一種含有抗蟲基因的重組dna片段及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種含有抗蟲基因的重組DNA片段及其應用，特別涉及一種根據玉米 偏好密碼子設計并合成的含有抗蟲基因的重組DNA片段及其應用。
【背景技術】
[0002] 目前在植物轉基因育種中所應用的外源基因如Bt、EPSPS等，大多來自原核生物， 由于原核生物基因自身的特點，如DAT含量較高，超過60%，造成基因表達的mRNA在植物 體內極易被降解；2)存在類似真核基因的內含子切點、轉錄終止子序列，造成轉錄不完整、 mRNA異常剪切等；3)密碼子與植物密碼子存在較大差異，造成蛋白翻譯效率降低；4)其結 構與植物等真核生物差異顯著，如不含有真核生物基因的5' -UTR序列和3'末端的polyA 加尾序列，導致基因在植物體內往往表達水平較低。例如，來自于蘇云金芽孢桿菌的野生型 殺蟲蛋白基因在植物中的表達量非常低，其表達的毒蛋白只占總蛋白的0.001%或者幾乎 檢測不到。
[0003] 玉米螟是世界性的主要玉米害蟲，每年因玉米螟危害造成玉米產量損失在5%左 右。我國是玉米螟的多發和重發區，20世紀70年代以來，幾乎每兩年就大發生一次，年損失 玉米380-640萬噸，相當于一個中等玉米省的產量。
[0004] 由于玉米的內源抗蟲性是受多基因控制的，且心葉期靶標害蟲和穗期靶標害蟲基 因各自獨立遺傳，用常規育種方法培育抗螟雜交種不僅周期長，而且很難獲得兼抗兩個世 代玉米螟的親本。同時，玉米抗螟基因很有可能與高產性狀呈負相關，20年來各國抗螟育種 均未取得明顯進展。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種重組DNA片段。
[0006] 本發明所提供的重組DNA片段包括如下1) -3)的元件：
[0007] 1)啟動子；
[0008] 2)由所述啟動子啟動轉錄的抗蟲基因（命名為mCrylAh);所述抗蟲基因的核苷酸 序列如下述a)或b)或c)所示：
[0009] a)序列表中序列3 ;
[0010] b)序列表中序列3的第1-2007位；
[0011] c)與序列表中序列3或序列3的第1-2007位至少具有98%的同一性，且編碼序 列9所不蛋白質（命名為CrylAh蛋白）；
[0012] 3)終止序列。
[0013] 可用于本發明的啟動子包括但不限于：組成型啟動子，組織、器官和發育特異的啟 動子，和誘導型啟動子。如花椰菜花葉病毒的組成型啟動子35S ;西紅柿蛋白酶抑制劑II 啟動子（PIN2)或LAP啟動子（均可用茉莉酮酸曱酯誘導）；熱休克啟動子；四環素誘導型 啟動子；種子特異性啟動子，如谷子種子特異性啟動子PF128,種子貯存蛋白質特異的啟動 子，例如，菜豆球蛋白、napin, oleosin和大豆beta conglycin的啟動子等。
[0014] 在本發明的一個實施例中，所述啟動子為Ubi啟動子，來源于玉米，為組成型表達 啟動子，其序列具體為序列表中序列6,或與序列6至少具有80%的同一性，且具有啟動子 功能。
[0015] 可用于本發明的轉錄終止子包括但不限于：農桿菌胭脂堿合成酶終止子（N0S終 止子）、花挪菜花葉病毒CaMV 35S終止子、tml終止子、婉? rbcS E9終止子和胭脂氨酸和 章魚氨酸合酶終止子。
[0016] 所述轉錄終止序列具體為PolyA加 T-NOS的雙終止序列，如序列表中序列7所示， 或與序列7的位至少具有80%的同一性，且具有轉錄終止功能的序列。
[0017] 在本發明的一個實施例中，所述重組DNA片段還包括OMK序列。所述OMK序列由 Ω序列和Kozak序列順次連接組成，其序列具體為序列表中序列5,或與序列5至少具有 80%的同一性，且具有增強子功能。
[0018] 所述Ω序列和Kozak序列來源于煙草花葉病毒，為增強子，負責增強所述抗蟲基 因的表達。
[0019] 在本發明的一個實施例中，所述重組DNA片段由所述Ubi啟動子、所述OMK序列、所 述抗蟲基因和所述轉錄終止序列順次連接組成，命名為Ubi-OMK-mCryIAh-PolyA-T-NOS ; 其序列具體如序列表中序列11所示。
[0020] 其中，序列3由2010個核苷酸組成，其末尾處為兩個終止密碼子，編碼序列表中序 列9所示的CrylAh蛋白。序列5由67個核苷酸組成。序列6由2009個核苷酸組成。序 列7由488個核苷酸組成。序列9由668個氨基酸組成。序列11由4605個核苷酸組成，其 中第1-2009位為Ubi啟動子序列，第2010-2076位為OMK序列，第2083-4092位為mCyrIAh 序列，第4118-4605位為轉錄終止序列。
[0021] 含有所述重組DNA片段的重組細胞系、轉基因植物或轉基因微生物也屬于本發明 的保護范圍。
[0022] 所述重組細胞系可以為真核細胞，也可以為原核細胞，如植物細胞系。在本發明的 一個實施例中，所述轉基因植物（如玉米）包括種子、愈傷組織、完整植株和細胞。所述轉 基因微生物為轉入所述重組DNA片段的農桿菌LBA4404。
[0023] 所述重組DNA片段在培育抗蟲轉基因玉米中的應用也屬于本發明的保護范圍。所 述轉基因玉米包括種子、愈傷組織、完整植株和細胞。
[0024] 在本發明的一個實施例中，所述玉米具體為玉米HiII。
[0025] 在本發明中，所述抗蟲具體為抗玉米螟。
[0026] 實驗證實，本發明所提供的人工合成的抗蟲基因（序列3)的轉基因玉米，其 Cry IAh蛋白蛋白的表達量明顯提尚，每克（鮮重）葉片中Cry IAh蛋白的表達量可達 3. 18 μ g，而原始基因表達量僅為1.01 μ g。同時，本發明所提供的人工合成的抗蟲基因（序 列3)的轉基因玉米對革巴標害蟲的抗性也明顯提高，轉入mcryIAh基因的T 6代植株，在玉米 5-6葉期接蟲后，無明顯的蟲害，表現正常；而轉cryIAh基因（優化前，序列2)及非轉基因 植株，在接蟲后，蟲害非常嚴重。
【附圖說明】
[0027] 圖 1 為載體 pS3300-UMCT-UMG2、pS3300-UMG2-UCA 和 pS3300-UMG2-UC2A 的質粒 圖譜。其中，A為pS3300-UMCT-UMG2的質粒圖譜；B為pS3300-UMG2-UCA的質粒圖譜；C為 PS3300-UMG2-UC2A 的質粒圖譜。
[0028] 圖2為轉基因玉米CrylAh基因、mCrylAh基因和mG2-aroA基因的PCR檢測圖譜。 其中，A為轉基因玉米CrylAh基因的PCR檢測圖譜；I :CK+(質粒陽性對照）；2 =Marker ;3 : CK (未加 DNA) ;4 :CK (非轉基因玉米）；5-24 :轉CrylAh基因玉米事件。B為轉基因玉米 mCryIAh基因的PCR檢測圖譜；I :CK+(質粒陽性對照）；2 :Marker ;3 :CK (未加 DNA) ;4 : CK(非轉基因玉米）；5-24:轉mCrylAh基因玉米事件。C為轉基因玉米mG2-aroA基因的 PCR檢測圖譜；I :CK+(質粒陽性對照）；2 :Marker ;3 :CK (未加 DNA) ;4 :CK (非轉基因玉 米）；5_ 14 :轉CrylAh基因玉米事件；15-24 :轉mCryIAh基因玉米事件。
[0029] 圖3為轉基因玉米苗期草甘膦的耐受性檢測結果。
[0030] 圖4為轉基因玉米田間抗蟲性檢測結果。其中，A為海南抗蟲的轉mCrylAh基因 玉米株系；B為海南不抗蟲的非轉基因對照株系。
【具體實施方式】
[0031 ] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0032] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0033] 實施例1、密碼子優化型抗蟲基因的獲得
[0034] 本實施例根據CrylAh全長基因（核苷酸序列如序列表中序列1所示，參見中國專 利申請：200410009918. 9)編碼蛋白的前667個氨基酸序列（前667個氨基酸序列如序列 表中序列8所示，對應的核苷酸序列如序列表中序列2所示），在保證氨基酸序列不變的前 提下，首先采用玉米偏好密碼子對CrylAh基因進行人工優化改造。盡量避免使用玉米稀有 密碼子，并調整了密碼子的使用頻率（表1)。在此基礎上，去除DNA序列中存在的典型的 造成植物基因轉錄本不穩定的富含AT序列，并去除了發夾結構，得到的新的核苷酸序列為 序列表中序列3。序列3與CrylAh基因（序列1)的l-2001bp(即序列2)的同源性只有 70%，而G+C含量由原來的37. 4%增加到56. 3%。同時為了便于克隆，在起始密碼子后添 加 GGC三個核苷酸。序列3所示基因即為密碼子優化型抗蟲基因，將其命名為mcrylAh。密 碼子在CrylAh基因和mcryIAh基因中的使用頻率見表1。為方便克隆，發明人在序列3的 5'端引入SpeI酶切位點，在3'端引入AatII酶切位點，最終序列如序列表中序列4所示。 序列4的第7-2016位即為序列3。序列1的第1-2001位（即序列2)編碼序列表中序列8 所不蛋白，序列3以及序列4的第7-2016位均編碼序列9所不蛋白（與序列8所不蛋白相 比多出序列9自N端起的第2個氨基酸殘基），將該蛋白命名為CrylAh蛋白。
[0035] 表1玉米優選密碼子標準
[0036]
[0038] 實施例2、mcry IAh轉基因玉米的獲得
[0039] 一、重組表達載體 pS3300-UMG2-UCA 和 pS3300-UMG2-UC2A 的構建
[0040] 為了提高mcrylAh基因（序列3)在受體生物中的表達水平，發明人在構建 mcryIAh基因的重組表達載體時，在mcryIAh基因的5'端添加了 Ω序列和Kozak序列，Ω/ Kozak序列（簡稱0ΜΚ)如序列表中序列5所示。Ω序列是衍生于植物病毒衣殼蛋白基因 編碼區的翻譯增強序列，由67bp組成，富集TTAAC序列，5'端有一個UAUUUUUACAACAA序列 以及4個UUAC序列，這些序列在蛋白質合成的翻譯過程中構成核糖體和rRNA結合位點。 Kozak序列是促進外源基因在植物細胞內翻譯過程的編碼核糖體結合蛋白的序列。啟動子 選用組成性啟動子Ubi啟動子，其序列如序列表中序列6所示。再則，在編碼序列3'端設計 了 2