影響。低氧誘導因子(Hypoxia Inducible Factor, HIF)是低氧感知系統的核心部件， 在轉錄水平協同調控數百個蛋白編碼基因。雖然長期以來低氧研究關注的主要是低氧(特別是HIF)誘導升高的基因，最近低氧抑制的基因也日益受到人們關注。2007年以來，有多個研究顯示低氧能誘導特異性microRNAs，并抑制一些有重要功能的基因的表達。miRNAs 在細胞生理病理過程中發揮重要調節作用。miRNAs的成熟活化形式長約19- 個核苷酸， 由高等真核生物基因組編碼，miRNA通過和靶基因3’非翻譯區的部分互補序列配對，引導沉默復合體(RISC)降解mRNA或阻礙其翻譯。現在普遍認為很多基因是通過這種方式調控的。目前的研究顯示miRNAs通過調節一系列基因的表達能夠參與細胞的所有代謝過程，包括分化、增殖、凋亡和代謝等。miR-210是低氧誘導因子(HIF)的靶基因，參與多個基因的調控，在低氧細胞中發揮重要作用。是一種潛在的能檢測動物和細胞中受低氧脅迫的標志物分子。
發明內容
本發明的目的在于提供一種檢測miRNA-210表達量的引物。本發明的目的還在于提供一種早期低氧檢測試劑盒。本發明的目的還在于提供一種非診斷目的的早期低氧檢測方法。一種檢測miRNA-210表達量的引物，所述引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2 所示。一種早期低氧檢測試劑盒，所述試劑盒包含序列表中SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2 所示的引物，標準樣品，內參引物，反轉錄酶，dNTPs, buffer, RNA酶抑制劑和滅菌水。所述標準樣品為未經過低氧處理的動物或人的組織樣品中的RNA反轉錄成的 cDNA。所述內參引物為根據待檢測動物或人任一高表達基因序列設計的引物。一種非診斷目的的早期低氧檢測方法，按照如下步驟進行
(1)提取待檢樣品的總RNA ；(2)將步驟(1)得到的總RNA反轉錄為cDNA ；(3)利用權利要求2或3所述的一種早期低氧檢測試劑盒，以步驟(2)得到的cDNA 為模板，做定量PCR，檢測樣品中miRNA-210的表達量；(4)若待檢樣品的表達量顯著高于標準樣品的表達量，則該待檢樣品取自早期低氧的生物組織樣品。本發明的有益效果
圖1是定量PCR檢測海拔5000米低壓低氧處理不同時間后大鼠腦脊液中mir-210
含量的結果。圖2是定量PCR檢測海拔5000米低壓低氧處理不同時間后大鼠腦組織中mir-210
含量的結果。圖3是定量PCR檢測海拔5000米低壓低氧處理不同時間后大鼠血液中mir-210
含量的結果。圖4是定量PCR檢測不同氧濃度和處理時間下神經干細胞培養液中mir-210含量的結果。圖5是定量PCR檢測不同氧濃度和處理時間下神經干細胞中mir-210含量的結^ ο
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明做進一步說明。以下實施例未說明的實驗步驟參照《分子克隆實驗指南》第三版，或參照相應試劑盒的說明書。實施例1樣品準備將M只平均體重250g的SD大鼠(由軍事醫學科學院動物中心提供)分為4組， 分別是對照組、低氧0. 5小時組、低氧1小時組和低氧2小時組。實驗組動物分別在低氧艙中給予5000米低壓低氧處理不同時間。低氧艙以20米/秒的速度勻速升至5000米，實驗結束后以20米/秒速度勻速降至常氧。大鼠低氧處理結束后立即用戊巴比妥鈉麻醉，取腦組織、腦脊液和血液用于miRNA-210的檢測。取孕13. 5天的wistar大鼠稱重后用戊巴比妥納(用量60_65mg/kg)腹腔注射麻醉。腹部用75%酒精消毒，置于超凈臺中。剪開大鼠腹部，取出子宮置于預冷的解剖液中， 除去胎膜，分離出胎鼠。將胎鼠放于平皿中置于解剖鏡下，剝去腦膜，分離出中腦，放入1毫升解剖液中，加入1毫升0. 25%的胰酶37度消化半小時。然后用含胎牛血清的DMEM/ F12培養基終止消化。700rpm離心4分鐘，棄上清，用無血清DMEM/F12培養基洗一次，除去殘留的血清和胰酶。用神經干細胞增殖液重懸細胞進行培養。將剛分離的第一代神經干細胞記為PO代，PO代的神經干細胞培養至四天左右即成為懸浮的神經細胞球。我們將神經球低速離心(600rpm，^iin)后棄去上清，用0. 25%的胰酶消化三分鐘，然后用含胎牛血清的培養液終止消化，低速離心(eOOrpmdmin)后棄上清，再用細胞培養液重復洗兩次后，用細胞增殖的完全培養液重懸細胞，計數后將細胞用完全培養液按1.5*105個/ml密度接種到培養瓶中，置孵育箱培養。傳代的神經干細胞P2 至P6代用于進行以下實驗的研究。將分組的神經干細胞轉入離心管，900rpm離心5min，取兩份250微升培養液加入 750微升Trizol LS中混勻，細胞沉淀加入1毫升Trizol裂解混勻。大鼠腦組織樣品收集 將分組的大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后，用1毫升注射器從椎骨大孔進針吸取腦脊液50-100微升，4度IOOOrpm離心5min，上清加入0. 5毫升Trizol LS中混勻。沒IOOmg腦組織加入1 毫升Trizol在勻漿器中勻漿。按照1 1000的用量在細胞上清液和腦脊與Trizol LS的混合物中加入外參(mir-Cel-5%iimiCS)。樣品與1Trizol的混合物可保存在_80度，實驗時從-80度冰箱取出，室溫放置20分鐘。實施例2大鼠腦組織、腦脊液、血液、神經干細胞和神經干細胞培養液中RNA的抽提(1)樣品(大鼠腦組織、腦脊液、血液、神經干細胞和神經干細胞培養液)室溫放置 5分鐘，從-80度冰箱取出的樣品室溫放置15分鐘至融化。(2)每毫升TRIZOL加200微升三氯甲烷，劇烈晃動15秒，室溫靜置3分鐘。(3) 4度12000g離心15分鐘，上層為RNA(4)將上層水相約500微升轉移到新EP管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒混勻 10秒，置于-20冰箱沉淀兩小時或過夜。(5)取出樣品，4度12000g離心15分鐘，倒掉上清加入1毫升75%乙醇(DEPC)洗滌沉淀，上下翻轉十次，使白色RNA沉淀浮起，7500g離心5分鐘，共進行兩次。(6)棄上清，吸盡管中液體，使乙醇揮發干凈(約2-5分鐘)(7)待RNA沉淀邊緣開始變干透明時，立即加入DEPC水(20微升左右)。取1微升用于定量，其它RNA與-80度保存備用。可加入1微升RNAase inhibiter防止RNA降解。實施例3反轉錄采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas)試劑盒進行反轉錄。對于神經干細胞培養液、血液和大鼠腦脊液RNA樣品每個樣品各取10微升RNA 樣品分別和mir-210(SEQ ID No. 3)及cel-M (SEQ ID No. 4)的特異性翻轉引物混合，70度水浴10分鐘，冰上放置兩分鐘。然后每個樣品分別加入buffer 4微升，dNTP 2微升，反轉錄酶 1 微升，RNAase inhibitor 1 微升。 對于神經干細胞和大鼠腦組織RNA樣品每個樣品取2微克RNA分別和 miRNA-210(SEQ ID No. 3)及U6 (SEQ ID No. 5)的特異性翻轉引物混合，70度水浴10分鐘， 冰上放置兩分鐘。然后每個樣品分別加入buffer 4微升，dNTP 2微升，反轉錄酶1微升， RNAase inhibitor 1微升。翻轉好的cDNA在-20度保存，避免反復凍融。實施例4定量-PCR按照實驗分組，每個樣品檢測內參和mir-210的含量。PCR正向引物和反向引物如序列表中SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，每個實驗組三個復孔，體系為15微升，儀器為 ABI公司，sybgreen為ABI公司產品。實驗體系為25微升2*sybgreen mix，21微升水，兩微升引物，兩微升Cdna。PCR反應條件是95度5分鐘，95度10秒，60度20秒，70度15秒，40個循環，溶解曲線為70度到95度，溫度間隔為0. 4度。PCR結果如圖1-5所示，隨著低氧時間的增加，腦脊液中的mir-210拷貝數上升，在低氧0. 5到1小時達到極顯著(圖1)；腦組織中mir-210的拷貝數在1到2小時內上升，達到極顯著(圖2)；血液中的mir-210的拷貝數在0.5小時的低氧時間內急速上升，以后略有下降，在0.5小時時達到極顯著(圖3)；神經干細胞上清中mir-210的拷貝數在不同低氧脅迫處理的濃度下，均在1小時達到極顯著(圖4)；神經干細胞中mir-210的拷貝數在 0. 5小時達到極顯著(圖5)；以上結果均表明，低氧脅迫處理均使mir-210的拷貝數增加。實施例5實施例1-4的結果表明，miRNA-210表達量在低氧脅迫時表達量上升，可作為檢測低氧脅迫的標志物分子，根據這個結果和GeneBank上公布的miRNA-210的基因序列，設計檢測miRNA-210表達量的通用引物和早期低氧檢測試劑盒，引物的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2所示；試劑盒包含序列表中SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2所示的引物，標準樣品，內參引物，反轉錄酶，dNTPs, buffer, RNA酶抑制劑和滅菌水；標準樣品為未經過低氧處理的動物或人的組織樣品中的RNA反轉錄成的cDNA ；內參引物為根據待檢生物體(人類和動物)任一大量穩定表達的基因的序列設計的引物。試劑盒的使用方法如下(1)提取待檢樣品的總RNA ；(2)將步驟(1)得到的總RNA反轉錄為cDNA ；(3)利用權利要求2或3所述的一種早期低氧檢測試劑盒，以步驟⑵得到的cDNA 為模板，做定量PCR，檢測樣品中miRNA-210的表達量；(4)若待檢樣品的表達量顯著高于標準樣品的表達量，則該待檢樣品取自早期低氧的生物組織樣品。
權利要求
1.一種檢測rniRNA-210表達量的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2 所示。
2.一種早期低氧檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權利要求1所述的引物，標準樣品，內參引物，反轉錄酶，dNTPs, buffer, RNA酶抑制劑和滅菌水。
3.根據權利要求2所述一種早期低氧檢測試劑盒，其特征在于，所述標準樣品為未經過低氧處理的動物或人的組織樣品中的RNA反轉錄成的cDNA。
4.一種非診斷目的的早期低氧檢測方法，其特征在于，按照如下步驟進行(1)提取待檢樣品的總RNA；(2)將步驟⑴得到的總RNA反轉錄為cDNA；(3)利用權利要求2或3所述的一種早期低氧檢測試劑盒，以步驟(2)得到的cDNA為模板，做定量PCR，檢測樣品中miRNA-210的表達量；(4)若待檢樣品的表達量顯著高于標準樣品的表達量，則該待檢樣品取自早期低氧的生物組織樣品。
全文摘要
本發明公開了屬于分子生物醫學技術領域的一種利用miRNA-210為標志物的早期低氧檢測試劑盒。本發明設計miRNA-210特異性的引物，采用定量PCR的方法檢測不同濃度的低氧環境對大鼠腦脊液、血液、腦組織以及神經干細胞、神經干細胞培養液中miRNA-210的含量變化，含量顯著增高為低氧脅迫組織。本發明的方法簡單，迅速，靈敏，適用于檢測動物和細胞是否處于低氧狀態。
文檔編號C12Q1/68GK102268483SQ20111022892
公開日2011年12月7日 申請日期2011年8月10日 優先權日2011年8月10日
發明者劉朝暉, 吳麗穎, 吳奎武, 朱玲玲, 王飛, 范明, 趙彤, 黃欣 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所