一種采用溫度誘導生產重組人表皮生長因子的方法

專利名稱：一種采用溫度誘導生產重組人表皮生長因子的方法
技術領域：
本發明屬于生物工程領域；更具體地，本發明涉及通過采用基因工程方法生產重組人表皮生長因子(rhEGF)。
背景技術：
人表皮生長因子(Humanepidermal growth factor,簡稱 hEGF),是一種由 53 個氨基酸組成的不含糖基的單鏈多肽，分子內有三對由6個半胱氨酸組成的二硫鍵，形成3個分子內環型結構，組成生物活性所必須的受體結合區域，其分子量為6，216道爾頓，等電點(PD 為 4. 6。hEGF是人體中一個重要的細胞因子，是類EGF大家族的一個成員，具有多種生物功能，它可促進外胚層和中胚層細胞，如表皮細胞、成纖維細胞、神經細胞的增殖，并可維持·其生長；在生物體發育中，EGF可促進新生兒齒、骨和各器官的生長；可促進肝細胞再生；可促進胃腸粘膜細胞生長和保護粘膜免受損傷等等。rhEGF在臨床上主要應用于⑴促進燒傷、各種外科創傷和手術傷口的愈合；⑵促進外科潰瘍的愈合，尤其是糖尿病性潰瘍和老爛腳等愈合；(3)用于皮膚、角膜移植；(4)治療角膜損傷和潰瘍；(5)促進胃、十二指腸潰瘍愈合。近年來，技術人員還將其用于鱗狀細胞癌、皮膚癌的治療，療效顯著。由于EGF分子內含有三對二硫鍵，因此對酸、堿、熱等理化因素均較為穩定，它是迄今發現的最穩定的多肽。基礎研究表明，EGF具有對皮膚表皮基底層細胞的激活作用，能在分子水平上對細胞進行修復和調整，促進皮膚細胞的新陳代謝，并調節細胞中色素的平衡，可以達到美白、抗皺、延緩衰老的作用。正是由于EGF具有上述特性和作用，因此近年來也被應用于化妝品和美容行業。目前，大規模制備重組hEGF (rhEGF)多是采用基因工程的方法，所采用的表達系統主要有大腸桿菌表達系統、枯草芽孢桿菌表達系統和酵母表達系統等。本發明人在先前的研究中，主要將精力放在采用大腸桿菌表達系統分泌表達rhEGF的研究上，并取得了很好的效果，比如，將含有大腸桿菌堿性磷酸酯酶啟動子和信號肽的質粒pAE-8，轉化大腸桿菌宿主菌YK537，得到工程菌株EE-8。該工程菌株在低磷條件下誘導表達rhEGF，最高表達量為150mg/l (中國專利號CN00127953.X);又如，將化學合成全新設計的phoAspLlO基因及其與hEGF的串聯基因，構建表達質粒pBLlOEGF (該質粒含有入噬菌體的啟動子)，進而以大腸桿菌BL21 (DE3)作為宿主細胞構建工程菌株BE-2，該菌株采用溫度誘導的方式，分泌表達rhEGF至384mg/l (中國專利號CN200510025289. 3)。然而，鑒于市場對于hEGF的需求量很大，本領域還有必要進行更優化的研究，以期進一步提高重組hEGF的產量、簡化生產過程或降低生產成本。

發明內容
本發明的目的在于提供一種采用溫度誘導生產重組人表皮生長因子的方法；以及用于高效表達重組人表皮生長因子的構建物。在本發明的第一方面，提供一種用于重組表達人表皮生長因子(hEGF)的構建物，其從5’至3’端依次包括以下操作性連接的元件噬菌體1\啟動子，OmpA信號肽基因，人表皮生長因子基因。在一個優選例中，所述的噬菌體啟動子來源于pBLGlu2 ;和/或所述的OmpA信號肽基因和人表皮生長因子基因的序列如SEQ ID NO :1所示。在另一優選例中，所述的構建物是表達載體。在另一優選例中，所述的噬菌體1\啟動子和OmpA信號肽基因之間具有限制性內切酶EcoRI酶切位點。在另一優選例中，所述的人表皮生長因子基因的下游具有限制性內切酶HindIII酶切位點。在本發明的另一方面，提供一種基因工程菌，其包含前面任一所述的構建物。在另一優選例中，所述的基因工程菌是大腸桿菌。在另一優選例中，所述的基因工程菌具有氨芐青霉素抗性。在本發明的另一方面，提供一種重組表達人表皮生長因子的方法，包括培養所述的基因工程菌，從而表達人表皮生長因子。在另一優選例中，先在30°C ±2°C (較佳地30±1°C)繁殖基因工程菌至菌體OD660值超過30 ;之后升高培養溫度至38.0±0. 5°C (較佳地38.0±0. 2°C )，使基因工程菌中所含噬菌體啟動子啟動，誘導分泌表達人表皮生長因子。在另一優選例中，誘導表達12±2小時；較佳地12±1小時。在另一優選例中，發酵培養基配方為酵母抽提物20±5g/L，蛋白胨，20±5g/L，氯化鈉1±0. 2g/L，無水硫酸鎂1±0. 2g/L，氯化銨 2±0.4g/L，硫酸銨 2±0.4g/L，磷酸二氫鈉· 3H20 O. 4125 ±O. lg/L，磷酸氫二鈉· 12H20 O. 675 ±O. 2g/L，氯化鈣 O. 02 ±O. 005g/L，1%維生素 ΒΙΟ. 2±0· 05ml/L,葡萄糖10±2g/L ;或補料培養基配方為葡萄糖650±50g/L,水解酪蛋白100±10g/L。在另一優選例中，在發酵前，進行種子培養，種子培養的條件是30°C ±2°C (較佳地30±1°C )培養12±2小時(較佳地12±1小時)。在另一優選例中，培養7±1小時后開始補料，第I小時補料50ml，第2小時補料70ml，第3小時補料100ml，第4小時補料150ml，第5小時補料220ml ;之后開始誘導表達，同時恒速補料，補料速度240ml/小時。在另一優選例中，誘導表達12±2小時(較佳地12±1小時)后發酵結束。在另一優選例中，發酵結束后，還包括從發酵液中分離人表皮生長因子。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖I、OmpA信號肽基因和人表皮生長因子(hEGF)基因串聯基因。圖2、分泌表達質粒pBLOmpAEGF構建示意圖。
圖3、陽性克隆核酸電泳圖。其中，第I欄為DNA Marker，分子量由下至上分別為100bp、250bp、500bp、750bp、IOOObp和2000bp ;第2欄為陰性對照；第3欄為陽性對照；第4欄為空白；第5欄為陽性克隆。圖4、工程菌株BL0E-3發酵曲線圖。X軸為發酵時間，Y軸是菌濃度OD66tl和EGF表達量(mg/L) ο
具體實施例方式本發明人長期致力于改進人表皮生長因子(hEGF)的表達技術，經過深入的研究，揭示了一種新的重組表達方法，將1\啟動子、OmpA信號肽、hEGF基因串聯構建分泌表達質 粒，將所述分泌表達質粒轉化原核生產菌株，利用該生產菌株進行hEGF生產。該方法表達效率高、表達周期短，表達量超過了 450mg/L。術語如本文所用，所述的“表達構建體(或稱DNA構建體)”指一種已經通過人為干預修飾，使其含有按照自然界中不存在的序列所組合和排列的DNA片段的單鏈或者雙鏈DNA分子。如本文所用，“元件”是指對于蛋白的表達有用的一系列功能性的核酸，本發明中，所述的“元件”被系統地構建以形成一種表達構建物(構建體)。所述的“元件”的序列可以是本發明中所提供的那些，也包括它們的變體，只要這些變體基本上保留了所述“元件”的功能，其通過插入或刪除一些堿基(如l_30bp,更佳地l_20bp,更佳地I-IObp,更佳地l-5bp),或進行隨機或定點突變等來獲得。如本文所用，所述的“操作性連接”或“可操作性相連”是指兩個或多個核酸區域或核酸序列的功能性的空間排列。例如啟動子區被置于相對于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的轉錄受到該啟動子區域的引導，從而，啟動子區域被“可操作地連接”到該核酸序列上。如本文所用，所述的“啟動子”或“啟動子區域”，代表本領域所共知的含義，表示一個基因的一部分，其含有可供RNA聚合酶結合的DNA序列和轉錄的起始點。如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……構成”、“基本上由……構成”、和“由……構成”;“主要由……構成”、“基本上由……構成”和“由……構成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。表達構建物本發明提供了一種用于重組表達hEGF的構建物，所述構建物從5’ 一 3’依次包括以下可操作性相連的元件噬菌體1\啟動子，OmpA信號肽基因，人表皮生長因子基因。所述的噬菌體啟動子為一種溫敏強啟動子，其可在一定的誘導溫度，如42°C下啟動下游基因的表達。本發明人意外發現，同時應用噬菌體1\啟動子進行誘導表達以及應用OmpA信號肽來分泌表達，可實現高產hEGF的目的。根據所公開的信息，進行了適當的變化且仍然保留其原有功能的上述元件的變異體也包括在本發明中。例如，在嚴格條件下與本發明限定的序列雜交且具有相同功能的序列變異體。如本文所用，術語“嚴格條件”是指(I)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如O. 2XSSC，0. 1% SDS，60°C ;或(2)雜交時加有變性劑，如50% (v/v)甲酰胺，O. 1%小牛血清/0. l%Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的同源性至少在50%，優選55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更優選是95%以上時才發生雜交。例如，所述序列也可為這些所限定序列的互補序列。本發明的各元件所指向的基因的核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。作為本發明的優選方式，所述的OmpA信號肽基因和人表皮生長因子基因的序列如SEQ ID NO :1所示，這是經過本發明人密碼子優化的序列，以獲得更高的表達效率。構建物中各元件之間還可包括限制性的酶切位點，這樣有利于各元件的有機連接。作為本發明的優選方式，啟動子1\和OmpA信號肽基因之間存在限制性內切酶酶切位點EcoRI ;在重組人表皮生長因子的下游存在限制性內切酶酶切位點Hindlll。通常，所述的構建物位于表達載體上。因此，本發明還包括一種載體，它含有所述的構建物。所述的表達載體通常還含有復制起點和/或標記基因等。本領域的技術人員熟知的方法能用于構建本發明所需的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀。作為本發明的一種具體實施例，構建了一種分泌表達質粒pBLOmpAEGF,該質粒被用于直接分泌表達hEGF。包含上述的適當多核苷酸序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當的宿主。在本發明的方法中，所述的宿主是大腸桿菌。本發明還提供了包含上述構建物的基因工程菌。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行，例如磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。作為一種優選的方式，可用預冷氯化鈣處理宿主細胞再升溫至42°C作短時處理的方法進行。作為本發明的一種具體實施例，提供了一種將分泌表達質粒pBLOmpAEGF轉化的大腸桿菌BL21 (DE3)宿主細胞，獲得高產的細胞，本發明人將之命名為基因工程菌BL0E-3。該BL0E-3菌株被用于發酵培養和誘導分泌表達hEGF。較佳地，其還具有氨芐青霉素抗性。表達方法一種重組表達人表皮生長因子的方法，包括培養含有所述構建物的基因工程菌，從而表達人表皮生長因子。提高hEGF產量的關鍵在于找到合適的元件來支持其表達，本發明人反復試驗后選擇了噬菌體啟動子和OmpA信號肽基因來調控hEGF的表達，通過合適的溫度誘導以及分泌表達，不僅大大提高了 hEGF的產量，也簡化了生產的過程，無需進行細胞破碎等程序。只有生產者多了，后續hEGF的產量才會更高。為了獲得大量生產hEGF的菌體，首先進行培養菌體使之大量繁殖的過程，該過程采取較低的溫度，這樣不會立即誘導噬菌體
啟動子啟動下游基因表達，有利于高效地繁殖菌株。而在獲得了足夠多的生產者(菌體)之后，再適當地升高發酵液的溫度，從而使得菌體內的噬菌體K啟動子被誘導，啟動下游基因的表達，并由OmpA信號肽引導進行分泌表達。在摸索最佳培養條件時，本發明人還發現，若將誘導溫度直接升至42°C，由于1\啟動子屬于強啟動子，它的強勢啟動會使帶OmpA信號肽的hEGF在短時間內大量表達，導致很多帶OmpA信號肽的hEGF因信號肽酶來不及切除OmpA信號肽并將rhEGF轉運到細胞膜外而堆積在周質中，只有那些被加工好的，與天然EGF構象完全一致的hEGF被分泌至培養基中。因此，調節這一表達、加工、轉運過程達到平衡成了關鍵。本發明人通過細致科學的實驗，找到了 BL0E-3的較佳誘導溫度和誘導時間，在38. 0±0. 5°C誘導表達人表皮生長因子，誘導表達12±2小時。在這樣的誘導溫度下hEGF的表達、加工、轉運過程達到較好的平衡，被分泌至培養基中rhEGF表達量也很高，超過了 450mg/L。在誘導表達前，還包括了培養菌株使之大量繁殖的過程，該過程與接種的種子菌質量也相關。因此，本發明人在進行發酵接種前，進行種子培養，較佳地，種子培養的條件是300C ±2°C培養 12±2 小時。
作為本發明的優選方式，針對培養的需要，本發明人還優化了培養過程的培養基，發酵培養基配方為酵母抽提物20±5g/L，蛋白胨20±5g/L，氯化鈉1±0. 2g/L，無水硫酸鎂 1±0· 2g/L，氯化銨 2±0· 4g/L，硫酸銨 2±0· 4g/L，磷酸二氫鈉· 3H20 O. 4125±O. lg/L,磷酸氫二鈉· 1乳0 O. 675 ±O. 2g/L，氯化鈣 O. 02 ±O. 005g/L，I % 維生素 ΒΙΟ. 2±0· 05ml/L，葡萄糖10±2g/L。補料培養基配方為葡萄糖650±50g/L，水解酪蛋白100±10g/L。上述的培養基配方，它含有足夠的營養成份，配方合理，足以滿足工程菌株的營養所需和生產所需，菌體生長和繁殖速率高，培養周期短即可達到高的菌體濃度和hEGF濃度。培養基因工程菌的其它條件，如通氣量、溶氧、攪拌速度等，可采用本領域已知的條件。在發酵培養結束后，還可包括步驟從發酵液中分離hEGF。從培養產物中分離或純化hEGF可采用本領域技術人員熟知的技術。例如可采用Phenyl Sepharose 6 FastFlow (high sub)、Q Sepharose High Performance 陰離子交換、Superdex 30 prep grade凝膠過濾三步法純化；或采用調pH至hEGF等電點4. 6后，加硫酸銨至35%飽和度，所得沉淀離心收集并溶解后再用Sephadex G50 superfine純化等。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例中所用到的基因、引物的合成，DNA的抽提及回收，DNA測序等，均是上海生工生物工程技術服務有限公司的產品或提供的服務；酶、dNTPs和DNA Marker則采用了TaKaRa公司的產品；EGF表達量測定采用的是R&D公司的Quantikine試劑盒。實施例I、設計并化學合成OmpA信號肽基因和人表皮生長因子(hEGF)基因串聯基因
如圖I所示設計OmpA信號肽基因和人表皮生長因子(hEGF)基因串聯基因。該基因包含序列表SEQ ID NO :I中所示的DNA序列。本發明人在設計上述串聯基因時，充分遵循了以下原則選用大腸桿菌偏愛的密碼子；AT、GC含量接近且分布均勻；片段內避免二級結構的產生。串聯基因通過化學合成的方法來制備。在上述串聯基因的5’端，設計了限制性內切酶EcoRI酶切位點，而在串聯基因的3’端，設計了限制性內切酶HindIII的酶切位點，便于構建分泌表達質粒。實施例2、分泌表達質粒pBLOmpAEGF的構建2. I起始載體pBLGlu2的EcoRI、HindIII雙酶切處理
pBLGlu2為已知的載體，見中國專利號CN200510025289. 3。配制如下反應混合液Iug 質粒 pBLGlu2 ；5 μ 110 XM 緩 中液；2μ I EcoRI 限制性內切酶(15U/y I)；2μ I HindIII 限制性內切酶(15U/y I)；滅菌雙蒸水補足50 μ I。將上述反應混合液于37°C反應6小時，所得的反應混合液反應液進行1%瓊脂糖電泳，在紫外燈下切下大條帶，用UNIQ-IO柱式DNA膠回收試劑盒回收，用50 μ I洗脫液洗脫。2. 20mpA信號肽基因和hEGF基因串聯基因的酶切處理配制如下反應混合液I μ g OmpA信號肽基因和hEGF基因串聯基因；5 μ 110 XM 緩 中液；2μ I EcoRI 限制性內切酶(15U/y I)；2μ I HindIII 限制性內切酶(15U/y I)；滅菌雙蒸水補足50 μ I。將上述反應混合液于37°C反應過夜，然后進行1%瓊脂糖電泳，在紫外燈下切下240bp左右的條帶，用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收DNA片段，用50 μ I洗脫液洗脫。2. 3 連接配制如下反應混合液5 μ I 2. I中經處理后的載體大片段；5μ I 2. 2 中經 EcoRI、HindIII 雙酶切的基因；2 μ 110 X T4DNA連接酶緩沖液；I μ I T4DNA 連接酶(350U/ μ I)；滅菌雙蒸水補足20 μ I。將上述反應混合液于16°C反應過夜。2. 4感受態細胞的制備將10μ1 Τ0Ρ10甘油菌接種至3ml LB培養基中，37°C 200rpm培養過夜，取100 μ I菌液再接入3ml LB培養基中，370C 200rpm培養至A_0. 3 O. 4，然后4，OOOrpm離心10分鐘，棄上清，菌體以預冷的鈣溶液(O. lmol/1 CaCl2)洗滌，4，OOOrpm離心10分鐘，菌體重懸于200 μ I的鈣溶液中備用。2. 5 轉化取2. 3中的連接產物，加入2. 4中制備的感受態細胞中，冰浴30分鐘，然后于42°C熱休克90秒，隨后加入800 μ I LB培養基，于37°C，IOOrpm,振搖30分鐘，取100 μ I涂布含100 μ g/ml氨芐青霉素的LB平板(瓊脂含量為1.5%)，37°C倒置培養過夜。2. 6獲得陽性克隆合成啟動子基因、OmpA信號肽基因和hEGF基因串聯基因的上游引物和下游引物，用于PCR反應篩選陽性克隆，引物序列如下上游引物(19bp)·
5，AGC ACA TCA GCA GGA CGC A 3’ (SEQ ID NO 2)；下游引物(22bp)5’ CCC AAG CTT ATT AAC GCA GTT C 3’ (SEQ ID NO :3)。用無菌牙簽挑取2. 5中長出的若干菌落于3ml LB(其中氨芐青霉素的濃度為100 μ g/ml)中，在37°C，200rpm培養過夜，以菌落培養液作為模板進行PCR反應。每個菌落培養液試樣按以下組合和反應條件進行PCR反應。配制如下反應混合液O. 25 μ I Ex Taq (5U/ μ I)；5 μ IlOXEx Taq 緩沖液；4 μ I dNTP Mixture ；1μ I上游引物;1μ I下游引物；1μ I菌落培養液；滅菌雙蒸水補足50 μ I。反應條件先94°C 2分鐘，再94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 40秒，共30個循環，然后72 C延伸5分鐘，最后降溫至4 C。PCR反應的陰性對照用I μ I滅菌雙蒸水代替菌落培養液,陽性對照用2. 2中溶解的I μ I OmpA信號肽基因和hEGF基因串聯基因代替菌落培養液。取PCR反應液20 μ I進行I. 5%瓊脂糖電泳，在紫外燈下，菌落培養液試樣的PCR反應產物于370bp左右處出現條帶的即為陽性克隆，見圖3。2. 7質粒的小量抽提取陽性克隆的培養液10μ I接種至3ml LB培養基(其中氨芐青霉素的濃度為100 μ g/ml)中，37°C 200rpm培養過夜，用UNIQ-IO柱式質粒小量抽提試劑盒，抽提陽性克隆的質粒。2.8DNA序列測定以2.6中的上游引物作為測序引物，對陽性克隆進行DNA序列測定。測序結果表明，在分泌表達質粒pBLOmpAEGF中，啟動子基因、OmpA信號肽基因和hEGF基因的串聯基因DNA序列與設計完全一致。通過上述步驟，本發明人完成了表達質粒pBLOmpAEGF的構建工作。構建重組質粒的過程以及獲得的重組質粒見圖2。
實施例3、工程菌株BL0E-3的發酵培養從實施例2獲得的分泌表達質粒pBLOmpAEGF，按照實施例2的2. 4-2. 5中的方法轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，如此獲得了重組菌株BL0E-3 ;通過正交實驗獲得了種子最佳培養條件，即30°C，12小時；以及獲得了發酵培養時最佳誘導溫度和誘導時間，即38. 2°C誘導12小時。以下列舉一種工程菌株BL0E-3的發酵培養的方法種子培養基為LB培養基。發酵培養基配方如下(g/L) 酵母抽提物20g/L，蛋白胨，20g/L，氯化鈉lg/L，無水硫酸鎂lg/L，氯化銨2g/L，硫酸銨 2g/L，磷酸二氫鈉· 3H20 O. 4125g/L，磷酸氫二鈉· 12H200. 675g/L，氯化鈣 O. 02g/L,I %維生素BIO. 2ml/L,葡萄糖10g/L。補料配方葡萄糖650g/L，水解酪蛋白100g/L。以5N氫氧化鈉調節pH在7. O。取100 μ I工程菌株BL0E-3甘油菌，接入30ml LB培養基中(氨芐青霉素的濃度為10(^8/!111)，于301、250印111培養12小時，再以3% (v/v)的接種量轉接到800ml LB培養基中(氨芐青霉素的濃度為100 μ g/ml)，同樣條件下培養12小時，然后按4%的接種量接入到裝有20升發酵培養基的40升發酵罐中進行發酵。初始培養條件設置為培養溫度30°C，通氣量為5slpm(標準公升每分鐘流量值；stard liter per minute) ,pH 7· 0,攪拌轉速200rpm,溶氧30%。隨著菌濃度不斷增加，逐增大通氣量至30slpm，攪拌轉速控制為200-500rpm。接種7小時后開始補料，第I小時補料50ml，第2小時補料70ml，第3小時補料100ml，第4小時補料150ml，第5小時補料220ml。接種后12小時(菌體OD660值超過30)，開始升溫誘導表達，將溫度設定至38. 2°C，同時開始恒速補料，補料速度控制在240ml/小時。誘導開始后，在不同的時間點取樣測定hEGF的表達量,每2小時取樣一次。培養24小時后放罐，按常規方法從發酵液中純化hEGF。整個培養過程中菌株的OD值以及hEGF的表達量如圖3所示，培養基中的rhEGF最高表達量可以達到452mg/L。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.一種用于重組表達人表皮生長因子的構建物，其從5’至3’端依次包括以下操作性連接的元件 噬菌體啟動子，OmpA信號肽基因，人表皮生長因子基因。
2.如權利要求I所述的，其特征在于，所述的噬菌體啟動子來源于pBLGlu2;和/或 所述的OmpA信號肽基因和人表皮生長因子基因的序列如SEQ ID NO :1所示。
3.如權利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述的構建物是表達載體。
4.一種基因工程菌，其特征在于，其包含權利要求1-3任一所述的構建物。
5.一種重組表達人表皮生長因子的方法，包括培養權利要求4所述的基因工程菌，從·而表達人表皮生長因子。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，先在30°C±2°C繁殖基因工程菌至菌體OD66tl值超過30 ;之后升高培養溫度至38.0±0. 5°C，使基因工程菌中所含噬菌體啟動子啟動，誘導分泌表達人表皮生長因子。
7.如權利要求6所述的方法,其特征在于,誘導表達12±2小時。
8.如權利要求5所述的方法，其特征在于，發酵培養基配方為 酵母抽提物20±5g/L，蛋白胨，20±5g/L，氯化鈉1 + 0. 2g/L，無水硫酸鎂1 + 0. 2g/L,氯化銨 2±0. 4g/L，硫酸銨 2±0. 4g/L，磷酸二氫鈉· 3H20 O. 4125±0. lg/L，磷酸氫二鈉· 12H20 O. 675 ±O. 2g/L，氯化鈣 O. 02 ±O. 005g/L，I %維生素 ΒΙΟ. 2±0· 05ml/L，葡萄糖10±2g/L;或 補料培養基配方為葡萄糖650±50g/L，水解酪蛋白100±10g/L。
9.如權利要求5所述的方法，其特征在于，在發酵前，進行種子培養，種子培養的條件是30°C ±2°C培養12±2小時。
10.如權利要求5所述的方法，其特征在于，培養7±1小時后開始補料，第I小時補料50ml，第2小時補料70ml，第3小時補料100ml，第4小時補料150ml，第5小時補料220ml ；之后開始誘導表達，同時恒速補料，補料速度240ml/小時。
全文摘要
本發明涉及一種采用溫度誘導生產重組人表皮生長因子(hEGF)的方法。本發明將PL啟動子、OmpA信號肽、hEGF基因串聯構建分泌表達質粒，將所述分泌表達質粒轉化原核生產菌株，利用該生產菌株進行hEGF生產。該方法表達效率高、表達周期短。
文檔編號C12N1/21GK102952817SQ201110235048
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月16日 優先權日2011年8月16日
發明者錢悅, 甘人寶, 侯永泰, 吳劍英, 張倩, 周慶瑋, 馮寶山, 丁紅珍, 杜鵬 申請人:上海昊海生物科技股份有限公司