專利名稱：一種抗水稻稻曲病的青霉菌及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及水稻稻曲病菌[Ustilaginoidea virens(Cke)Tak]的微生物防治，更具體涉及一株對水稻稻曲病菌具有拮抗作用的產黃青霉菌(Penicillium chrysogenum), 同時還涉及該菌的制備方法，還涉及該菌的用途。該株青霉菌屬真菌，能抑制稻曲病菌孢子的萌發和菌絲生長，其抑菌活性物主要是分子量小于3500Da的小分子多肽或其衍生物。該菌株的發酵液對稻曲病菌具有較強的抑制活性，且具有較好的貯存穩定性、酸堿和溫度耐受性，動物毒性實驗表明，該菌發酵上清液對實驗大鼠不具有明顯毒性，屬于微毒級，因此該菌株可以用于生產防治水稻稻曲病的微生物殺菌劑。
背景技術：
微生物殺菌劑是指微生物及其代謝產物以及由它們加工而成的具有抑制植物病害的生物活性物質。微生物殺菌劑主要抑制病原菌生長繁殖、干擾生物合成和破壞細胞結構。微生物殺菌劑主要有農用抗生素、細菌殺菌劑、真菌殺菌劑、病毒殺菌劑等類型(干旱環境監測，2008，22 ) =236-242 ；生物農藥[M],北京化學工業出版社，2000 ；世界農藥， 2001,23(1) 1-6)。長期以來，我國農作物的病蟲害防治主要依賴化學農藥，導致農藥污染成為世界上最嚴重的國家之一，食品中農藥檢出率高達90%以上，嚴重危害廣大消費者的生命健康， 同時也使我國農產品出口頻頻遭遇國外的"綠色堡壘"，嚴重影響我國現代農業產業的發展，農藥污染成為糧食安全生產中急需解決的難題。相比化學農藥，微生物農藥具有安全、 環保、長效、無殘留等優點，注重低毒、高效、選擇性強，成為當前的研究熱點之一。水稻稻曲病是由稻曲病菌[Ustilaginoidea virens(Cke)Tak]引起的水稻穗部真菌性病害，該病害在世界水稻產區都有發生，亞洲、歐洲、美洲和非洲都有稻曲病嚴重爆發的報道(Plant Protection，1989,43 :311-314)。近年來，隨著優質雜交水稻的推廣和大面積種植，生產上常用的水稻品種普遍生育期延長，對肥水要求提高，在產量提高的同時，也為稻曲病的發生流行創造了有利條件，稻曲病的發生也逐年加重，已成為水稻主產區影響產量和品質的重要因素。水稻稻曲病的發生和分布較為廣泛，早在1972年，在中國、日本、菲律賓、美國、巴西、澳大利亞、埃及、英國等五大洲40多個國家報道有稻曲病的發生。Chib. H.和 Sing. S (1992)報道了印度發生稻曲病的情況 Qndian J Mycol. PI. Patbol，1992，22 (3) 278-280)。20世紀50、60年代，稻曲病在我國局部稻區零星或嚴重發生，70年代以后，隨著雜交稻大面積推廣和施用氮肥水平的提高，導致該病較大面積的流行。1982年湖南省稻曲病嚴重發生，發病面積達666666. 7hm2，1984年遼寧省稻曲病發病面積超過20萬hm2，占全省種植面積的43%，病穗率一般為5% -10%。2004年，湖南省中晚稻稻曲病情比較嚴重， 尤以中稻發生最為嚴重，發生面積達63. 3hm2，損失稻谷1. 37億kg，直接經濟損失約2億元 (中國植保導刊，2005，25 (8) :14-15)。稻曲病不僅嚴重影響水稻產量，更嚴重的是稻曲病菌可以產生一類環肽類毒素——稻曲菌素，直接影響水稻的食用安全性。稻曲菌素能夠抑制真核生物微管蛋白的組裝與細胞骨架的形成，繼而抑制細胞有絲分裂，從而表現出明顯的細胞毒性，對動物和植物產生毒害作用(J Antibiot (Tokyo)，1994，47 (7) :765-773)。稻曲病菌可以產生至少6 種毒素(Ustiloxin A-F)，目前，這6種毒素的結構已經被分析出來，它們都是含有13個環心和一個手性的叔-烷基-芳香基-乙醚鍵結構的多肽(JAm Chem Soc, 2008，130 (7) 2351-2364 ；Biochemical pharmacology,1995,49(10) :1367-1372)。Nakamurak 等報道， 稻曲病谷粒對老鼠有毒性，可引起其心臟、腎臟的病變(Proceedings of the Japanese Association of Mycotoxicology, 1992,35 41-43)。據黃世文研究報道，用稻曲病粒拌飼料喂家兔、白洛克小公雞和當地母雞，經35-84天喂飼，可引起實驗動物的死亡和心、肝、肺等內臟器官病變，致死量為每克體重每日進食稻曲病谷0. 14-0. 17粒。用帶稻曲病菌的谷糠喂豬，母豬出現產死胎、干尸胎和畸形胎等(江西農業學報，2002，14 O) :45-51)。季宏平報道，水稻稻曲病隨著每穗稻曲球數增加，每穗實粒數、實粒重下降，而秕谷率逐漸上升，此病不僅毀掉有病子粒，而且還消耗整個病穗及植株的營養，使病穗上的其它子粒不飽滿，造成水稻產量嚴重損失(黑龍江收業科學，2000，(4) :18-19)。水稻稻曲病的發生和病情與多種因素有關，其中主要包括水稻品種、施肥水平、栽培技術管理技術及氣候條件等。在農業生產中，人們針對這些方面有計劃地采取相關措施， 以減輕稻曲病的危害。例如，鏟除菌源，將病殘體清除出稻田；選用相對抗病性強的水稻品種；合理密植，這樣不但能起到防病增產的作用，而且便于施藥施肥等栽培管理；選用恰當的施肥技術，合理配方施肥，不過多使用氮肥，避免后期氮肥用量過多造成水稻貪青晚熟； 加強水漿管理，采取淺水勤灌。選用適量的化學農藥是目前最主要的防治措施。目前生產中使用的藥劑很多，例如20%瘟曲克星、30%愛苗、30%稻病寧、35%苯乙錫酮、酮氧亞銅WP等。使用化學藥劑噴灑，用藥時間的選擇非常關鍵。根據天氣預報情況，如果破口期前后陰雨天氣多，一般于水稻破口前1 10d，在無雨的天氣，孕穗中期和孕穗末期各施1次藥劑(農業裝備技術， 2002,106(4) :17-18) 0化學農藥的使用在一定程度上減輕了稻曲病的病情，但由于目前還沒有研發出專一性強的特效化學藥劑，所以稻曲病的危害依然非常嚴重。同時，化學農藥對生態環境污染嚴重，易殘留在谷物中，對人類生命健康也有極大的威脅，許多國家紛紛禁止一些劇毒化學農藥的使用，這就呼吁人們尋找更高效，更環保的防治方式。采用對稻曲病菌有拮抗作用的拮抗微生物制劑防治稻曲病，是目前的研究熱點之一，目前已開發出相應劑型應用于實際生產中，如紋曲寧(四川農業科技，2006(5) :39)。紋曲寧是由枯草芽孢桿菌與井R霉素進行復配而成的微生物農藥，這種復配農藥不僅能發揮井岡霉素殺菌速度快，防效穩定地優勢，同時保持了枯草芽孢桿菌能定植于水稻根周圍， 分泌抗生素及誘導水稻產生抗病性等特點，達到兩藥優勢互補、用量減少、防效提高的目的。紋曲寧殺菌劑持續期長、無毒無殘留，不污染環境，是理想的農藥品種。雖然目前使用紋曲寧防治稻曲病取得了一定的經濟效益和生態效益，但紋曲寧中的井R霉素只是水稻紋枯病菌的高效殺菌劑，對稻曲病菌的防效欠佳；而枯草芽孢桿菌雖然對多種植物病原菌有抑制作用，同樣對稻曲病菌殺菌效果不強。鑒于生物農藥多方面的優點，迫切需要尋找更加高效的對稻曲病菌具有防治作用的生物農藥。微生物殺菌劑主要包括農用抗生素、活體殺菌劑以及以微生物代謝產物為基礎，由此衍生而出的化學殺菌劑。 農用抗生素是微生物在代謝過程中產生的次級代謝產物，在一定濃度時能夠抑制或殺滅病原微生物。目前，有許多種類的農用抗生素已應用于水稻、蔬菜、水果的真菌病害防治。在農用抗生素研制方面，日本走在世界的前列。1961年，日本最先將殺稻瘟菌素S應用于水稻稻瘟病的防治，取代了以往依靠有機汞防治稻瘟病方法。繼殺稻瘟菌素S之后，日本又相繼研發出了春雷霉素、多氧霉素、有效霉素等一系列的農用抗菌劑。據統計，1988年總計發現了約8000種抗生素，其中約43%是由日本學 者發現的。殺稻瘟菌素(Blasticidin S)是第一個用于防治水稻稻瘟病的微生物殺菌劑，它是一種核苷類抗生素，是鏈霉菌在代謝過程中產生的次級代謝產物，能夠顯著地抑制病原菌菌絲生長和孢子萌發。據報道，每公頃稻田噴灑10-30克殺稻瘟菌素，能夠有效地抑制稻瘟病害(Crop Protection Agents from Nature :Natural Products and Analogues, Cambridge, UK, Royal Soc Chem,1996, 27)。由于殺稻瘟菌素中含有芐氨基磺酸結構，其對一些種類的農作物，例如葡萄、西紅柿、 馬鈴薯具有一定的毒害性，但該結構的存在與否對殺稻瘟菌素的殺菌活性并沒有影響，因此，在工業生產中，常制成滅瘟素的硫酯鹽和月桂酸硫酸鹽，可以在一定程度上減小其對植物的毒害性。由于殺稻瘟菌素對植物的毒性及對哺乳動物具有一定的副作用，這種殺菌劑在市場上逐漸被其它產品，如春雷霉素所取代。春雷霉素(Kasugamycin)是一種從 Streptomyces kasugaensisa 禾口 Streptomyces kasugaspinus 白勺代Hi產物中分離得至Ij 的氨基-糖類化合物(Journal of Antibiot，1965，18 104)。春雷霉素可以顯著地抑制稻瘟病菌菌絲的生長，在田間試驗中，使用低于20ug/ml的有效濃度可以較好的防治稻瘟病；使用2%春雷霉素水溶液浸泡水稻種子，可以有效地較少稻瘟病的發生(Journal of Antibiot, 1965,18 115-119 ；British Crop Protection Council, 1994)。Umezawa 等報道，春雷霉素對植株無毒害作用，并且對哺乳動物和魚類毒性也較小，因此是一種良好的抗菌劑(Journal of Antibiot，1965，18 101-103)。但是，春雷霉素最大的缺點是其導致病原菌抗性問題非常嚴重，在稻田中使用數年后，會導致許多抗性菌株的產生(Pest Manag Sci, 2000, 56 :651-676)。為了解決這一問題，目前農業生產中將春雷霉素與化學合成的殺菌劑制成復配試劑后再噴灑于農田。多氧霉素(Polyoxins)是由Sti^ptomyces cacaoi var. asoensis發酵產生的一類肽嘧啶核苷類抗生素，對小麥白粉病、黃瓜霜霉病、甜菜褐斑病、水稻紋枯病等多種植物真菌性病害具有良好的防治效果，并且能夠刺激植物的生長。多氧霉素可以選擇性抑制敏感病原真菌幾丁質細胞壁的形成，而對不含有幾丁質壁的生物沒有作用，因此其對植物、牲畜及魚類不表現出明顯的毒性(Biochem Biophys Res Commun, 1969，37 :718-722)。多氧霉素包含A-N14種不同的同系物，不同的同系物作用于特異的對象，其中的polyoxin B和polyoxin L對梨黑斑病和由鏈格孢霉菌導致的蘋果木栓樣斑病具有良好的防治效果，而polyoxin D常用來防治由立枯絲核菌引起的水稻紋枯病。有效霉素(Validamycin A)是由Str印tomyces hygroscopicus產生的一種氨基糖苷類抗生素,具有較強的內吸性，已被敏感菌體細胞吸收并在其內迅速傳導。有效霉素能強烈抑制菌體細胞內海藻糖酶的活性，因此可導致某些種類菌體細胞的生長和發育受到抑制，而哺乳動物細胞的生長、發育并不依賴海藻糖的水解，故其對人類是安全的。實驗證明，有效霉素對立枯絲核菌具有良好的抑制作用，而不能很好抑制其它種類的真菌和細菌的生長，因此在生產中，主要用來防治水稻紋枯病(Rev Plant Protec Res，1975，8 :81_92)。有效霉素可以被土壤中假單孢菌屬的一些細菌分解為葡萄糖和井岡胺(Journal of Antibiot, 1975, 28 298-306)，同時也可以被動物腸道內的一些細菌分解，從而排除體外，因此有效霉素被認為是比較理想的環境友好型殺菌劑。由于農用抗生素在植物病菌防治方面的良好應用前景，我國在20世紀50年代，國家開始重視此類研究，20世紀70年代以后，隨著經濟的發展，國家的投入也大幅增長，農用抗生素的研制取得了較大的突破，目前我國研制成功并在生產中大規模推廣應用的主要產品有井R霉素、武夷霉素、慶豐霉素、多氧霉素、農抗120等品種。其中，商品化應用最為成功的是井R霉素，近10年來，我國井R霉素年產量不斷增長，對我國的水稻生產做出了較大的貢獻。井R霉素是上海農藥所在中國井R山地區土壤中分離得到的吸水鏈霉菌井岡變禾中(S. hygroscopicus var jinggangensis yen)產生的一禾中氛基糖昔類抗生素，對水稻紋枯病防治效果極佳。井R霉素具有較強的內吸性，能迅速被立枯絲核菌菌絲吸收并在體內傳導，一般每667m2用藥3-5g可達到較好的防治效果，并且如果用藥時間恰當，整個水稻生育期用藥一次就可達到防治效果。由于井網霉素的作用機制并不是殺死病原菌，而只是影響病原菌的致病力，因此，到目前為止基本沒有發現病原菌抗性的產生。武夷霉素是由中國農科院植物保護研究所從福建省武夷山地區分離的一株不吸水鏈霉菌武夷變種 (Streptomyces hygroscopicus var wuyiens) itlMr^^^MUM^J^MU^W^MM. 合物。對革蘭氏陰性菌和一些種類的病原真菌具有良好的抑制作用，尤其在蔬菜的真菌病害防治中效果突出。農抗120是刺孢吸水鏈霉菌北京變種(Sti^ptomyces hygrospinosus var.beijingensis)產生的一類嘧啶核苷類抗菌素，這種抗菌素抗菌譜廣，對多種作物病害，如枯萎病、紋枯病、白粉病等具有很好的防效。進入植物體內后，可以阻礙病原菌蛋白質的合成，達到抗病的效果。同時，它可以提高作物的抗病能力和免疫能力，可以有效地減少病害的發生。隨著人們環保意識的不斷增強，農用抗生素的應用也越來越廣泛，在目前的農用抗生素研究工作中，人們除了繼續篩選新的種類的農用抗生素，利用物理化學方法對產生菌進行誘變，提高其發酵產量外，還利用現代分子生物學手段，在分子水平上對產生菌進行基因改造，提高其發酵水平，降低生產成本。活體微生物殺菌劑的研制在過去取得了極大的進展，被用作研究的活體微生物既有細菌，也有真菌和放線菌。由于細菌的種類多，數量大，繁殖速度快，因此細菌微生物殺菌劑的研究具有廣泛的前景。目前用于生防的細菌以芽孢桿菌為主，主要有枯草芽孢桿菌、 解淀粉芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、地衣芽胞桿菌、巨大芽孢桿菌等(Biosci Bioeng, 2000, 89(6) =515-521) 0芽孢桿菌在自然界中廣泛存在，對人畜無害，不會污染環境，同時對多種植物病原菌具有抑制效果，因此是一種比較理想的生物制劑(Plant Dis Reptr, 1970, 54 446-448，Can Bot, 1984,62 :1032-1035 ；Plant Disease，1985，69 :770-775)。國內研制成功并在生產中投入使用的有紋曲寧、百抗等。其中微生物農藥百抗(10億個/g活枯草芽孢桿菌可濕性粉劑)是由云南農業大學和中國農業大學共同研制，并獲得農業部登記注冊， 目前已在多個省份推廣使用，主要防治水稻紋枯病、煙草黑脛病，其抑菌機制主要是營養競爭作用。從苜蓿根際周圍的分離得到的蠟質芽孢桿菌UQ85，對苜蓿猝倒病防效良好，經過田間試驗證明，其對大多猝倒病和根腐病有良好的防效，現已被美國登記作為生物農藥，用于種子的處理(FEMS Microbiolo Lett, 1999,171 :1_9)。用于防治植物病害的真菌制劑不多，木霉菌(Trichoderma spp.)是目前研究和應用最廣泛的一種植病生防制劑。例如哈茨木霉(T.harzianum)對立枯病、菌核病、腐霉病、灰霉病等多種植物病害有較好的防效(European J of Plant Patholo，1999，105 177-189)。鏈孢粘帚霉(Gliocladium catenulatum)主要 用于防治土壤里的腐霉菌和絲核菌(J Phytopatholo，2001，149 :171-178.)。目前，此類制劑商品化生產的較少，其應用有待于進一步的研究。目前已發現的抗生素中，絕大部分是從放線菌中獲得的，人們對其研究也較為深入。除了利用其代謝產物進行植物病害防治外，人們也推出了相應的放線菌活體生物殺菌齊[J，例如1989年Kemica開發的放線菌生物殺菌劑Str印tomycesgriseovirdis，商品名為 Mycostop，主要用于觀賞植物和溫室蔬菜上的鐮刀菌。20世紀末，隨看海洋生物技術及先進米樣手段的發展，人們陸陸續續從海洋中篩選到一些具有抗菌活性的新型化合物。從我國深圳近海紅樹林上分離獲得了一株海洋真菌Hypoxylon oceanicum LL215G256，其代謝產物中存在一種脂肽類抗菌物質 15G256 γ，能夠抑制真菌細胞壁的合成，并且其作用位點與一般脂肽不同，其對子囊菌綱、 擔子菌綱、半知菌綱的植物病原菌具有一定的抑制作用(JAntibiot (Tokyo)，1998，51 (3) 317-322)。從海洋真菌Hypoxylon oceanicum的培養液中分離得到了 3種新的脂肪縮酚肽LL-15G256、γ⑶、δ (9)、ε (10)，它們均具有良好的抗真菌活性(J Antibiot(Tokyo), 1998,51(3) :303-316)。從海洋真菌Fusarium sp. FH-146中分離得到含有吡喃酮環的3 個新白勺聚Sll化合物 neofusapyrone> fusapyrone> deoxyfusapyrone, X^t Botrytis cinerea, Aspergillus parasiticus 顯示較強的抗真菌活性(J Antibiot (Tokyo)，2006，59 (11) 704-709)。 /入 Kuril colonial ascidiumHumicola fuscoatra (Traaen) KMM4629中獲得了 1個新的屬于石竹烯系列的倍半萜烯fuscoatra A，它能夠抑制葡萄球菌 Staphylococcus aureus 禾口IfBacillus subtilis 白勺生^禾口MM (尺ussian Chemical Bulletin, International Edition,2004,53(11) :2643_2646.)。中科院沈陽應用與生態研究所從海洋中分離得到一株Bacillus amyloliquefaciensSH-ΒΙΟ,利用酸沉淀和半制備HPLC從中分離得到兩種抗真菌的脂肽類物質。通過Q-TOF質譜鑒定，兩種脂肽均為C16 fengycin A，這種抗菌物質是一種新類型的fengcin，在多肽鏈的6號位上含有一個氨基丁酸。通過瓊脂擴散法生測顯示，這兩種脂月太對 5 禾中植物病原真菌 Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum, Fusarium graminearum, F. oxysporum f. sp. vasinfectum, F. oxysporum f. sp. cucumis melo L 禾口 F. graminearum f. sp. zea mays L具有顯著的抑制效果(Bioresource Technology, 2010,101 :8822_8827)。
發明內容
本發明的目的是在于提供了一種抗水稻稻曲病的青霉菌，該青霉菌對水稻稻曲病菌具有拮抗作用。該青霉菌能抑制稻曲病菌孢子的萌發和菌絲生長，其發酵液對稻曲病具有較強的抑制活性。本發明的另一個目的是在于提供了一種抗水稻稻曲病的青霉菌AF-25在制備防治或預防水稻稻曲病的生物農藥中的應用，用該真菌的發酵液，能有效地抑制稻曲病菌孢子的萌發和菌絲生長。為了實現上述目的，本發明采用以下技術措施青霉菌屬(Penicillium)真菌KF-25是一株由本實驗室從中國土壤樣品中分離、 并以稻曲病菌為拮抗對象，采用瓊脂擴散法中的牛津杯法(Appl Microbiol Biotechnol, 2010,86 :535-543.)，經過觀測抑菌圈而篩選出來的對水稻稻曲病菌具有明顯抑制作用的真菌菌株。根據分離該菌株的土壤樣品序列號，并加上抗真菌(Antifimgus)的英文幾簡寫 AF，將該菌株命名為產黃青霉菌 AF-25 (Penicillium chrysogenum AF-25，CCTCC N0: M 2011309)，該菌株已保藏，保藏單位中國典型微生物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學，保藏日期2011年9月9日，保藏編號CCTCC NO :M2011309，分類命名產黃青霉 AF-25PeniciIlium chrysogenum AF-25 基本的技術原理是通過彈土法，在PDA培養基 (馬鈴薯葡萄糖培養基)中分離土壤樣品中的真菌，將這些分離的真菌接種在PS(馬鈴薯蔗糖培養液)中培養，28°c，180rpm，恒溫振蕩培養96h。收集發酵液，使用濾紙過濾去除菌絲，10000rpm，4°C離心20min ；收集離心后上清液通過0. 22 μ m濾膜過濾除菌，得到無菌上清液，4°C保存待用。取150 μ 1稻曲病菌分生孢子懸液均勻涂布在PSA(馬鈴薯蔗糖培養基)平板(60mm)表面，在每個平板中央輕輕放置1個無菌牛津杯(6mmX8mmX 10mm)，待牛津杯自然沉降10分鐘后，往每個牛津杯中加入200 μ 1上述所制備的無菌上清液樣品，然后將平板置入培養箱中，280C，黑暗培養7d后，測量各個樣品的抑菌圈直徑。篩選到對稻曲病菌抑制效果最好的真菌菌株AF-25。一種抗水稻稻曲病的青霉菌的制備方法，其步驟是A、稻曲病菌分離從海南省水稻田中采取患稻曲病的水稻病穗，采用厚垣孢子懸液法分離稻曲病菌。所用的培養基為含氯霉素(50yg/ml)的脅本哲式培養基(馬鈴薯 300g、蛋白胨 5g、蔗糖 15g、Ca(NO3)2 · 4H20 0. 5g、Na2HPO4 · 12H202. 0g、瓊脂 16g、蒸餾水 1000ml)。具體操作步驟用75% (質量/體積)乙醇將稻曲球消毒5_10s，用無菌水沖洗 2-5次，然后置于離心管中加入無菌水振蕩配置成厚垣孢子懸浮液，取100 μ 1滴加在無菌培養皿中，待培養基冷卻至44-46°C時，每100ml培養基中加入5mg氯霉素，然后倒入培養皿中，輕輕搖動使之與孢子懸浮液混合均勻。待培養基凝固后置于恒溫箱中，黑暗條件下培養，逐日觀察分離結果。將分離的稻曲病菌接種到馬鈴薯蔗糖培養液(PS)中，28°C， ISOrpm振蕩培養5天后，培養液中即可產生大量分生孢子。用2層紗布過濾去除菌絲，將過濾液5000rpm離心15min，沉淀物即為稻曲病菌分生孢子，使用無菌水洗滌分生孢子3遍，最終溶解在無菌水中，利用稀釋平板計數法，調節其終濃度為IO8孢子/ml，4°C保存待用。該馬鈴薯蔗糖培養液(PQ的組成為20%馬鈴薯煮汁(重量/體積)，2%蔗糖(重量/體積)， ρΗ6· 0。B、稻曲病菌拮抗菌分離與培養將土壤樣品碾細，大約5克樣品置于無菌培養皿中，倒入33-37°C的PDA培養基，在下培養5_7天，分離真菌單菌落。該PDA培養基的組成為20%馬鈴薯煮汁(重量/體積)，2%葡萄糖(重量/體積)，ρΗ6·0。將分離的真菌菌株接種在PS (馬鈴薯蔗糖培養液)中，28°C，180rpm，恒溫振蕩培養96h。收集發酵液，使用濾紙過濾去除菌絲，IOOOOrpm, 4°C離心20min ；收集離心后上清液通過0. 22 μ m濾膜過濾除菌，得到無菌上清液，4°C保存待用。該PS培養基的組成為20%馬鈴薯煮汁(重量/體積)，2%蔗糖(重量/體積)，ρΗ6· 0。
C、稻曲病菌拮抗菌篩選取150μ 1稻曲病菌分生孢子懸液均勻涂布在 PSA(馬鈴薯蔗糖培養基)平板(60mm)表面，在每個平板中央輕輕放置1個無菌牛津杯(6mmX8mmX10mm)，待牛津杯自然沉降10分鐘后，往每個牛津杯中加入2001上述所制備的無菌上清液樣品，然后將平板置入培養箱中二8°C，黑暗培養7d后，測量各個樣品的抑菌圈直徑，篩選到對稻曲病菌抑制效果最好的真菌菌株，根據分離該菌株的土壤樣品序列號，并加上抗真菌(Antifimgus)的英文幾簡寫AF，將該菌株命名為產黃青霉菌 AF-25 (Penicillium chrysogenum AF-25，CCTCC NO :M 2011309)。該 PSA 培養基組成為 20 %馬鈴薯煮汁(重量/體積)，2 %蔗糖(重量/體積)，1 · 5 %瓊脂(重量/體積)，ρΗ6· 0。 獲得了一種抗水稻稻曲病的青霉菌AF-25。一種青霉菌AF-25在制備防治或預防稻曲病生物農藥中的應用，其應用基本過程是分別在PSA 培養基加入 2ml，Iml，0. 5ml，0. 33ml，0. 25ml，0. 2ml 青霉菌 AF-25 無菌上清液，定容至20ml，倒入無菌培養皿中，分別制成稀釋10，20，40，60，80，100倍的平板。每個平板中央接入1片直徑為8mm的稻曲病菌菌落圓片，每種稀釋度重復3個平板，以沒有加入無菌上清液的PSA平板作為對照。將平板置于恒溫培養箱中，黑暗培養，分別于3d， 4d，5d，7d測量各平板菌落直徑大小。挑取培養7d后無任何生長的稻曲病菌菌落，轉接到未加入拮抗菌上清液的平板中培養5d，觀察其生長狀況，判斷菌絲是否已死亡或者僅僅被抑制生長(Biological Control, 2008,44 :24-31)。菌絲的生長抑制率采用如下公式計算生長抑制率=1_(處理菌落直徑D / (對照菌落直徑- X 100 %。產黃青霉AF-25發酵上清液的實驗濃度分別為原液、10倍稀釋液，利用牛津杯法測定對意大利青霉(Pencillium i tali cum)，指狀青霉(Pencillium digitacum)，棉花枯萎病菌(Fusarium oxyporium f. sp. Vasinfectum)，棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae), 小麥赤霉菌(Fusarium graminearum),/K禾酉紋枯病菌(Rhizoctonia solani),古月蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovora)等植物病原菌的抑制作用。其中病原真菌以馬鈴薯葡萄糖培養基為生測平板，胡蘿卜軟腐歐文氏菌采用牛肉膏蛋白胨培養基進行生測。發明優點和效果產黃青霉AF-25發酵液對稻曲病菌具有較強的抑制活性，且具有較好的貯存穩定性、酸堿和溫度耐受性，動物毒性實驗表明，該菌發酵液對實驗大鼠不具有明顯毒性，屬于微毒級，因此該菌株可以用于生產防治水稻稻曲病的微生物殺菌劑，從而達到有效防治水稻稻曲病，減少化學農藥對環境的污染，保證水稻穩產高產的目的，因此該菌株具有良好的應用前景。(l)KF-25發酵液對稻曲病菌菌絲生長的抑制作用在含有不同稀釋倍數發酵上清液的PSA平板上，稻曲病菌菌絲的生長受到不同程度的抑制，隨著稀釋倍數的增大，抑制菌絲生長的效果越來越差，在稀釋100倍的PSA平板上，培養到第5天時，菌落的直徑大小與對照菌落(在不含KF-25發酵上清液的PSA平板上生長的菌落)相等。在發酵上清液10倍稀釋的PSA平板上接種稻曲病菌落圓片后，一直培養到第7天，菌落直徑仍為8mm，說明該菌落菌絲沒有任何生長。為了判斷該平板上稻曲病菌菌絲不生長的原因是因為其生長受到抑制或者菌絲已死亡，將其轉移到不含發酵上清液的PSA培養基上繼續培養，經過5天培養后，仍未見菌絲的生長，可初步判斷菌絲已被發酵上清液中的活性物質殺死。
權利要求
1.一種青霉菌 AF-25，其特征在于青霉菌 Penicillium chrysogenum AF-25 CCTCCNO M 2011309。
2.權利要求1所述的一種抗水稻稻曲病的青霉菌AF-25在制備防治或預防水稻稻曲病的生物農藥中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種抗水稻稻曲病的青霉菌及應用，其步驟A、稻曲病菌分離采集稻曲病病穗，采用厚垣孢子懸液法分離稻曲病菌。B、稻曲病菌拮抗菌分離與培養土壤樣品碾細，置于無菌培養皿中，倒入PDA培養基，培養分離真菌單菌落；將分離獲得的真菌菌株接種于PSA培養液中振蕩培養。發酵液過濾除菌，得無菌上清液樣品。C、稻曲病菌拮抗菌篩選取稻曲病菌分生孢子懸液涂布在PSA平板上，于平板中放置無菌牛津杯并加入無菌上清液樣品，培養后獲得青霉菌。一種拮抗青霉菌AF-25在制備防治或預防水稻稻曲病的生物農藥中的應用。該青霉菌對水稻稻曲病菌具有拮抗作用。該青霉菌能抑制稻曲病菌孢子的萌發和菌絲生長，其發酵液對稻曲病具有較強的抑制活性。
文檔編號C12R1/80GK102344891SQ20111030220
公開日2012年2月8日 申請日期2011年9月28日 優先權日2011年9月28日
發明者劉朋明, 劉標, 吳燕, 高梅影 申請人:中國科學院武漢病毒研究所