專利名稱：一種基于體細胞核移植構建的牛體細胞克隆胚的處理方法
技術領域：
本發明屬于動物體細胞克隆技術領域，涉及一種基于體細胞核移植構建的牛體細胞克隆胚的處理方法。
背景技術：
體細胞克隆是一項具有巨大研究和商用價值的技術，可應用到治療性克隆，疾病模型，人類器官移植，動物轉基因研究，頻臨滅絕動物品種保護，優良家畜品種擴增等方面。 但至今體細胞克隆效率仍然不高，顯著制約著此技術的廣泛應用。目前認為，克隆效率低下的主要原因是供體體細胞核沒有被受體卵胞質完全的重編程，即重編程失敗或不完全。此重編程過程中沒有涉及基因序列的變化，主要是表觀遺傳修飾的變化。表觀遺傳修飾主要包括組蛋白乙酰化和DNA甲基化兩方面。Oxamflatin是一種表觀遺傳修飾藥物，去組蛋白乙酰化酶的抑制劑；Oxamflatin可以抑制去組蛋白乙酰化酶，從而提高組蛋白乙酰化水平。Oxamflatin已經應用于腫瘤的治療。
發明內容
本發明解決的問題在于提供一種基于體細胞核移植構建的牛體細胞克隆胚的處理方法，在牛體細胞注入去核的卵母細胞并進行電融合之后，對融合后的牛克隆胚用 Oxamflatin進行處理，提高牛體細胞克隆囊胚質量和發育率。本發明是通過以下技術方案來實現一種基于體細胞核移植構建的牛體細胞克隆胚的處理方法，包括以下步驟1)將待移植的牛體細胞注入到去核后的卵母細胞并進行電融合，在電融合后lh， 挑選成功融合的牛體細胞克隆胚進行以下激活處理首先在含5 μ mol/L離子霉素的mSOF 溶液中室溫孵育4min，然后在含2mmol/L 6-DMAP和1 μ mol/L Oxamf latin的mSOF溶液中， 在38. 5°C、5% CO2、飽和濕度條件下培養4h ；所述的mSOF溶液是以SOF培養液作為基礎培養基，還包含有體積分數2%的BME、 體積分數1 %的MEM、體積分數1 %的ITS、lmmol/L的谷氨酰胺、80mg/mL的BSA、100IU/mL 的青霉素和0. lmg/mL的鏈霉素；2)牛體細胞克隆胚在進行激活處理后，轉移到含0. 5 1. Symol/LOxamflatin的 Gl. 3培養液中，在38. 5°C,5% CO2、飽和濕度條件下培養4 12h，再用Gl. 3培養液清洗多次，繼續在Gl. 3培養液中培養至72h ；然后將牛體細胞克隆胚轉移到G2. 3培養液中繼續在 38. 5°C>5% CO2、飽和濕度條件下培養至第7d。所述的牛體細胞克隆胚在進行激活處理或培養時，Oxamflatin的濃度均為 1 μ mol/L，激活處理和培養處理的總體時間為10 12h。所述的作為培養基的Gl. 3培養液上還覆蓋有石蠟油，并預先在(X)2培養箱中平衡至少2h。
所述的Gl. 3培養液中，液滴大小為120 150 μ L，每個液滴中放18 20枚牛體
細胞克隆胚。所述的去核后的卵母細胞的制備為在去核前，卵母細胞先在含有7. 5 μ g/ml細胞松弛素B、10 μ g/ml Hoechst 33342 和體積濃度10% FBS的PBS溶液中孵育15min ；然后在顯微操作儀下，用內徑為20 μ m的去核管吸取第一極體及其周圍的卵胞質，紫外光照射吸出的卵胞質團檢查去核情況；完全去除第一極體及染色體的卵母細胞應用于核移植。所述的牛體細胞注入后的電融合的操作為挑選直徑為15 20 μ m的待移植的牛體細胞，注入到去核的卵母細胞透明帶下； 在進行電融合前，重構體在電融合液中預平衡:3min ；將重構體的供體、作為受體的去核的卵母細胞膜接觸面與兩電極的連線垂直，融合參數為電壓32V、脈沖時為20μ s、2次脈沖間隔 IOms0與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果本發明提供的基于體細胞核移植構建的牛體細胞克隆胚的處理方法，在重構體構建完成后，利用Oxamflatin對重構體進行抑制去組蛋白乙酰化酶的處理，可以顯著提高牛體細胞克隆囊胚的發育率和質量，可高效體外生產牛體細胞克隆胚胎。與不含Oxamflatin的對照組相比，利用1 μ M Oxamflatin處理之后，所得到的囊胚發育率分別為40. 81 士 1. 18%，可顯著提高囊胚的發育率。1 μ M的Oxamflatin處理牛體細胞克隆胚胎1 可以顯著提高囊胚的細胞總數、內細胞團細胞數和ICM TE的比值。 牛體細胞克隆囊胚的細胞總數顯著高于對照組(P <0.05)；囊胚的內細胞團細胞數顯著高于對照組(P < 0. 05)；囊胚的內細胞團細胞數和滋養層細胞數的比值顯著高于對照組(P < 0. 05)。而且，1 μ M的Oxamflatin處理牛體細胞克隆胚胎12h可以顯著降低囊胚的凋亡細胞數。
圖1為利用本發明的處理方法制備的牛體細胞克隆囊胚的顯微視圖；圖2為Oxamflatin處理與對照相比的牛體細胞克隆胚的細胞數顯微分析結果，其中藍色細胞為DAPI染色的囊胚細胞核，表示囊胚細胞總數；紅色細胞為滋養層細胞的免疫染色；合成圖為差異染色顯示結果，粉紅色為滋養層細胞，藍色為內細胞團細胞。圖3為Oxamflatin處理與對照相比的牛體細胞克隆胚的凋亡染色圖。圖4為Oxamf latin處理與對照相比的牛體細胞克隆胚的凋亡柱狀分析結果圖，其中橫坐標表示對照組(n = 16)和Oxamflatin處理組(n = 20)，縱坐標表示每個囊胚上的凋亡細胞數，每個菱形表示一個囊胚。
具體實施例方式本發明提供的基于體細胞核移植構建的牛體細胞克隆胚的處理方法，在重構體構建完成后，利用Oxamflatin對重構體進行抑制去組蛋白乙酰化酶的處理，可以顯著提高牛體細胞克隆囊胚的發育率和質量，可高效體外生產牛體細胞克隆胚胎。下面結合具體的操作過程和對比分析結果對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。首先給出以下試劑和培養液/處理液的來源或制備(^311^13^11、01^0、胰蛋白酶3014、青霉素、鏈霉素、無機鹽、石蠟油為sigma公司產品，DMEM/F12液體培養基和特級胎牛血清(FBS)為Giboco產品，胚胎培養液Gl. 3、G2. 3 均購買于vitrolife公司。其他未標明的均為sigma公司產品。a、卵母細胞體外成熟培養液成熟培養液為TCM199 液中添加 2. 2mg/mL NaHC03、0. 075IU/mLHMG、1 μ g/mL 17 β -E2,0. 33mM丙酮酸鈉、2mM L-谷氨酰胺以及100IU/mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素。b、mS0F 溶液mSOF溶液是以SOF培養液作為基礎培養基，還包含有體積分數2 %的BME、體積分數1 %的MEM、體積分數1 %的ITS、lmmol/L的谷氨酰胺、80mg/mL的BSA、100IU/mL的青霉素和0. lmg/mL的鏈霉素；C、電融合液電融合液的組成為0. 3mol/L甘露醇、0.05mol/L氯化鈣、0. lmol/L硫酸鎂、 0. 27mol/L 組氨酸、0. 1% BSA。d、Oxamflatin儲存液和工作液體的配置i) Oxamflatin 儲存液濃度 IOmM 稱取Img Oxamflatin于滅菌的1. 5ml離心管中，加入291 μ L DMSO后混勻，儲存于-20°C冰箱待用。ii) Oxamflatin 工作液濃度為 1 μ M 首先配成濃度為100 μ M 用移液槍取990 μ L mSOF于滅菌的的1. 5ml離心管中， 然后添加10 μ L濃度為IOmM的Oxamflatin儲存液，混勻。工作液取1 μ L濃度為100 μ M的Oxamflatin液體，分別加入到99 μ L胚胎激活液(含有1. 9mM 6-DMAP的mSOF)中和99 μ L胚胎培養液Gl. 3中。Oxamflatin工作液可放于4°C，一周內使用。下面給出體細胞核移植技術生產牛克隆胚胎的制備a.牛胎兒成纖維細胞的培養從液氮中取一管荷斯坦奶牛的2-5代的牛胎兒成纖維細胞于38°C解凍，加0. 8ml 的DMEM(Dulbecco' s Modified Eagle Media)細胞培養液離心，棄上清，加細胞培養液重懸，取3ml細胞懸浮液接種于直徑6cm的培養皿中，置于(X)2培養箱中38. 5°C條件下培養。待牛胎兒成纖維細胞達到80%匯合時，吸棄培養液，用無Ca2+、Mg2+的PBS沖洗細胞，加入胰酶與EDTA混合消化液，消化細胞。在倒置顯微鏡下觀察細胞，待大多數細胞回縮、變圓、細胞間隙擴大時，用含10%胎牛血清的DMEM細胞培養液終止消化，用移液器吹打后，離心收集，懸浮，按1 3的比例接種于M孔板，放入CO2培養箱中培養。b.卵母細胞的成熟培養牛卵巢采自陜西省西安市三橋定點屠宰場，將卵巢置于含青、鏈霉素的20 25°C 的生理鹽水保溫瓶中，5h以內運回試驗室。卵巢運回后，用滅菌剪刀剪除卵巢表面的結締組織、脂肪和附著的輸卵管，在高壓過的無菌生理鹽水中清洗三次，用裝有12G針頭的IOmL 注射器抽取卵巢表面2 8mm卵泡中的卵母細胞，放入6cm玻璃皿中在實體顯微鏡下收集卵丘-卵母細胞復合體(cumulus-oocyte complexes，COCs)。收集后在含5 15%血清的 PBS中清洗三遍。選擇形態正常的A、B級卵母細胞用于體外成熟培養。A級卵母細胞為胞質均勻、卵丘細胞致密、最少有5層卵丘細胞完全包裹的卵母細胞；B級卵母細胞的卵丘細胞為2 4層，基本上包裹卵母細胞。將采集的COCs在成熟液中洗兩遍，然后移入裝有3毫升成熟液的3cm平皿中(提前在培養箱平衡一小時)，在38. 5°C,5% CO2、飽和濕度條件下培養對-2他。將培養成熟的卵母細胞用PBS液清洗3次，放入含0. 透明質酸酶的無Ca2+、Mg2+ PBS中消化1-aiiin，并用IOOOml移液槍反復吹打COCs，以除去卵母細胞外擴散的卵丘細胞。吹打干凈后，在PBS 中洗3次，然后在實體視顯微鏡下，以異物針撥動卵母細胞挑選有極體的卵母細胞待用。c.牛體細胞克隆胚的構建去核去核前卵母細胞先在含7. 5μ g/ml細胞松弛素Β、10μ g/ml Hoechst 33342和 10% FBS的PBS中孵育15min。在顯微操儀下，用內徑為20 μ m的去核管吸取第一極體及其周圍的部分卵胞質，紫外光照射吸出的卵胞質團檢查去核情況。完全去除第一極體及染色體的卵母細胞被用于核移植。注核和電融合注核時挑選直徑為15 20 μ m的細胞注入去核的卵母細胞透明帶下。注核后的重組體采用微電極的方法進行融合。融合前，重構體在電融合液中預平衡3min，電融合在 150倍的顯微操作儀下進行。用于融合操作的兩根“Z”字形微電極頂端直徑為15 μ m，后端連于顯微操作儀上，使重組體的供體、受體細胞膜接觸面與兩電極的連線垂直，融合參數為電壓32V、脈沖時長20 μ S、2次脈沖間隔10ms。融合后Ih在顯微鏡下觀察融合情況。d、牛體細胞克隆胚融合后的處理為了檢測Oxamflatin的處理效果，同時設不加Oxamflatin的對照組，其余操作方法相同。處理組分別在含有2mmol/L 6-DMAP的mSOF中添加1 μ M的Oxamflatin，以及在 Gl. 3中添加1 μ M的Oxamflatin。對照組不加。牛體細胞克隆胚的激活在電融合之后1 2h，挑選成功融合的牛體細胞克隆胚進行以下激活處理(用離子霉素(Ionomycin)聯合6-DMAP激活)首先在含2 5 μ mol/L離子霉素的mSOF溶液中室溫孵育4min，然后在含1 2mmol/L 6-DMAP和1 μ mol/L Oxamflatin的mSOF溶液中，在 38. 5°C>5% CO2、飽和濕度條件下培養4h。牛克隆胚的體外培養牛體細胞克隆胚在進行激活處理后，轉移到含1 μ mol/L Oxamflatin的Gl. 3培養液中，在38. 5°C、5% CO2、飽和濕度條件下培養8h，Gl. 3培養液中，液滴大小為120 150 μ L，每個液滴中放18 20枚牛體細胞克隆胚；再用Gl. 3培養液清洗多次，繼續在Gl. 3 培養液中培養至72h ；然后將牛體細胞克隆胚轉移到G2. 3培養液中繼續在38. 5°C,5% CO2, 飽和濕度條件下培養。所述的作為培養基的Gl. 3培養液上還覆蓋有石蠟油(Sigma，M8410)，并預先在 CO2培養箱中平衡至少池。
對照組用不加Oxamflatin的Gl. 3培養液進行培養。培養4 后記錄卵裂數，第 7d記錄囊胚發育情況。如圖1所示的牛體細胞克隆囊胚的顯微視圖，為體外培養后7d的顯示結果。與對照組相比，利用Oxamflatin對重構體進行處理后，可以顯著提高牛體細胞克隆囊胚的發育率和質量，可高效體外生產牛體細胞克隆胚胎。具體表現為1)牛體細胞克隆囊胚的發育率如表1所述的不同濃度的Oxamflatin對牛體細胞克隆胚胎發育的影響，可以看出 ΙμΜ濃度處理牛體細胞克隆胚胎12個小時，可顯著提高囊胚的發育率00.81 士 1. 18% VS 30. 34士0. 83%, P < 0. 05)。表1.不同濃度的Oxamflatin對牛體細胞克隆胚胎發育的影響
權利要求
1.一種基于體細胞核移植構建的牛體細胞克隆胚的處理方法，其特征在于，包括以下步驟1)將待移植的牛體細胞注入到去核后的卵母細胞并進行電融合，在電融合后lh，挑選成功融合的牛體細胞克隆胚進行以下激活處理首先在含5 μ mol/L離子霉素的mSOF溶液中室溫孵育4min，然后在含2mmol/L 6-DMAP和1 μ mol/L Oxamf latin的mSOF溶液中，在 38. 5°C>5% CO2、飽和濕度條件下培養4h ；所述的mSOF溶液是以SOF培養液作為基礎培養基，還包含有體積分數2%的BME、體積分數1 %的MEM、體積分數1 %的ITS、lmmol/L的谷氨酰胺、80mg/mL的BSA、100IU/mL的青霉素和0. lmg/mL的鏈霉素；2)牛體細胞克隆胚在進行激活處理后，轉移到含0.5 LSymol/LOxamflatin的 Gl. 3培養液中，在38. 5°C,5% CO2、飽和濕度條件下培養4 12h，再用Gl. 3培養液清洗多次，繼續在Gl. 3培養液中培養至72h ；然后將牛體細胞克隆胚轉移到G2. 3培養液中繼續在 38. 5°C>5% CO2、飽和濕度條件下培養至第7d。
2.如權利要求1所述的基于體細胞核移植構建的牛體細胞克隆胚的處理方法，其特征在于，所述的牛體細胞克隆胚在進行激活處理或培養時，Oxamflatin的濃度均為1 μ mol/ L，激活處理和培養處理的總體時間為10 12h。
3.如權利要求1所述的基于體細胞核移植構建的牛體細胞克隆胚的處理方法，其特征在于，所述的作為培養基的Gl. 3培養液上還覆蓋有石蠟油，并預先在CO2培養箱中平衡至少2h。
4.如權利要求1所述的基于體細胞核移植構建的牛體細胞克隆胚的處理方法，其特征在于，所述的Gl. 3培養液中，液滴大小為120 150 μ L，每個液滴中放18 20枚牛體細胞克隆胚。
5.如權利要求1所述的基于體細胞核移植構建的牛體細胞克隆胚的處理方法，其特征在于，所述的去核后的卵母細胞的制備為在去核前，卵母細胞先在含有7. 5 μ g/ml細胞松弛素B、10 μ g/ml Hoechst 33342和體積濃度10% FBS的PBS溶液中孵育15min ；然后在顯微操儀下，用內徑為20 μ m的去核管吸取第一極體及其周圍的卵胞質，紫外光照射吸出的卵胞質團檢查去核情況；完全去除第一極體及染色體的卵母細胞應用于核移植。
6.如權利要求1所述的基于體細胞核移植構建的牛體細胞克隆胚的處理方法，其特征在于，所述的牛體細胞注入后的電融合的操作為挑選直徑為15 20 μ m的待移植的牛體細胞，注入到去核的卵母細胞透明帶下；在進行電融合前，重構體在電融合液中預平衡aiiin;將重構體的供體、作為受體的去核的卵母細胞膜接觸面與兩電極的連線垂直，融合參數為電壓32V、脈沖時為20 μ s、2次脈沖間隔 IOms0
全文摘要
本發明公開了一種基于體細胞核移植構建的牛體細胞克隆胚的處理方法，將待移植的牛體細胞注入到去核后的卵母細胞并進行電融合，在電融合之后1h，挑選成功融合的牛體細胞克隆胚用1μM的Oxamflatin處理牛體細胞克隆胚胎12h，可以顯著提高牛體細胞克隆囊胚的發育率和質量，可高效體外生產牛體細胞克隆胚胎。
文檔編號C12N15/877GK102296090SQ20111024984
公開日2011年12月28日 申請日期2011年8月29日 優先權日2011年8月29日
發明者張涌, 王勇勝, 蘇建民 申請人:西北農林科技大學