專利名稱：一種檢測甘蔗中寄生白條病菌的實時熒光定量pcr方法
技術領域：
本發明涉及甘蔗健康種苗與甘蔗抗性鑒定分子生物學技術領域，更具體地涉及一種檢測甘蔗中寄生白條病菌拷貝數的實時熒光定量PCR方法。
背景技術：
甘蔗白條病(Leaf kald Disease，LSD)是由細菌白條黃單胞菌引起的世界性甘蔗病害之一，廣泛分布于美國、加拿大等多個國家和地區，也是國內外重要檢疫對象之一。 白條病菌為 Xanthomonas albilinearis Dowson，短小桿狀，0. 6-1. 0X0. 3 μ m，由一單極鞭毛游行，呈革蘭氏陰性反應，最適生長溫度25-28°C，在培養基上凸起，閃光、透明，略紅。該病癥可分為兩個時期(1)潛伏期病葉的白條常由葉片引申至葉鞘，直而狹，邊界明顯，寬約1-3毫米，至一線大小，正覆蓋在維管束之上，后來整個葉片變淡青色。(2)嚴重期病葉開始凋萎，病株初現白色，繼之枯萎、死亡，病莖節間短小，常產生側芽莖。該病對甘蔗產量影響較大，一般新植產量損失10% 15%，宿根蔗產量損失更為嚴重，且影響宿根蔗年限，是甘蔗品種退化的重要原因之一，甘蔗LSD病原菌寄生于維管束中，至今尚無有效的化學防治方法。目前最有效的控制措施就是培育健康種苗，切斷白條病菌依靠種苗傳播途徑。如何快速準確的鑒定甘蔗是否含有LSD病菌是甘蔗健康種苗生產的關鍵技術之一。現有檢測白條病病菌的方法不能定量病原菌數量、準確性差、且費時、費力，因此，生產上迫切需要建立一種能高效、快速、準確、靈敏的檢測白條病菌的方法。植物在長期的進化過程中經常會受到一些病原細菌的侵襲，一些非寄主或抗性植物在抵御病原菌侵害的過程中，是一種重要的抗病機制過敏性反應(hypersensitive reaction，HR)，發生不親和反應導致病原菌侵入點周圍植物細胞快速死亡而獲得抗性；而感病植物則和侵染細菌發生親和反應，最終病原細菌建立寄生并侵染致病。研究發現，植物病原細菌的一禾中 hrp (hypersensitive reaction and pathogenicity gene)基因參與禾口介導HR的發生，并且能夠決定病原菌的致病性。hrp基因可用于植物病原細菌的檢測和鑒定，將其作為檢測靶標是目前分子檢測的新方向。傳統的定性PCR檢測技術一直面臨著假陽性污染和不能準確定量兩大問題，理論上講，只要待測樣品中有一個靶分子，PCR就能擴增出陽性，隨即帶來了假陽性偏高的問題，而且電泳所用染色劑EB (溴化乙錠)為強烈致癌物質，容易危害操作者的健康，且電泳花費較長時間。實時熒光定量PCR (Real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR)是在常規PCR基礎上把熒光共振能量轉移與熒光標記探針結合，巧妙地把核酸擴增、雜交、光譜分析和實時檢測技術融合在一起的一項創造性技術，它具有快速、靈敏、高通量、特異性強、自動化程度高、重復性好、準確定量等特點。不僅有效地提高了檢測速度和水平，而且檢測的靈敏度也比一般的PCR檢測方法高出 100倍左右，由于不再需要電泳、染色的步驟，大大簡化實驗操作步驟，縮短檢測時間。本發明通過克隆白條病菌的致病基因之一 hrpB，經過NCBI網上序列比對，設計白條病菌的實時熒光定量PCR檢測引物與探針，從而提供了一種用于檢測甘蔗中寄生的白條病菌拷貝數的實時熒光定量PCR方法。
發明內容
本發明的目的是為了解決現有檢測白條病病菌不能定量病原菌數量、準確性差、 且費時、費力，而提供了一種檢測甘蔗中寄生白條病菌的實時熒光定量PCR方法，省去了電泳檢測時間，檢測時間大大縮短，同時提高了檢測結果的準確性。本發明的技術方案如下
本發明首先提供了一種利用實時熒光定量PCR方法檢測甘蔗中寄生的白條病菌的引物及探針，所述的引物為以下序列的引物對正向引物5 ’ - CACGATGCTGTACACACTGC-3，和反向引物 5，-CTTGCAGGACCTTGCTTTG-3，探針FAM_5，- ACGTCCACGCCGTGAGTTGC-3，-TAMRA, 其中FAM為標記在探針5’端的熒光基團，TAMRA為標記在探針3’端的熒光淬滅基團。本發明還提供了一種檢測甘蔗白條病菌的實時熒光定量PCR方法，包括以下步驟
(1)利用CTAB法提取白條病菌DNA；
(2)克隆HrpB基因片段，以白條病菌DNA為模板，采用上述引物對進行定性PCR擴增， 切膠純化，連接到PMD18-T載體上，選擇陽性克隆，提取質粒DNA，得到HrpB基因片段；測定質粒DNA的吸光值，并將吸光值轉化成DNA濃度，再將DNA濃度轉化成為拷貝數，進行梯度稀釋，并以稀釋后的DNA為模板進行實時熒光定量PCR擴增，繪制標準曲線，并建立標準曲線方程；
(3)以待測樣品蔗汁DNA為模板，用所述引物與探針進行實時熒光定量PCR擴增，通過將產生的的Ct值代入標準曲線方程轉化成起始反應的DNA分子拷貝數，即一個分子拷貝數代表一個白條病菌。為了保證定量檢測的準確性，因此在設計引物與探針時選擇該病原菌所特異致病基因之一 HrpB基因，然后將該序列在NCBI進行序列比對，該基因為白條病菌所特異基因， 與其他生物基因沒有顯著的同源性。與現有技術相比，本發明具有的優點和效果如下
1、本發明首次根據白條病菌的致病基因HrpB設計特異性引物與探針；
2、本發明首次在白條病菌的檢測上利用定量PCR法構建標準曲線方程，計算甘蔗樣品中寄生的白條病菌數量，不僅特異性強，且靈敏度高；
3、本發明首次將白條病菌實時熒光定量PCR方法應用于甘蔗健康種苗檢測、甘蔗抗性鑒定方面。
圖1為白條病菌HrpB基因實時熒光定量PCR反應的擴增曲線，橫坐標代表循環數 Ct值；縱坐標代表熒光信號強度；
圖2為白條病菌擴增的標準曲線方程，橫坐標代表白條病菌數量的對數值IoglO ；縱坐標代表甘蔗樣品產生的循環數Ct值。
具體實施例方式
以下使用的各種生化試劑均來自生工生物工程(上海)有限公司，PCR相關試劑來自ABI公司，PMD18-T載體、引物與探針合成都來自TAKARA寶生物工程(大連)有限公司， 測序完成于南京金斯瑞生物有限公司。實施例1
采用CTAB法提取甘蔗蔗汁中寄生的白條病菌Xanthomonas albilineans(現保存于福建農林大學甘蔗綜合研究所，該菌的分離培養，參考Davis Μ. J, Rott PP, Dean J. L. et al. Selective isolation of Xanthomonas albilineans, causal agent of leaf scald disease, Plant diseasesl995; 476-483)的核酸DNA，以該模板利用上述引物對進行定性PCR擴增，采用Eppendorf Mastercycler EP PCR熱循環儀5333型基因擴增儀。25 μ L PCR 反應體系組成IOXPCRBufTer(Mg2+) 2.5 μ L，dNTP (2. 5 mmol/L) 2 yL，正反向引物(10 ymol/L)各 1 μ L，ExTaq 酶(5U/y L) 0. 125 yL，模板 DNA (50 ng/μ L) 1 yL，力口滅菌雙蒸水使總體積為17. 375。PCR擴增條件95 "C 5 min ；95 "C 30 S, 58 "C 30 S, 72 0C 20 S，35個循環；最后72 °C延伸7 min后4 °C保存備用。反應結束后將所得PCR 產物用于1. 5%瓊脂糖凝膠電泳分析，并進行膠回收純化，連接到PMD18-T載體上，選擇陽性克隆，提取質粒DNA，送測序公司進行測序，測序完成后將所得到測序結果Blast比對，結果正常后，繼續將質粒DNA采用紫外分光光度計在沈0 nm測定吸光度值。然后根據公式(DNA 樣品濃度(ug/ml)=0D26CIX50X稀釋倍數)將吸光度值轉換成質粒DNA濃度。在根據以下公式將質粒DNA濃度轉化為拷貝數。MW =堿基數 χ 660 dalton/bp
(6. 02 χ 10 23 χ (濃度 g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml
對于雙鏈 DNA, 256 ng/μ L 質粒 DNA 的 2798 bp 長度相當于 8. 4 χ10 13 copies/μ L 純化后的質粒DNA定量后，將該質粒DNA作為標準品，采用倍比梯度稀釋法進行稀釋， 即Iv原液(標準品i) +9v稀釋緩沖液，得標準品ii ；Iv標準品ii+9v稀釋緩沖液，得標準品iii，以此類推進行梯度稀釋，使得質粒的拷貝數為108-10，分成8個標準樣品處理，以此稀釋后質粒DNA為模板，每個標準樣品處理重復3次。分別以大腸桿菌、宿根矮化病菌、 Leifsonia ginsengi和Leifsonia 菌DNA和健康種苗的蔗汁DNA為陰性對照，以DNA 為白條病菌陽性對照，以雙蒸水為空白對照。采用ABI公司實時熒光定量PCR試劑盒進行PCR擴增，反應體系包括TaqMan Universal Master Mix (2 Χ) 12. 5 yL;正、反向引物(10 μ mol/L)各 0. 4 μ L ； TaqMan 探針(10 μ mol/L) 0.2 “1^;0嫩模板(1 μ g/μ L)l. 0 μ L ；補水至 25 μ L，反應條件50 "C, 2 min，預變性 95 "C, 10 min ；95 "C, 15 s ；60 °C，退火延伸，1 min，40 個循環，在 60°C 進行單點熒光檢測。利用ABI公司7500定量PCR儀進行實時熒光定量PCR擴增，制作標準曲線(如圖1)，進而構建標準曲線方程(如圖2)。反應結束后，利用軟件將反應中的數據分析生成標準曲線，R2表示標準曲線相關系數，Slope表示標準曲線斜率，Efficiency表示反應的擴增效率，Y-interc印t表示Y軸的截距。正常的標準曲線應滿足以下條件R2 > 0.99，-3.5 < Slope < -3.0，0. 9 < Efficiency < 1.2。本實施例構建的標準曲線方程為:Y=-3. 3918Χ+36. 476。實施例2
將2011年福建農林大學校內的甘蔗資源圃甘蔗分別提取蔗汁DNA，5個不同品種甘蔗有以下Badila, CP29-126、Cc^81、CP92-1167、Q174，采用打氣泵吹汁法和高速離心法提取甘蔗汁液，按照傳統的核酸提取方法CTAB法，以純化后的基因組DNA作為模板，利用ABI 公司7500實時熒光定量PCR儀，采用本發明特異性的引物與TaqMan探針進行實時熒光定量 PCR 擴增。反應體系包括TaqMan Universal Master Mix (2Χ) 12.5 μ L ；，正、反向上下游引物(10 μπιοΙ/L)各 0.4 μ L ;TaqMan 探針(10 μ mol/L) 0.2 yL;DNA 模板 1.0 μ L ；補水至25 μ L，每個樣品做3次重復。反應條件50 °C，2 min，預變性95 °C，10 min ； 95 15 s ；60 °C，退火延伸，1 min，40個循環，在60°C進行單點熒光檢測。然后導入已建立的標準曲線方程利用熒光定量PCR儀軟件計算生成的Ct值，將Ct值導入標準曲線方程計算檢測起始核酸分子的拷貝數。經過計算白條病菌在5個不同甘蔗品種中的數量分別為Badila為1.2X103、 Co281為2.9\103、0 29-126為5.6\104’，其余2個品種未檢測出白條病菌。申請人:采用本方法檢測過多種其他病菌(包括大腸桿菌、宿根矮化病菌、 Leifsonia ginseng!和Leifsonia 菌DNA、以健康種苗的蔗汁DNA為陰性對照，以白條病菌DNA為陽性對照，以雙蒸水為空白對照)，分別進行上述引物與探針的特異性檢測，結果發現該反應特異性強，其他待測菌株沒有擴增曲線產生。本發明的檢測限為10個拷貝，檢測在IO8-IO個拷貝數之間。
權利要求
1.一種利用實時熒光定量PCR方法檢測甘蔗中寄生白條病菌的引物及探針，其特征在于所述的引物為以下序列的引物對正向引物序列5’ -GGTTCCATTGCTTACCGATT-3’，反向引物序列 5’ -CAAGTTTCGACAGGAACAGC-3，，探針序列是 FAM-5-CCACGGCTACGTCAATTCGGG-3-T AMRA。
2.一種根據權利要求1所述的引物及探針檢測甘蔗中寄生白條病菌的實時熒光定量 PCR方法，其特征在于包括以下步驟(1)利用CTAB法提取白條病菌DNA；(2)克隆HrpB基因片段，以白條病菌DNA為模板，采用上述引物對進行定性PCR擴增， 切膠純化，連接到PMD18-T載體上，選擇陽性克隆，提取質粒DNA，得到HrpB基因片段；測定質粒DNA的吸光值，并將吸光值轉化成DNA濃度，再將DNA濃度轉化成為拷貝數，進行梯度稀釋，并以稀釋后的DNA為模板進行實時熒光定量PCR擴增，繪制標準曲線，并建立標準曲線方程；(3)以待測樣品蔗汁DNA為模板，用所述引物與探針進行實時熒光定量PCR擴增，通過將產生的的Ct值代入標準曲線方程轉化成起始反應的DNA分子拷貝數，即一個分子拷貝數代表一個白條病菌。
3.根據權利要求2所述檢測甘蔗中寄生白條病菌的實時熒光定量PCR方法，其特征在于所述實時熒光定量PCR擴增的反應體系為25 μ L 2 X TaqMan Universal Master Mix 12.5 μ L ；10 ymol/L正向引物與反向引物各0. 4 μ L ；10 μ mol/L探針0. 2 μ L ;DNA模板1. 0 μ L ；補水至25 μ L。
4.根據權利要求2所述檢測甘蔗中寄生白條病菌的實時熒光定量PCR方法，其特征在于所述實時熒光定量PCR擴增的反應條件為50 2 min，預變性95 10 min ；95 °C， 15 s ；60 °C，退火延伸，1 min，40個循環，在60°C進行單點熒光檢測。
全文摘要
本發明涉及一種檢測甘蔗中寄生白條病菌拷貝數的實時熒光定量PCR方法。首先提供了一種利用實時熒光定量PCR方法檢測甘蔗中寄生白條病菌的引物及探針，所述的引物為以下序列的引物對正向引物序列5’-GGTTCCATTGCTTACCGATT-3’，反向引物序列5’-CAAGTTTCGACAGGAACAGC-3’，探針序列是FAM-5-CCACGGCTACGTCAATTCGGG-3-TAMRA，然后采集和處理甘蔗蔗汁并提取總DNA，利用實時熒光定量PCR方法檢測甘蔗中感染的白條病菌HrpB基因，通過擴增過程生成的Ct值，代入標準曲線方程，轉換成起始反應的DNA分子拷貝數，從而達到定量檢測甘蔗中感染白條病菌數量的目的。
文檔編號C12R1/64GK102312015SQ20111031655
公開日2012年1月11日 申請日期2011年10月18日 優先權日2011年10月18日
發明者王恒波, 許莉萍, 郭晉隆, 陳如凱, 陳平華, 高三基 申請人:福建農林大學