專利名稱：一種豬tlr4基因c1027a堿基突變的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種豬TLR4基因C1027A堿基突變的檢測方法，屬基因工程技術領域。 用此方法，能快速檢測到豬TLR4基因的單核苷酸堿基突變，為豬免疫防御系統受體基因分子結構、功能研究提供幫助。
背景技術：
Toll樣受體(TLRs)作為重要的模式識別受體，通過對病原體相關分子模式 (PAMPs)的識別及信號級聯反應，介導機體的天然免疫和獲得性免疫，是機體抵抗感染的第一道屏障；TLRs基因變異導致宿主對革蘭陽性菌、陰性菌的反應能力喪失，改變機體對病原的抗性或易感性。TLR4在病原微生物跨膜信號傳導具重要作用，研究已證實TLR4是機體對LPS免疫應答的主要受體，敲除該基因的小鼠對細菌性病原的刺激應答明顯減弱，TLR4基因缺陷小鼠對病毒的抵抗能力降低。目前有關豬TLR4基因的SNP檢測偶見報道，但基本局限在個別外顯子的單個堿基突變。本發明根據GenBank數據庫豬TLR4基因序列設計引物，對中外不同品種豬TLR4基因整個編碼區進行特異性PCR擴增，找尋可能存在的單核苷酸堿基突變，并分析堿基突變導致的編碼氨基酸及蛋白活性、基因功能的改變，為豬Toll樣受體與機體免疫力的關系研究奠定基礎，同時，為豬抗病育種研究提供基因工程技術幫助。
發明內容
技術問題本發明的目的在于提供豬TLR4基因單核苷酸多態性檢測方法，有助于研究豬 TLR4基因的分子結構、功能及機體抗病原免疫模式和機理，為豬疫病防控及抗病育種提供依據。技術方案一種豬TLR4基因C1027A堿基突變的檢測方法，包括設計豬TLR4基因序列特異性擴增引物，對豬模板cDNA進行PCR擴增；分離、純化特異性擴增產物進行核酸序列測定、比對，找尋不同檢測個體TLR4基因存在的單核苷酸堿基突變，分析基因突變導致的編碼氨基酸及蛋白活性、功能的改變。其特征在于如下步驟步驟一，據GenBank數據庫豬TLR4基因序列設計特異引物正義引物5 ‘ -AATGATTTCAGGTGGCAACA-3 ‘反義引物5' -AATGCTTCAGTTTGGTTGTCC-3‘應用上述引物對待檢測豬模板cDNA進行PCR擴增；PCR擴增反應體系(12 μ 1) 10XPCR buffer 1· 2 μ l,2mM/L dNTPs 1· 2 μ l,25mM/ L MgCl2O. 8 μ 1, IOpmol/ μ 1 primer 1. 0 μ 1, 5U/ μ 1 Taq polymerase 0. 2 μ 1, 50ng/ μ 1 DNA0. 8 μ 1，ddH20 6. 8 μ 1 ；
反應條件94°C預變性5min ；94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸lmin，;34個循環；72°C 延伸 8min ；其中，PCR擴增片段長度為229bp。步驟二，對特異性擴增產物進行分離、純化，獲得特異核酸；步驟三，對分離純化的擴增產物進行序列測定、比對分析，得出待檢豬TLR4基因是否存在C1027A單核苷酸堿基突變。有益效果本發明根據GenBank數據庫豬TLR4基因序列設計引物，對中外不同品種豬TLR4 基因整個編碼區進行特異性PCR擴增，找尋可能存在的單核苷酸堿基突變，并為豬Toll樣受體與機體免疫力的關系研究奠定基礎，同時，為豬抗病育種研究提供基因工程技術幫助。本發明通過研究，確定了檢測豬TLR4基因編碼區C1027A堿基突變合適的特異引物SEQ ID N0:l-2，優化的PCR擴增程序和條件，明確了豬TLR4基因有效的單核苷酸突變堿基及相應的編碼氨基酸改變，分析堿基突變導致的編碼氨基酸及蛋白活性、基因功能的改變，為TLR4受體基因遺傳變異導致分子結構及功能變化提供理論依據，同時，為TLR4作為免疫模式受體基因發生變異而引起機體對部分傳染性疾病免疫能力的改變等研究提供技術支持。
圖1 :PCR擴增產物PAGE電泳示例圖2 突變點測序結果示例
具體實施例方式本發明針對豬TLR4基因編碼區的篩查，檢測到豬該基因存在C1027A單核苷酸堿基突變，引起Gln343Lys編碼氨基酸的改變。針于豬TLR4基因堿基突變的檢測技術較多，包括DNA直接測序、雜交測序、酶切測序、DNA芯片技術、變性高效液相色譜等。較常規簡易的實施方式為1、以GenBank數據庫豬TLR4基因序列為模板，應用生物軟件設計特異引物，如 SEQID NO :1_2，要求引物針對模板序列易擴增，特異性好。2、對PCR反應體系和條件進行優化，檢測產物濃度和質量；應用核酸純化試劑盒， 割膠回收PCR擴增產物，測序。3、用核酸分析軟件比對各樣本產物序列，找尋單核苷酸堿基突變；分析突變性質及由此引起的編碼氨基酸、蛋白結構的變化。用于本發明的測試樣本沒有特別限制，可以任何含有豬TLR4基因的核酸序列，對單個突變位點，甚至可以從血液、組織等樣品抽提DNA樣本直接應用。下面結合實施例進一步闡述本發明。本實施例僅用于說明本發明但不用于限制本發明范圍。實施例中未注明的具體實驗條件和方法，通常按照常規條件進行，如分子克隆實驗手冊所述條件或制造廠商建議條件。實施例1豬TLR4基因cDNA的獲取及引物設計
用Trizol Reagent (Invitrogen)提取豬(長白豬，購自江蘇常州康樂農牧有限公司豬場)總RNA，紫外分光光度計檢測核酸濃度及純度；M-MLV反轉錄酶(ftOmega)及 Oligo (dT) 18 (Promega)反轉錄 cDNA ；根據 GenBank 數據庫豬 TLR4 基因序列(AB18830U AJ628065)，用I^rimer 5. O設計特異引物，用于PCR擴增。引物序列為正義引物5' -AATGATTTCAGGTGGCAACA-3‘ (SEQ ID NO 1)反義引物5' -AATGCTTCAGTTTGGTTGTCC-3‘ (SEQ ID NO 2)實施例2PCR擴增及產物純化應用SEQ IDNO 1-2對待檢測豬模板cDNA進行PCR擴增。PCR擴增反應體系(12 μ 1) 10XPCR buffer 1· 2 μ l,2mM/L dNTPs 1· 2 μ l,25mM/ L MgCl2O. 8 μ 1, IOpmol/ μ 1 primer 1. O μ 1, 5U/ μ 1 Taqpolymerase 0. 2 μ 1, 50ng/ μ 1 DNA0. 8 μ 1，ddH20 6. 8 μ 1 ；反應條件94°C預變性5min ；94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸lmin，34個循環；72°C 延伸 8min ；其中，擴增片段長度為229bp(圖1)。應用核酸純化試劑盒，參照廠商提供方案對 PCR擴增產物進行分離、純化。實施例3測序及單核苷酸多態檢測對純化的豬TLR4基因SEQ ID NO 1~2引物PCR擴增產物直接測序，比對不同樣本 PCR產物測定序列。結果，在被檢測的10頭長白豬實驗樣本中，TLR4基因cDNA序列第1027 位點表現為7個C，2個C/A雜合，1個A，揭示實驗豬在TLR4基因編碼區第1027位點存在 C/A單核苷酸堿基突變(圖1、2)。而且，豬TLR4基因1027位點的C1027A堿基突變，直接導致編碼氨基酸出現 Gln343Lys改變，氨基酸性質隨之發生變化，造成TLR4基因功能域超螺旋結構的改變，影響 TLR4作為模式識別受體對特異病原的免疫應答，進而表現對特定疾病具備不同的免疫能力。為豬疫病防控及抗病育種提供依據，同時，為豬抗病育種研究提供基因工程技術幫助。應當明確，在閱讀本發明上述講授內容后，相同領域技術人員可以對本發明作出各種技術修改，其等價形式同樣屬于本申請所附權力要求書限定范圍。
權利要求
1.一種豬TLR4基因C1027A堿基突變的檢測方法，其特征在于如下步驟 步驟一，據GenBank數據庫豬TLR4基因序列設計特異引物正義引物 5 ‘ -AATGATTTCAGGTGGCAACA-3 ‘ 反義引物 5 ‘ -AATGCTTCAGTTTGGTTGTCC-3 ‘ 應用上述引物對待檢測豬模板cDNA進行PCR擴增； 步驟二，對特異性擴增產物進行分離、純化，獲得特異核酸；步驟三，對分離純化的擴增產物進行序列測定、比對分析，得出待檢豬TLR4基因是否存在C1027A單核苷酸堿基突變。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于PCR 擴增反應體系 12μ 1 :10XPCR buffer 1. 2μ l,2mM/L dNTPs 1. 2μ l,25mM/ L MgCl2O. 8 μ 1, IOpmol/ μ 1 primer 1. 0 μ 1, 5U/ μ ITaq polymerase 0. 2 μ 1, 50ng/ μ 1 DNA0. 8 μ 1，ddH20 6. 8 μ 1 ；反應條件94°C預變性5min ；94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸lmin，34個循環； 72°C 延伸 8min ；其中，PCR擴增片段長度為229bp。
全文摘要
本發明涉及一種豬TLR4基因C1027A堿基突變的檢測方法，屬基因工程技術領域。根據GenBank數據庫豬TLR4基因序列設計特異引物，對待檢測豬模板cDNA進行PCR擴增；分離、純化擴增產物，獲得特異核酸；對分離純化的擴增產物進行序列測定，比對分析后確定擴增序列是否存在C1027A單核苷酸突變。本發明可用于豬TLR4基因單核苷酸堿基突變的檢測，對判定機體免疫模式識別改變有很大幫助，為豬疫病防控及抗病育種提供依據，同時，為豬抗病育種研究提供基因工程技術幫助。
文檔編號C12Q1/68GK102417928SQ20111030685
公開日2012年4月18日 申請日期2011年10月10日 優先權日2011年10月10日
發明者任守文, 劉筱, 孟翠, 方曉敏, 李碧俠, 王學敏 申請人:江蘇省農業科學院