專利名稱：一種煙草野火病病菌分離方法
技術領域：
本發明屬于農業微生物分離技術領域，具體涉及一種操作簡便、快捷，適合于田間作業條件下采集病菌的煙草野火病病菌分離方法。
背景技術：
煙草野火病(tobacco wild fire)是世界煙草生產中危害較嚴重的細菌病害之一，也是我國煙草的主要病害之一。野火病主要為害葉片，也能侵害花、蒴果和種子。葉上癥狀初為水潰狀圓形褪色的小斑點，后來斑點擴大，中心變成褐色，周圍有一圈很寬的黃綠色暈環，于幼苗期或氣候潮濕時最為明顯，直徑可達f 2厘米。煙草受害后，一般發病率1(Γ30%，嚴重地塊發病率7(Γ100%，能夠導致絕收。要實現煙草野火病抗病品種選育、病害的控制都與病菌小種的分化、群體遺傳的多樣性密切相關，因此煙草野火病病菌分離是最基本的工作。目前，煙草野火病的分離多采用組織破碎法進行，選取病組織表面消毒后，破碎組織，稀釋涂布或劃線分離。這種方法在有效去除病組織表面腐生微生物的同時，也殺滅了大量的目標病菌，致使大量的病樣難以分離到病菌，分離效率比較低下，浪費了大量標本。為此，開發一種操作簡便、快捷，適合于田間作業條件下采集病菌的煙草野火病病菌分離方法，對于煙草野火病防治工作是非常必要的。
發明內容
本發明的目的在于提供了一種操作簡便、快捷，適合于田間作業條件下采集病菌的煙草野火病病菌分離方法。本發明的目的是這樣實現的，包括以下步驟:
Α、選擇病斑:選典型煙草野火病病株，取干燥、干凈病葉，將其上的病斑沿病健交界處剪下；
B、收集噴菌液:將病斑的中心點切成“+ ”或“米”字形切口，病斑置于凹玻片的凹槽邊緣、切口位于凹槽1/3 1/2處；在凹槽中滴加15(Γ300μ 無菌水，蓋上蓋玻片，選取有噴菌現象的凹玻片收集噴菌液；
C、分離擴繁:在無菌條件下將噴菌液5倍或10倍倍比梯度稀釋，取稀釋53~5或103~5倍的稀釋液10(Γ200 μ L涂布于KMB培養基平板，在24 28°C下培養48 72h ；
D、菌落選取:取培養基平板置于紫外光下觀察，選擇綠色熒光的單菌落；蘸取大小相當、形態相似的有綠色熒光的1(Γ15個單菌落，加入到滅菌蒸餾水中，配成1(T 107CFU/mL的菌懸液；用帶針頭的針管吸取菌懸液，將菌懸液接種到煙草樣本植株上，接種位置是煙苗葉片背面的葉肉，每株接種7、個點，每個點接種0.Γ0.2mL ;然后在24 28°C下恒溫培養，每12h光照/黑暗交替一次，相對濕度大于80%，如此培養7天后形成褐色枯死病斑和淡黃色暈圈的即為目標菌落。
本發明根據煙草野火病病菌能局限于發病死體組織中的特性，以葉片上的病斑作為分離煙草野火病病菌的基礎材料，不經過表面消毒，利用細菌的噴菌現象，病菌從完整的病組織釋放，以收集到噴菌液實現分離擴繁。本發明收集噴菌液可以在田間采樣時進行，不必回到實驗室，能夠減少雜菌污染，也提高了工作效率；本發明的分離效率高、病樣用量少，與普通組織破碎法分離比較，可以節約3(Γ50%的病樣標本；本發明的分離的純度高，病菌在噴菌液中處于優勢，分離純化一步到位，減少了轉代的次數，保持了病菌野生型特性，特別是對保持病菌的致病力有利。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但不以任何方式對本發明加以限定，任何基于本發明的技術思路的等同替換，均落入本發明的保護范圍。本發明所述的方法包括以下步驟:
Α、選擇病斑:選典型煙 草野火病病株，取干燥、干凈病葉，將其上的病斑沿病健交界處剪下；
B、收集噴菌液:將病斑的中心點切成“+ ”或“米”字形切口，病斑置于凹玻片的凹槽邊緣、切口位于凹槽1/3 1/2處；在凹槽中滴加15(Γ300μ 無菌水，蓋上蓋玻片，選取有噴菌現象的凹玻片收集噴菌液；
C、分離擴繁:在無菌條件下將噴菌液5倍或10倍倍比梯度稀釋，取稀釋53~5或103~5倍的稀釋液10(Γ200 μ L涂布于KMB培養基平板，在24 28°C下培養48 72h ；
D、菌落選取:取培養基平板置于紫外光下觀察，選擇綠色熒光的單菌落；蘸取大小相當、形態相似的有綠色熒光的1(Γ15個單菌落，加入到滅菌蒸餾水中，配成1(T 107CFU/mL的菌懸液；用帶針頭的針管吸取菌懸液，將菌懸液接種到煙草樣本植株上，接種位置是煙苗葉片背面的葉肉，每株接種7、個點，每個點接種0.Γ0.2mL ;然后在24 28°C下恒溫培養，每12h光照/黑暗交替一次，相對濕度大于80%，如此培養7天后形成褐色枯死病斑和淡黃色暈圈的即為目標菌落。C步驟所述的KMB培養基按以下配比制備:懌蛋白胨20g、磷酸氫二鉀1.5g、七水硫酸鎂1.5g或硫酸鎂0.738g、甘油10ml、瓊脂17 20g，加蒸餾水至1000ml，調整pH值至
7.0 7.2。D步驟所述的煙草樣本植株為易感病品種K326、G28、紅花大金元或云煙85生長至6 7片真葉時的植株。D步驟所述的接種點選擇于側脈之間，接種點間距為1.(Tl.5cm。所述的煙草野火病菌分離方法還包括目標菌落保存操作，取D步驟確定的目標菌落放入保存液中，配制成10卜107CFU/mL的菌懸液，在-2(T-70°C下保存；所述的保存液為15^40%的甘油蒸餾水溶液。本發明的工作原理:
本發明根據煙草野火病病菌能局限于發病死體組織中的特性，以葉片上的病斑作為分離煙草野火病病菌的基礎材料，不經過表面消毒，利用細菌的噴菌現象，病菌從完整的病組織釋放，以收集到噴菌液實現分離擴繁。實施例1
按懌蛋白胨20g、磷酸氫二鉀1.5g、七水硫酸鎂1.5g、甘油10ml、瓊脂17g配比,加蒸懼水至1000ml，調整pH值至7.0,制備KMB培養基。
實施例2
按懌蛋白胨20g、磷酸氫二鉀1.5g、硫酸鎂0.738g、甘油10ml、瓊脂20g配比，加蒸餾水至1000ml，調整pH值至7.2，制備KMB培養基。實施例3
按懌蛋白胨20g、磷酸氫二鉀1.5g、七水硫酸鎂1.5g、甘油10ml、瓊脂19g配比,加蒸懼水至1000ml，調整pH值至7.1，制備KMB培養基。實施例4
選典型煙草野火病病株，取干燥、干凈病葉，將其上的病斑沿病健交界處剪下；將病斑的中心點切成“ + ”字形切口，病斑置于凹玻片的凹槽邊緣、切口位于凹槽1/3處；在凹槽中滴加150 μ L無菌水，蓋上蓋玻片，選取有噴菌現象的凹玻片收集噴菌液；在無菌條件下將噴菌液5倍倍比梯度稀釋，取稀釋53倍的稀釋液100 μ L涂布于實施例1制備的KMB培養基平板上，在24 28°C下培養48h ;取培養基平板置于紫外光下觀察，選擇綠色熒光的單菌落；蘸取大小相當、形態相似的有綠色熒光的10個單菌落，加入到滅菌蒸餾水中，配成IO6 107CFU/mL的菌懸液 ；用帶針頭的針管吸取菌懸液，將菌懸液接種到煙草樣本K326植株上，接種位置是煙苗葉片背面的葉肉，接種點選擇于側脈之間，間距1.(Tl.5cm，每株接種7個點，每點接種0.1mL ;然后在24 28°C下恒溫培養，每12h光照/黑暗交替一次，相對濕度82%，如此培養7天后形成褐色枯死病斑和淡黃色暈圈的即為目標菌落。實施例5
選典型是煙草野火病病株，取干燥、干凈病葉，將其上的病斑沿病健交界處剪下；將病斑的中心點切成“米”字形切口，病斑置于凹玻片的凹槽邊緣、切口位于凹槽1/2處；在凹槽中滴加300 μ L無菌水，蓋上蓋玻片，選取有噴菌現象的凹玻片收集噴菌液；在無菌條件下將噴菌液10倍倍比梯度稀釋，取稀釋IO3倍的稀釋液200 μ L涂布于實施例2制備的KMB培養基平板上，在24 28°C下培養72h ;取培養基平板置于紫外光下觀察，選擇綠色熒光的單菌落；蘸取大小相當、形態相似的有綠色熒光的15個單菌落，加入到滅菌蒸餾水中，配成IO6 107CFU/mL的菌懸液；用帶針頭的針管吸取菌懸液，將菌懸液接種到煙草樣本云煙85植株上，接種位置是煙苗葉片背面的葉肉，選擇側脈間距1.(Tl.5厘米的位點，每株接種9個點，每點接種0.2mL ;然后在24 28°C下恒溫培養，每12h光照/黑暗交替一次，相對濕度83%，如此培養7天后形成褐色枯死病斑和淡黃色暈圈的即為目標菌落。實施例6
選典型是煙草野火病病株，取干燥、干凈病葉，將其上的病斑沿病健交界處剪下；將病斑的中心點切成“ + ”字形切口，病斑置于凹玻片的凹槽邊緣、切口位于凹槽1/3處；在凹槽中滴加200 μ L無菌水，蓋上蓋玻片，選取有噴菌現象的凹玻片收集噴菌液；在無菌條件下將噴菌液5倍倍比梯度稀釋，取稀釋55倍的稀釋液150 μ L涂布于實施例3制備的KMB培養基平板上，在24 28°C下培養60h ;取培養基平板置于紫外光下觀察，選擇綠色熒光的單菌落；蘸取大小相當、形態相似的有綠色熒光的12個單菌落，加入到滅菌蒸餾水中，配成IO6 107CFU/mL的菌懸液；用帶針頭的針管吸取菌懸液，將菌懸液接種到煙草樣本G28植株上，接種位置是煙苗葉片背面的葉肉，選擇側脈間距1.(Tl.5厘米的位點，每株接種8個點，每點接種0.15mL ;然后在24 28°C下恒溫培養，每12h光照/黑暗交替一次，相對濕度84%，如此培養7天后形成褐色枯死病斑和淡黃色暈圈的即為目標菌落。
實施例7
選典型是煙草野火病病株，取干燥、干凈病葉，將其上的病斑沿病健交界處剪下；將病斑的中心點切成“ + ”字形切口，病斑置于凹玻片的凹槽邊緣、切口位于凹槽1/2處；在凹槽中滴加250 μ L無菌水，蓋上蓋玻片，選取有噴菌現象的凹玻片收集噴菌液；在無菌條件下將噴菌液10倍倍比梯度稀釋，取稀釋IO5倍的稀釋液180 μ L涂布于實施例2制備的KMB培養基平板上，在24 28°C下培養54h ;取培養基平板置于紫外光下觀察，選擇綠色熒光的單菌落；蘸取大小相當、形態相似的有綠色熒光的11個單菌落，加入到滅菌蒸餾水中，配成106^107CFU/mL的菌懸液；用帶針頭的針管吸取菌懸液，將菌懸液接種到煙草樣本紅花大金元植株上，接種位置是煙苗葉片背面的葉肉，選擇側脈間距1.(Tl.5厘米的位點，每株接種7個點，每點接種0.2mL ;然后在24 28°C下恒溫培養，每12h光照/黑暗交替一次，相對濕度81%，如此培養7天后形成褐色枯死病斑和淡黃色暈圈的即為目標菌落。實施例8
將實施例4選擇的目標菌落放入保存液中，配制成IO6 107CFU/mL的菌懸液，在_20°C下保存，保存液為15%的甘油蒸餾水溶液。實施例9
將實施例5選擇的目標菌落放入保存液中，配制成IO6 107CFU/mL的菌懸液，在_70°C下保存，保存液為40%的甘油蒸餾水溶液。實施例10
將實施例7選擇的目標菌落放入保存液中，配制成IO6 107CFU/mL的菌懸液，在_45°C下保存，保存液為30%的甘油蒸餾水溶液。實施例11
將實施例4選擇的目標菌落放入保存液中，配制成IO6 107CFU/mL的菌懸液，在_30°C下保存，保存液為15%的甘油蒸餾水溶液。實施例12
將實施例6選擇的目標菌落放入保存液中，配制成IO6 107CFU/mL的菌懸液，在_60°C下保存，保存液為35%的甘油蒸餾水溶液。
權利要求
1.一種煙草野火病病菌分離方法，其特征在于包括以下步驟: A、選擇病斑:選典型煙草野火病病株，取干燥、干凈病葉，將其上的病斑沿病健交界處剪下； B、收集噴菌液:將病斑的中心點切成“+ ”或“米”字形切口，病斑置于凹玻片的凹槽邊緣、切口位于凹槽1/3 1/2處；在凹槽中滴加15(Γ300μ 無菌水，蓋上蓋玻片，選取有噴菌現象的凹玻片收集噴菌液； C、分離擴繁:在無菌條件下將噴菌液5倍或10倍倍比梯度稀釋，取稀釋53~5或103~5倍的稀釋液10(Γ200 μ L涂布于KMB培養基平板，在24 28°C下培養48 72h ； D、菌落選取:取培養基平板置于紫外光下觀察，選擇綠色熒光的單菌落；蘸取大小相當、形態相似的有綠色熒光的1(Γ15個單菌落，加入到滅菌蒸餾水中，配成1(T 107CFU/mL的菌懸液；用帶針頭的針管吸取菌懸液，將菌懸液接種到煙草樣本植株上，接種位置是煙苗葉片背面的葉肉，每株接種7、個點，每個點接種0.Γ0.2mL ;然后在24 28°C下恒溫培養，每12h光照/黑暗交替一次，相對濕度大于80%，如此培養7天后形成褐色枯死病斑和淡黃色暈圈的即為目標菌落。
2.根據權利要求1所述的煙草野火病病菌分離方法，其特征在于C步驟所述的KMB培養基按以下配比制備:懌蛋白胨20g、磷酸氫二鉀1.5g、七水硫酸鎂1.5g或硫酸鎂0.738g、甘油10ml、瓊脂17 20g，加蒸餾水至1000ml，調整pH值至7.0 7.2。
3.根據權利要求1所述的煙草野火病病菌分離方法，其特征在于D步驟所述的煙草樣本植株為易感病品種K326、G28、紅花大金元或云煙85生長至6 7片真葉時的植株。
4.根據權利要求1所述的煙草野火病病菌分離方法，其特征在于D步驟所述的接種點選擇于側脈之間，接種點間距為1.(Tl.5cm。
5.根據權利要求1所述的煙草野火病病菌分離方法，其特征在于還包括目標菌落保存操作，取D步驟確定的目標菌落放入保存液中，配制成IO6 107CFU/mL的菌懸液，在-2(T-70°C下保存；所述的保存液為15 40%的甘油蒸餾水溶液。
全文摘要
本發明公開了一種煙草野火病菌分離方法，選典型煙草野火病病株，取干燥、干凈病葉，將其上的病斑沿病健交界處剪下；將病斑的中心點切成“+”或“米”字形切口，病斑置于凹玻片的凹槽邊緣、切口位于凹槽1/3~1/2處；在凹槽中滴加150~300μL無菌水，蓋上蓋玻片，選取有噴菌現象的凹玻片收集噴菌液；在無菌條件下將噴菌液5倍或10倍倍比梯度稀釋，取稀釋53~5或103~5倍的稀釋液100~200μL涂布于KMB培養基平板，在24~28℃下培養48~72h；在紫外光下選擇有綠色熒光的單菌落，經致病力測定，形成褐色枯死病斑和淡黃色暈圈的即為目標菌落。本發明集分離、純化、鑒定為一體，分離病菌效率高、準確性強，適用于田間采樣的及時分離，分離病菌的純度高，保持了病菌野生型特性。
文檔編號C12N1/20GK103173393SQ201310087788
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月19日 優先權日2013年3月19日
發明者方敦煌, 陳學軍, 李永平, 肖炳光, 秦西云 申請人:云南省煙草農業科學研究院