專利名稱：一種檢測甘蔗褐銹病菌或黃銹病菌的pcr方法
技術領域：
本發明涉及一種甘蔗病原菌的檢測方法，具體涉及一種檢測甘蔗褐銹病菌或黃銹病菌的PCR方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
甘蔗銹病屬于真菌性病害，包括褐銹病和黃銹病，其中褐銹病由黑頂柄銹菌 {Puccinia)引起,而黃銹病則由屈恩柄銹菌)引起。這兩種病菌都主要經由風力傳播，然后通過氣孔侵入，從而造成感病品種蔗莖產量和蔗糖分的嚴重損失。褐銹病主要在夏季流行，而黃銹病則在春季更流行。
甘蔗褐銹病和黃銹病都主要發生在葉片上，初次侵染源都來自甘蔗本身或其他中間寄主，但受侵染后癥狀表現不同受褐銹病菌侵染后，初期甘蔗葉片上長出黃色小斑點， 色澤呈褐色至橙褐色，周圍有黃色暈環，后期病斑因夏孢子堆呈膿皰狀，最后病斑變黑色， 葉組織壞死，使甘蔗葉片失去光合能力，表現早衰；而受黃銹病菌侵染后，危害癥狀最初較輕，病斑不明顯，僅在葉片上產生淡黃色小斑點，隨病斑擴大，拉長的黃色病斑留下淺黃綠色暈圈，且顏色由桔色發展到橙棕色。但與一般的褐銹病不同，桔色銹斑從來不會發展為暗褐色。培育抗病品種，提高目標甘蔗品種的抗銹病性，并避免栽種感病品種，是控制甘蔗銹病(褐銹病和黃銹病)的最為經濟有效的措施。在甘蔗抗銹病育種過程中，如何檢測目標甘蔗品種中是否含有甘蔗褐銹病菌或黃銹病菌以及檢測的的效率和準確性直接影響甘蔗抗銹病育種的進程和效果。目前，一般采取兩種方法判斷種莖是否帶菌一種是采用分離培養技術，在建立純培養物的基礎上，根據培養物所產生孢子的形態特征進行鑒定。甘蔗褐銹病的病原為 黑頂柄銹菌，其夏孢子橙色或橙褐色，卵圓形至梨形，大小24.1 34.9X18.1 25.3 ( μ m)，具3 4個芽孔。夏孢子壁四周均勻加厚。冬孢子雙細胞，壁光滑，頂壁常加厚，棍棒狀，蒼白至磚色，大小28. 9 45. 8 X 14. 5 21. 7 ( μ m),而甘蔗黃銹病的病原為屈恩柄銹菌，其夏孢堆葉背生，長O. 5 I _，表皮破裂時散出肉桂色粉狀物。夏孢子卵圓形，表面具刺，淺黃色，大小25 42 X 17 25 ( μ m)，壁厚1. 5 2. 5 μ m，赤道上有4個芽孔。冬孢子堆黑色，冬孢子長橢圓形，頂端圓或平，深褐色，大小30 56X15 22 ( μ m)， 壁厚2 4. 5 μ m，具一隔膜，柄短，黃褐色；另一種是基于甘蔗褐銹病和黃銹病的表型癥狀不同，判斷是否發生銹病以及所發生的銹病為褐銹病或者黃銹病，因此，可以采用種莖種植后，觀察是否發生銹病以及所發生銹病的癥狀判斷待檢測甘蔗品種中是否含有褐銹病菌或黃銹病菌。但是，上述的第一種方法由于分離培養以及最終建立純培養物需要時間長，加上分離過程雜菌污染等，都會影響分離效果，檢出效率不高；第二種方法則受到甘蔗、環境條件和病原菌三個因素相互作用的影響，即便田間有病原、甘蔗基因型也是感病的，要發生病害，還需要合適的環境條件，這導致鑒定結果難以預料。同時，耗時長，工作量大，不同地點、 不同年份間的鑒定結果亦存在較大差異。顯然，目前已有的技術方法，對于判斷種莖是否帶菌是不適用的，急需建立一種快速、準確，并能同時檢測區分甘蔗褐銹病菌和黃銹病菌的的 PCR檢測方法。發明內容
本發明的目的是提供一種檢測甘鹿褐銹病菌iPuccinia melanocephala )或黃銹病菌kiwhniim PCR方法，可用于田間甘蔗褐銹病菌和黃銹病菌的早期診斷及檢測。
本發明的一種檢測甘蔗褐銹病菌或黃銹病菌的PCR方法，包括基因組DNA的提取、 PCR檢測體系建立和PCR擴增產物的檢測，其特征在于1、PCR檢測體系的建立PCR擴增體系為總體積25μ 1，內含2. 5 μ I 10XPCR緩沖液，2. 5 μ I 25 mmol/L MgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP，10 μ mol/L 的檢測引物 PCR-F 和 PCR-R 各1. O μ 1，1. 25 U Taq DNA Polymerase, 20-30 ng 基因組 DNA，ddH20 補足到 25 μ I ;PCR擴增程序如下94 V 4 min ；94 V I min, 56 V 45 S，72 V I min，35 個循環； 72 0C 8 min ;所述 10XPCR 緩沖液組成成分為 100 mmol/L pH8. 5 Tris_HCl，500 mmol/L KCl和15 mmol/L MgCl2 ;所述檢測引物如下PCR-F :5，- GAGCATCAAGGAAAGTAGCAA -3/，PCR-R :5’- GAAGATGGTTCGAGCCACAATT -3’ ；2、PCR擴增產物的檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測的PCR擴增圖譜中，在分子量為585bp 的位置出現DNA條帶,為甘鹿褐銹病菌存在的標志；在分子量為606 bp的位置出現DNA條帶，為甘蔗黃銹病菌存在的標志。
本發明的應用效果本發明的一種檢測甘蔗褐銹病菌或黃銹病菌的PCR方法，具有靈敏度高、效率高和所需要的DNA用量少的特點；與常規的根據病菌培養后的孢子形態特征鑒定或根據田間種植后病害表型癥狀鑒定的方法相比，具有操作簡便快速、準確性高和實用性好等優點。
1、操作簡便快速應用本發明方法，提取待檢測植株DNA、PCR擴增和常規瓊脂糖凝膠電泳即可判定檢測結果，無須對病原菌進行培養或田間種植鑒定，一般檢測過程可在 5 6小時完成。
2、準確性高傳統的甘蔗褐銹病菌和黃銹病菌檢測技術是根據病原物孢子的形態特征或者根據田間種植后病害表型癥狀鑒定來確定檢疫對象，無法排除人為因素`的干擾， 很難區分形態相似種或容易受環境條件的影響，從而導致準確性不高；同時，形態學檢測在近緣菌內的不同種之間可區別的特征較少，有些甚至沒有什么差異，同時還需要判斷者具有豐富的知識和經驗，方可作出準確的判斷。而本發明根據甘蔗褐銹病菌和黃銹病菌的特異性序列，選擇甘蔗褐銹病菌和黃銹病菌共同的一段保守序列設計特異引物，根據變異序列設計特異性引物進行擴增比較，為病原菌的檢測和鑒定提供準確的靶標位點。經過與甘蔗褐銹病菌和黃銹病菌以及其它不同植物中近緣病原菌的比較，該引物的準確率高。
3、高效、實用性好直接從待檢測甘蔗品種中檢測甘蔗褐銹病菌或黃銹病菌具有重要的實際應用價值，兩種病菌的同時檢測則顯得更為高效。目前，在甘蔗品種及其種質資源交換過程中，甘蔗褐銹病菌和黃銹病菌的檢測方法是根據病菌培養物所產生孢子的形態特征鑒定或根據田間種植后病害表型癥狀鑒定，無法滿足快速檢疫的需要。為了使我們的檢疫方法具有實際的應用價值，我們采用直接從待檢測甘蔗品種中提取DNA后直接進行 PCR擴增，可在5 6小時內同時完成對甘蔗褐銹病菌和黃銹病菌的檢測。因此本方法大大提聞了檢測的效率。
本發明為甘蔗褐銹病菌和黃銹病菌的鑒定，提供了高靈敏度和高效率的快速檢測體系，可用于田間甘蔗褐銹病菌和黃銹病菌的早期診斷及檢測，對抗褐銹病或抗黃銹病甘蔗育種和抗褐銹病或抗黃銹病甘蔗種質資源的保護具有重要的意義。
圖1為使用甘蔗PCR-F和PCR-R檢測引物鑒定5個待檢測甘蔗品種中是否受甘蔗褐銹病菌或黃銹病菌侵染(即是否含有甘蔗褐銹病菌或黃銹病菌)的PCR擴增圖譜。其中各泳道中，M代表分子量標準；(代表以水作為模板的空白對照；PM代表對應甘蔗品種中含有甘蔗褐銹病菌；PK代表對應甘蔗品種中含有甘蔗黃銹病菌；Ν代表對應甘蔗品種中既不含有甘蔗褐銹病菌，也不含有甘蔗黃銹病菌；1-5代表5個甘蔗品種。圖1中，甘蔗品種I和 2在分子量為585 bp的位置出現DNA條帶，說明受甘蔗褐銹病菌侵染；甘蔗品種3和4在分子量為606 bp的位置出現DNA條帶，說明受甘蔗黃銹病菌侵染；甘蔗品種5在分子量為 585 bp和606 bp的位置未出現DNA條帶，說明未受甘蔗褐銹病菌或甘蔗黃銹病菌的侵染。
具體實施方式
為了進一步闡明本發明而不是限制本發明，以下結合實施例加以說明。
實施例1 一種檢測甘蔗褐銹病菌或黃銹病菌的PCR方法一種檢測甘蔗褐銹病菌或黃銹病菌的PCR方法，包括以下步驟1、基因組DNA的提取(1)取5g待檢測甘蔗植株的葉片組織，置研缽，加入液氮磨碎成粉末，并在解凍前轉入 50 ml的離心管中；(2)加入15ml,65 °C預熱的SDS提取液，混勻后在65 1水浴保溫40 min ；(3)加8 ml 3 mol/L KAC 混勻后，冰浴 30 min ；(4)25000 g，4 °C離心，20 min ;收集上清液，并加入12 ml于4 1預冷的異丙醇；(5)-20°C放置30 min后,鉤出漂浮在液面的DNA,置于1. 5 ml離心管中，晾干后加入 750 μ I TE溶液；加等體積的平衡飽和酚，搖勻，12000 g，4 °C離心，10 min ；(6)轉移上清至另一支1.5 ml離心管中，加等體積的氯仿，12000 g,4 °C ,離心10 min 后移出上層水相；(7)在水相中加2倍體積的無水乙醇，12000g，4 °C離心10 min，留沉淀，用體積濃度為70 %的乙醇清洗2次，并晾干；(8)加滅菌后的TE溶液200μ I溶解后，置-20 1冰箱中保存備用。
2、PCR檢測體系的建立PCR擴增體系為總體積25 μ 1，內含2. 5 μ I 10XPCR緩沖液，2. 5 μ I 25 mmol/L MgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP, 10 μ mol/L 的檢測引物 PCR-F 和 PCR-R各1. 0 μ I,1. 25 U Taq DNA Polymerase, 20-30 ng待檢測甘蔗品種基因組DNA，ddH20 補足到25 μ I。
PCR擴增程序如下94 0C 4 min ；94 °C I min, 65 °C 45 s，72 °C I min，35個循環；72 0C 8 min ；所述檢測引物PCR-F和PCR-R，是采用ITS-PCR技術，經過大量的篩選試驗，獲得了甘蔗褐銹病菌和黃銹病菌共有的特異DNA片段，以此片段的DNA序列為基礎，設計一對檢測甘蔗褐銹病菌或黃銹病菌的檢測引物。所述檢測弓I物PCR-F和PCR-R具體如下PCR-F :5，- GAGCATCAAGGAAAGTAGCAA -3/，PCR-R :5’- GAAGATGGTTCGAGCCACAATT -3’。
3、PCR擴增產物的檢測具體的檢測方法為，取PCR擴增產物10 μ 1，加5 μ I上樣緩沖液，混勻后點樣于含有O.5 μ g/ml溴化乙錠的1. 5 % (m/V)瓊脂糖凝膠上，于O. 5 X TBE緩沖液中，10 V/cm恒定電壓下電泳1. 5 h，結束后在凝膠成像系統上成像并進行凝膠分析。
PCR產物的檢測結果采用檢測引物PCR-F和PCR-R對待檢測甘蔗品種的基因組 DNA樣品進行PCR擴增，結果如圖1所示，受甘蔗褐銹病菌侵染(即含有甘蔗褐銹病節的甘蔗樣品出現585 bp的DNA條帶，受甘蔗黃銹病菌侵染(即含有甘蔗黃銹病菌)的甘蔗樣品出現606 bp的DNA條帶，而既沒有受甘蔗褐銹病菌侵染也沒有受甘蔗黃銹病菌侵染的甘蔗樣品則不出現585 bp的DNA條帶或者606 bp的DNA條帶。
我們取5個待檢測甘蔗品種用PCR檢測和病原菌分離培養后的形態特征判別方法鑒定的結果進行比較，結果是一致的。如圖1所示，出現分子量為585 bp的DNA條帶的甘蔗品種，經病原菌培養后的孢子形態特征鑒定均含甘蔗褐銹病菌，出現分子量為606 bp的 DNA條帶的甘蔗品種，經病原菌培養后的孢子形態特征鑒定均含甘蔗黃銹病菌；既未出現分子量為585 bp的DNA條帶，也沒有出現分子量為606 bp的DNA條帶的甘蔗品種，經病原菌培養后的孢子形態特征鑒定結果顯示均不含甘蔗褐銹病菌和黃銹病菌。
本發明采用的主要試劑如下(所有化學試劑均為分析純)1、SDS提取液NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO41. 44 g、KH2 PO4 0. 24 g、SDS 2 g、甘油 50 ml,滅菌去離子I L, pH值7· 4 ;2、TE溶液10 mmol/L Tris-HCl, I mmol/L EDTA ；3、上樣緩沖液0.1 %溴酚藍，40 %蔗糖；4、0.5 X TBE 緩沖液44. 5 mmol/L Tris, 50 mmol/L HBO3,1 mmol/L EDTA ；5、1.5 % (m/V)瓊脂糖凝膠1. 5g 瓊脂糖，100 ml ddH20 ；6、溴化乙錠試劑購自上海生工生物工程技術有限公司、PCR擴增試劑購自大連寶生物公司。
本發明所使用的儀器主要如下1、PCR擴增儀德國Eppendorf 5331 PCR擴增儀；2、電泳儀北京六一儀器 廠DYCZ-20ADNA序列分析電泳儀；3、離心機德國Eppendorf5810/5810R多功能臺式離心機；4、凝膠成像系統美國BIO-RADGel Doc 2000凝膠成像系統。以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
權利要求
1.一種檢測甘蔗褐銹病菌或黃銹病菌的PCR方法，包括基因組DNA的提取、PCR檢測體系建立和PCR擴增產物的檢測，其特征在于(1)PCR檢測體系的建立PCR擴增體系為總體積25 μ 1，內含2. 5 μ I 10XPCR緩沖液，2. 5 μ I 25 mmol/L MgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP, 10 μ mol/L 的檢測引物 PCR-F 和 PCR-R 各1. O μ 1，1. 25 U Taq DNA Polymerase, 20-30 ng 基因組 DNA，ddH20 補足到 25 μ I ;PCR 擴增程序如下94 V 4 min ；94 V I min，56 V 45 s，72 V I min，35 個循環； 72 °C 8 min ;所述 10XPCR 緩沖液組成成分為 100 mmol/L pH8. 5 Tris_HCl，500 mmol/L KCl和15 mmol/L MgCl2 ;所述檢測引物如下PCR-F :5，- GAGCATCAAGGAAAGTAGCAA -3/，PCR-R :5’- GAAGATGGTTCGAGCCACAATT -3’ ；(2)PCR擴增產物的檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測的PCR擴增圖譜中，在分子量為585bp 的位置出現DNA條帶，為甘鹿褐銹病菌存在的標志；在分子量為606 bp的位置出現DNA條帶，為甘蔗黃銹病菌存在的標志。
全文摘要
本發明涉及一種檢測甘蔗褐銹病菌或黃銹病菌的PCR方法，包括基因組DNA的提取、PCR檢測體系建立和PCR擴增產物的檢測。本發明的一種檢測甘蔗褐銹病菌或黃銹病菌的PCR方法，具有靈敏度高、效率高和所需要的DNA用量少的特點；與常規的根據病菌培養后的孢子形態特征鑒定或根據田間種植后病害表型癥狀鑒定的方法相比，具有操作簡便快速、準確性高、高效和實用性好等優點。為甘蔗褐銹病菌和黃銹病菌的鑒定，提供了高靈敏度和高效率的快速檢測體系，可用于田間甘蔗褐銹病菌和黃銹病菌的早期診斷及檢測，對抗褐銹病或抗黃銹病甘蔗育種和抗褐銹病或抗黃銹病甘蔗種質資源的保護具有重要的意義。
文檔編號C12R1/645GK103060456SQ20131001570
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月16日 優先權日2013年1月16日
發明者闕友雄, 郭晉隆, 張玉葉, 許莉萍, 黃寧, 羅俊, 高世武, 陳如凱 申請人:福建農林大學