專利名稱：一種利用傳代成纖維細胞生產雞新城疫活疫苗的方法
技術領域：
本發明涉及一種雞新城疫活疫苗的制備方法，特別涉及一種通過利用傳代成纖維細胞生產雞新城疫活疫苗的方法，屬于疫苗制備領域。
背景技術：
新城疫(Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒 (Newcastle disease virus,NDV)引起的一種急性、高度接觸性禽類傳染病，對養禽業危害極大，被國際獸醫局列為A類傳染病。NDV只有1個血清型，但根據其毒力的不同，可以分為強毒株、中等毒力株和弱毒株。強毒株又可稱為速發型毒株，中等毒力株為中發型毒株，弱毒株為緩發型毒株。根據其對不同組織器官的侵嗜性又可將有毒力的毒株分為嗜內臟和嗜神經型毒株，前者主要引起消化道出血等損害，后者導致的疾病主要表現為神經癥狀和呼吸道損傷。我國于1948年首次分離到NDV，盡管我國新城疫免疫接種已經普及多年并已基本上控制了典型新城疫的流行，但非典型ND仍時有發生，嚴重威脅著養雞業的健康發展。目前疫苗是控制本病發生的重要手段。自從1940開始，就在全球范圍內使用新城疫疫苗，最為成功的疫苗是由緩發型病毒株和經過精心篩選的某些中發型病毒株組成的新城疫活病毒疫苗。滅活苗自70年代開始應用，分單純滅活苗和油乳劑滅活苗，目前應用較多的是油乳劑滅活苗。油乳劑滅活苗可以產生堅強而持久的免疫力，不會通過疫苗的使用而擴散病原。我國目前常用的弱毒疫苗是I系，La Sota疫苗，V4疫苗。最近幾年，隨著細胞培養技術的發展，細胞苗和克隆苗相繼問世。克隆苗具有抗原性純一，免疫原性強的特點。我國從美國引進的克隆N-79株型LaSota弱毒株，從I系中挑選出的克隆-30及克隆-83是具有良好免疫原性而且遺傳性非常穩定的弱毒疫苗。細胞苗具有成本低容易生產的特點，而傳代細胞可避免雞源性潛在疾病的感染。成纖維細胞是結締組織最主要的細胞成分，它是由胚胎時期的間充質細胞分化而來，在分泌細胞外基質成分和構建細胞外基質中扮演著十分重要的角色，在組織創傷修復過程中也發揮著重要的作用。由于成纖維細胞相對容易獲得，而且增殖能力強，適應性強，具有良好的耐受性，性狀比較穩定，不易發生轉化。正是具備以上的特點，使得成纖維細胞除了應用于細胞和分子生物學的研究，還被廣泛應用于病毒學研究領域，同時也是疫苗生產的重要細胞資源。但目前市售的I系活疫苗絕大部分來源于雞胚組織苗，因為利用現有的原代成纖維細胞生產工藝所生產的I系病毒原液，病毒滴度不穩定，批間差異較大。故此，針對原代成纖維細胞產毒不穩定這一現狀，本發明在進行了大量實驗研究的基礎上，得出了本發明
發明內容
針對上述存在的問題，本實驗通過采用雞胚成纖維細胞傳代技術，并應用于生實踐，將傳代成纖維細胞替代原代成纖維細胞。本發明的目的是通過以下技術方案實現的本發明的一種利用傳代成纖維細胞生產雞新城疫活疫苗的方法，其特征在于以傳代后的成纖維細胞作為病毒株接種細胞進行細胞毒液的制備。本發明的一種利用傳代成纖維細胞生產雞新城疫活疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟(1)消化對長成單層的原代雞胚成纖維細胞進行消化處理；(2)凍存經步驟(1)消化處理后的原代雞胚成纖維細胞移入液氮罐中保存；(3)復蘇將步驟( 凍存后的細胞定期復蘇，檢查細胞的存活率，加入DMEM培養液中進行培養，待細胞完全貼壁即可使用；(4)傳代對步驟(3)得到的細胞進行傳代培養；(5)制苗用細胞毒液的制備將病毒株接種經步驟(4)傳代培養后的雞胚成纖維細胞，接毒后置36 37°C繼續培養，觀察細胞病變，當75%以上的細胞出現圓縮、折光率變強等病變時，將細胞培養瓶置低溫凍結，再融化后收獲細胞培養物于滅菌容器內，放_15°C以下保存備用；(6)制苗將有效量的步驟(5)得到的細胞毒液加入佐劑制成所述的雞新城疫活疫苗。在本發明的一個具體實施例中，所述的步驟(1)中消化處理具體包括以下步驟(1)在顯微鏡下觀察長成單層的原代雞胚成纖維細胞，待80%鋪滿便可經行消化；(2)棄去細胞瓶中的培養液，按細胞瓶容量10%的比例加入0. 01mol/L PBS，輕輕平行晃動培養瓶，洗去殘留的培養液，再緩慢地吸出清洗液，棄之，重復此操作3次；(3)向清洗過的細胞瓶中加入0. 25%的胰酶消化液，添加量為細胞瓶容量的1%。加完后立即放入37°C水浴中進行消化0. 5 aiiin。待細胞完全脫落后，立即向其加入細胞瓶容量的體積的胎牛血清，混勻，以中止胰酶的消化作用。(4)在向培養瓶中加入細胞瓶容量10%體積的含10%胎牛血清的DMEM培養液，混勻，倒入滅菌的離心管中，2000r/min離心15min，棄上清。(5)重復步驟0)3次。在本發明的一個具體實施例中，所述的步驟O)中的凍存是指將步驟O)消化處理后的原代雞胚成纖維細胞用含10% DMSO的DMEM培養液重新懸浮，分裝于凍干管中，Iml/管，細胞密度要不低于1 2X106/ml，4°C放置20min，_80°C過夜后，移入液氮罐中保存。在本發明的一個具體實施例中，所述的步驟(3)中復蘇時從液氮罐中取出原代雞胚成纖維細胞的凍干管后迅速放入37°C水浴中融化，融化后從水浴中取出放置冰盒上，然后加入DMEM培養液中進行培養，待細胞完全貼壁即可使用。在本發明的一個具體實施例中，所述的步驟中細胞的傳代培養具體包括以下步驟(1)在顯微鏡下觀察長成單層的雞胚成纖維細胞，待80%鋪滿便可經行消化；(2)棄去細胞瓶中的培養液，按細胞瓶容量的10%的比例加入0. 01mol/L PBS，輕輕平行晃動培養瓶，洗去殘留的培養液，再緩慢地吸出清洗液，棄之，重復此操作3次；(3)向清洗過的細胞瓶中加入0. 25%的胰酶消化液，添加量為細胞瓶容量的1%。加完后立即放入37°C水浴中進行消化0. 5 aiiin。待細胞完全脫落后，立即向其加入體積的胎牛血清，混勻，以中止胰酶的消化作用；(4)在向培養瓶中加入細胞瓶容量30%體積的含10%胎牛血清的DMEM培養液，混勻，另取2個相同規格培養瓶，每培養瓶中加入細胞瓶容量10%體積的細胞懸液；(5)至37°C培養48h 72h，待細胞貼壁長成單層即可使用。在本發明的一個具體實施例中，所述的步驟(5)中將病毒株用細胞維持液做適當稀釋后，按細胞液體積的0. 接種經步驟(4)傳代培養后的雞胚成纖維細胞，將PH調至7. 2。在本發明的一個具體實施例中，所述的病毒株為雞新城疫I系弱毒株。更優選的，所述的病毒株為雞新城疫病毒中等毒力株Mukteswar株。本發明的一種利用傳代成纖維細胞生產雞新城疫活疫苗的方法，保證了在細胞環境相對一致的情況下，接種雞新城疫I系病毒，為病毒的增殖提供了穩定的生長條件，縮小了產品的批間差異，提升了產品品質，保證了疫苗質量的穩定性。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。實施例1雞新城疫活疫苗的制備一、材料菌株雞新城疫病毒中等毒力株Mukteswar株(I系)購自中國獸醫藥品監察所，雞胚成纖維細胞為哈藥集團生物疫苗有限公司研發中心制備、傳代和保存試劑胎牛血清和DMEM購自hvitrogen GIBC0、胰酶購自Amresco、二甲基亞砜購自 sigma二、雞新城疫活疫苗的制備方法1.細胞的制備1. 1 消化1. 1. 1在顯微鏡下觀察長成單層的雞胚成纖維細胞，待80%鋪滿便可經行消化。1. 1.2棄去細胞瓶中的培養液，按細胞瓶容量10%的比例加入O.Olmol/L PBS，輕輕平行晃動培養瓶，洗去殘留的培養液，再緩慢地吸出清洗液，棄之。重復此操作3次。1. 1. 3向清洗過的細胞瓶中加入0. 25 %的胰酶消化液，添加量為細胞瓶容量的1%。加完后立即放入37°C水浴中進行消化0.5 aiiin。待細胞完全脫落后，立即向其加入細胞瓶容量的體積的胎牛血清，混勻，以中止胰酶的消化作用。1. 1. 4在向培養瓶中加入細胞瓶容量10%體積的含10%胎牛血清的DMEM培養液，混勻，倒入滅菌的離心管中，2000r/min離心15min，棄上清。1.1. 5 重復 1.1. 4 步驟 3 次。
1. 2 凍存沉淀用含10% DMSO(二甲基亞砜)的DMEM培養液重新懸浮，分裝于凍干管中，Iml/管，細胞密度要不低于1 2X106/ml，4°C放置20min，_80°C過夜后，移入液氮罐中保存。1. 3 復蘇細胞凍存后定期復蘇，檢查細胞的存活率，復蘇時從液氮罐中取出凍干管后迅速放入37°C水浴中融化，融化后從水浴中取出放置冰盒上，然后加入DMEM培養液中進行培養，待細胞完全貼壁即可使用。1. 4 傳代1. 4. 1在顯微鏡下觀察長成單層的雞胚成纖維細胞，待80%鋪滿便可經行消化。1. 4. 2棄去細胞瓶中的培養液，按細胞瓶容量的10%的比例加入PBS，輕輕平行晃動培養瓶，洗去殘留的培養液，再緩慢地吸出清洗液，棄之。重復此操作3次。1.4.3向清洗過的細胞瓶中加入0.25%的胰酶消化液，添加量為細胞瓶容量的1%。加完后立即放入37°C水浴中進行消化0.5 aiiin。待細胞完全脫落后，立即向其加入體積的胎牛血清，混勻，以中止胰酶的消化作用。1. 4. 4在向培養瓶中加入細胞瓶容量30%體積的含10%胎牛血清的DMEM培養液，混勻，另取2個相同規格培養瓶，每培養瓶中加入細胞瓶容量10%體積的細胞懸液。1. 4. 5至37°C培養48h 72h，待細胞貼壁長成單層即可使用。2制苗用細胞毒液的制備2. 1接種將雞新城疫I系中等毒力Mukteswar株用細胞維持液稀釋100倍，按細胞液量的0. 接毒，將PH調至7. 2。2. 2培養和觀察接毒后置37°C繼續培養，觀察細胞病變。2. 3收獲當75%以上的細胞出現圓縮、折光率變強等病變時，將細胞培養瓶置低溫凍結，再融化后收獲細胞培養物于滅菌容器內，每若干瓶為一組，放_15°C以下保存備用。保存時間不超過2個月。3半成品檢驗3. 1無菌檢驗雞胚毒液或細胞毒液每組分別取樣，應無菌生長。3. 2雞胚液紅細胞凝集價測定每組分別取樣，測定紅細胞凝集價，應> 1 64 (微量法)。3. 3病毒含量測定從每組分別取樣，等量混合，以0. 01mol/L PBS稀釋至10-6 10-8，各接種10日齡SPF雞胚5個，每胚、尿囊腔內接種0. lml。記錄雞胚在M 72小時死亡、胎兒有明顯病痕者，計算ELD50，每0. Iml病毒含量> 107. 0ELD50者，方可用于配苗。4配苗及分裝將檢驗合格的若干組細胞毒液混合于同一容器內，按規定羽份加一定比例的凍干保護劑(甘氨酸0. 1% (w/w)、硫代硫酸鈉1% (w/w)、蔗糖5% (w/w)、脫脂乳5% (w/w)),充分混合后，定量分裝，每羽份病毒含量應> 105.0ELD50。分裝后迅速進行冷凍真空干燥。實施例2雞新城疫活疫苗的免疫效果為了驗證新方法的生產性能，故在沿用《規程》用雞胚制備雞新城疫I系活疫苗的同時，還采用新方法用雞胚成纖維細胞制備了 10批I系活疫苗，現將其中一些指標的比較結果總結如下按《規程》生產方法如下制苗用細胞毒液的制備1、接種將雞新城疫I系弱毒株用細胞維持液稀釋100倍，按原代雞胚成纖維細胞細胞液量的0. 接毒，將PH調至7. 2。2、培養和觀察接毒后置36 37°C繼續培養，觀察細胞病變。3、收獲當75%以上的細胞出現圓縮、折光率變強等病變時，將細胞培養瓶置低溫凍結，再融化后收獲細胞培養物于滅菌容器內，每若干瓶為一組，放_15°C以下保存備用。保存時間不超過2個月。4半成品檢驗4. 1無菌檢驗雞胚毒液或細胞毒液每組分別取樣，應無菌生長。4. 2雞胚液紅細胞凝集價測定每組分別取樣，測定紅細胞凝集價，應> 1 64(微量法)。4. 3病毒含量測定從每組分別取樣，等量混合，以滅菌生理鹽水稀釋至10-6 10-8，各接種10日齡SPF雞胚5個，每胚、尿囊腔內接種0. lml。記錄雞胚在M 72小時死亡、胎兒有明顯病痕者，計算ELD50，每0. Iml病毒含量> 107. 0ELD50者，方可用于配苗。5配苗及分裝將檢驗合格的若干組細胞毒液混合于同一容器內，按規定羽份加一定比例的5%蔗糖脫脂牛奶做穩定劑。同時加入適宜的抗生素，充分混合后，定量分裝，每羽份病毒含量應> 105.0ELD50。分裝后迅速進行冷凍真空干燥。按新的生產方法與按《規程》生產方法生產的疫苗比較，如表1-5所示表1兩種生產方法半成品紅細胞凝集價比較表
權利要求
1.一種利用傳代成纖維細胞生產雞新城疫活疫苗的方法，其特征在于以傳代后的成纖維細胞作為病毒株接種細胞進行細胞毒液的制備。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步驟(1)消化對長成單層的原代雞胚成纖維細胞進行消化處理；(2)凍存經步驟(1)消化處理后的原代雞胚成纖維細胞移入液氮罐中保存；(3)復蘇將步驟( 凍存后的細胞定期復蘇，檢查細胞的存活率，加入DMEM培養液中進行培養，待細胞完全貼壁即可使用；(4)傳代對步驟( 得到的細胞進行傳代培養；(5)制苗用細胞毒液的制備將病毒株接種經步驟(4)傳代培養后的雞胚成纖維細胞，接毒后置36 37°C繼續培養，觀察細胞病變，當75%以上的細胞出現圓縮、折光率變強等病變時，將細胞培養瓶置低溫凍結，再融化后收獲細胞培養物于滅菌容器內，放_15°C以下保存備用；(6)制苗將有效量的步驟( 得到的細胞毒液加入佐劑制成所述的雞新城疫活疫苗。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟(1)中消化處理具體包括以下步驟(1)在顯微鏡下觀察長成單層的原代雞胚成纖維細胞，待80%鋪滿便可經行消化；(2)棄去細胞瓶中的培養液，按細胞瓶容量10%的比例加入O.Olmol/LPBS，輕輕平行晃動培養瓶，洗去殘留的培養液，再緩慢地吸出清洗液，棄之，重復此操作3次；(3)向清洗過的細胞瓶中加入0.25%的胰酶消化液，添加量為細胞瓶容量的1%;加完后立即放入37°C水浴中進行消化0. 5 aiiin ；待細胞完全脫落后，立即向其加入細胞瓶容量的體積的胎牛血清，混勻，以中止胰酶的消化作用；(4)在向培養瓶中加入細胞瓶容量10%體積的含10%胎牛血清的DMEM培養液，混勻，倒入滅菌的離心管中，2000r/min離心15min，棄上清；(5)重復步驟(4)3次。
4.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟O)中的凍存是指將步驟(2)消化處理后的原代雞胚成纖維細胞用含10% DMSO的DMEM培養液重新懸浮，分裝于凍干管中，Iml/管，細胞密度要不低于1 2X106/ml，4°C放置20min，_80°C過夜后，移入液氮罐中保存。
5.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟(3)中復蘇時從液氮罐中取出原代雞胚成纖維細胞的凍干管后迅速放入37°C水浴中融化，融化后從水浴中取出放置冰盒上，然后加入DMEM培養液中進行培養，待細胞完全貼壁即可使用。
6.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟中細胞的傳代培養具體包括以下步驟(1)在顯微鏡下觀察長成單層的雞胚成纖維細胞，待80%鋪滿便可經行消化；(2)棄去細胞瓶中的培養液，按細胞瓶容量的10%的比例加入O.Olmol/LPBS，輕輕平行晃動培養瓶，洗去殘留的培養液，再緩慢地吸出清洗液，棄之，重復此操作3次；(3)向清洗過的細胞瓶中加入0.25%的胰酶消化液，添加量為細胞瓶容量的；加完后立即放入37°C水浴中進行消化0. 5 aiiin ；待細胞完全脫落后，立即向其加入1 %體積的胎牛血清，混勻，以中止胰酶的消化作用；(4)在向培養瓶中加入細胞瓶容量30%體積的含10%胎牛血清的DMEM培養液，混勻，另取2個相同規格培養瓶，每培養瓶中加入細胞瓶容量10%體積的細胞懸液；(5)至37°C培養4 72h，待細胞貼壁長成單層即可使用。
7.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟(5)中將病毒株用細胞維持液做適當稀釋后，按細胞液體積的0. 接種經步驟(4)傳代培養后的雞胚成纖維細胞，將PH調至7. 2。
8.如權利要求1、2或7所述的方法，其特征在于所述的病毒株為雞新城疫I系弱毒株。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于所述的病毒株為雞新城疫病毒中等毒力株Mukteswar 株。
全文摘要
本發明公開了一種利用傳代成纖維細胞生產雞新城疫活疫苗的方法，其特征在于克服現有的原代成纖維細胞生產工藝所生產的I系病毒原液，病毒滴度不穩定，批間差異較大的缺陷，通過使用傳代成纖維細胞代替原代成纖維細胞作為病毒接種細胞，進行病毒的增值。本發明的一種利用傳代成纖維細胞生產雞新城疫活疫苗的方法，保證了在細胞環境相對一致的情況下，接種雞新城疫I系病毒，為病毒的增殖提供了穩定的生長條件，縮小了產品的批間差異，提升了產品品質，保證了疫苗質量的穩定性。
文檔編號C12N7/00GK102380093SQ201110327710
公開日2012年3月21日 申請日期2011年10月25日 優先權日2011年10月25日
發明者丁國杰, 姜力, 孫德君, 張楊, 王彬, 袁明霞 申請人:哈藥集團生物疫苗有限公司