專利名稱：一種產葡萄糖氧化酶的黑曲霉及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種產葡萄糖氧化酶的黑曲霉及其應用，屬于微生物技術領域。
背景技術：
葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，簡稱G0D，Ε. C. 1. 1. 3. 4)是一種黃素糖蛋白。葡萄糖氧化酶分子為二聚體，含有兩個亞基，分子量約160kDa，每亞基結合一個FAD分子，因此每個酶分子含有兩個FAD分子。它是一種需氧脫氫酶，以氧為電子接受體，能專一地氧化β-D-葡萄糖為葡萄糖酸和過氧化氫。葡萄糖氧化酶由于具有催化專一性和高效性的優點，在食品、化工、醫藥、農業、飼料等領域有比較廣泛的應用。由于葡萄糖氧化酶良好的應用效果，目前已經在很多行業中得到了廣泛應用，近年來倍受關注，市場需求量也越來越大。
發明內容
本發明提供了一種用于葡萄糖氧化酶生產的黑曲霉，該菌株于2011年8月16日保藏于中國典型培養物保藏中心，地址中國武漢、武漢大學，保藏編號=CCTCC NOM201U91，分類學命名黑曲霉 BBE11721 (Aspergillus niger BBE11721)。上述黑曲霉的篩選方法，包括如下步驟1)定性篩選采用Fiedure. K. J顯色法，將分離出黑曲霉菌株點種于平板分離培養基，28°C培養3 4d后直至出現藍色顏色圈，進行藍色圈大小定性比對。所述平板分離培養基組成如下葡萄糖40g ΙΛ蛋白胨2g L—1，，氯化鉀0. 5g L—1，碳酸鈣3. 5g L—1，可溶性淀粉IOg L-1，KI 1.7g ΙΛ脫氧膽酸鈉0.2g ΙΛ瓊脂20g L—1，磷酸緩沖液0. Imol ΛρΗ5. 6 ；2)定量篩選將黑曲霉菌絲體破壁上清液中加入2. 5mL鄰聯茴香胺溶液，0. 3mL的18%葡萄糖，0. ImL的L—1辣根過氧化物酶，35°C保溫^iin后，向試管中加入稀釋好的酶液樣品0. ImL,反應;3min后，加入2mol Γ1硫酸終止反應，取出試管，測0D540的吸光值，以熱失活的酶液做空白對照。根據標準曲線的結果，計算葡萄糖氧化酶活力單位。所述Imol L-1磷酸緩沖液(ρΗ6· 0)將132mL的Imol L-1磷酸氫二鉀(K2HPO4)和868ml的lmol L—1磷酸二氫鉀(KH2PO4)混合，調整pH值到6. 0，過濾滅菌，常溫保存。所述鄰聯茴香胺溶液0. Ig鄰聯茴香胺，溶于IOmL甲醇，為儲存液，4°C保存，實驗前取0. Iml儲存液，溶于12mL的0. Imol pH 6. 2的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中；所述磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液0. 2mol Γ1磷酸氫二鈉溶液330. 5mL與0. Imol L—1檸檬酸緩沖液169. 5mL混合，調整pH值到6. 2，去離子水定容至1L，常溫保存。經定性定量篩選后，獲得一株黑曲霉BBE11721，發酵96小時后葡萄糖氧化酶活可達2. 2 Umr1，對酶的熱穩定性進行了分析，將酶液分別置于40°C、45°C、50°C、55°C、60°C下，每隔10分鐘取樣測定酶活。40°C與45°C下，60分鐘酶活沒有下降。50°C與55°C下，30分鐘降到原有酶活的80%，60分鐘降到60%。60°C下，30分鐘降到降到原有酶活的65%，60分鐘降到50%。
本發明提供的黑曲霉具有葡萄糖氧化酶產量高的優點，經優化搖瓶產量可達4. 6UmL—1 ；該菌株分泌的葡萄糖氧化酶可耐受較高溫度，粗酶液40°C、45°C條件下，60分鐘酶活沒有損失，60°C條件下30分鐘降到降到原有酶活的65%，60分鐘降到50%。
圖1 葡萄糖氧化酶活標準曲線圖2 黑曲霉BBE11721的系統發育樹圖3 采用所篩菌株在平板分離培養基上的顯色效果4 黑曲霉BBE11721發酵過程曲線圖5 :40°C水浴中黑曲霉BBE11721產葡萄糖氧化酶的熱穩定性圖6 :55°C水浴中黑曲霉BBE11721產葡萄糖氧化酶的熱穩定性圖7 :60°C水浴中黑曲霉BBE11721產葡萄糖氧化酶的熱穩定性
具體實施例方式實施例1產葡萄糖氧化酶菌株的定量篩選方法(一)樣品來源采樣來源為富含淀粉的土壤。(二)培養方法將采樣所得上壤，取土壤樣品5g，加入45mL的無菌水(含50u慶大霉素)中，搖床培養 QOOr mirT1)。斜面培養恒溫，培養4d后置于4°C冰箱保存備用。搖床培養250mL搖瓶50mL裝量，恒溫，旋轉搖床QOOr mirT1)，培養4d。(三)定性篩選方法采用Fiedure. K. J顯色法，將富集培養后的土壤懸液稀釋到10_4，分離出黑曲霉菌株。再將其點種于平板分離培養基培養3 4d后出現藍色顏色圈，挑取顏色圈較大的的菌株接種至斜面培養。實施例2 產萄萄糖氧化酶的黑曲霉的定量篩選方法(一 )實驗試劑0. Imol L-1 磷酸氫二鈉-0. 05mol L-1 檸檬酸緩沖液(ρΗ6· 2) :0. 2mol L-1 磷酸氫二鈉溶液330. 5mL與0. Imol L-1檸檬酸緩沖液169. 5mL混合，調整pH值到6. 2，去離子水定容至1L，常溫保存。Imol Γ1 磷酸緩沖液(ρΗ6· 0)將 132mL 的 Imol Γ1 磷酸氫二鉀(K2HPO4)和 868ml的lmol L—1磷酸二氫鉀(KH2PO4)混合，調整pH值到6. 0，過濾滅菌，常溫保存。鄰聯茴香胺溶液0. Ig鄰聯茴香胺，溶于IOmL甲醇，為儲存液，4°C保存，實驗前取0. Iml儲存液，溶于12mL的0. Imol pH 6. 2的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中。( 二 )酶活測定方法將黑曲霉菌絲體破壁上清液中加入2. 5mL鄰聯茴香胺溶液，0. 3mL的18%葡萄糖，0. ImL的90U πιΓ1辣根過氧化物酶，35°C保溫^iin后，向試管中加入稀釋好的酶液樣品0. lmL，反應;3min后，加入2mol Γ1硫酸終止反應，取出試管，測0D540的吸光值，以熱失活的酶液做空白對照。根據標準曲線的結果，計算葡萄糖氧化酶活力單位。以上海生工葡萄糖氧化酶做為標準品。將葡萄糖氧化酶標準品稀釋成0. 4,0. 8，1. 2，1. 6,2. 0,2. 4U mL—1，在試管中加入2. 5mL鄰聯茴香胺溶液，0. 3mL的18% D-葡萄糖和0. ImL的90U mL—1辣根過氧化物酶溶液，35°C保溫2min，加入0. ImL稀釋好的葡萄糖氧化酶標準品，反應^iin后加入2mL的2mol L—1硫酸終止反應，在MOnrn下測定反應液吸光值。如下表1葡萄糖氧化酶標準曲線
權利要求
1.一種黑曲霉，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC N0:M201U91，分類學命名黑曲霉 BBE11721 (Aspergillus niger BBE11721)。
2.—種權利要求1所述黑曲霉的篩選方法，其特征在于，具體步驟如下、1)定性篩選采用Fiedure.K. J顯色法，將分離出黑曲霉菌株點種于平板分離培養基，培養3 4d后直至出現藍色顏色圈，進行藍色圈大小定性比對；、2)定量篩選將黑曲霉菌絲體破壁上清液中加入2.5mL鄰聯茴香胺溶液，0. 3mL的18%葡萄糖，0. ImL的90U ml/1辣根過氧化物酶，35°C保溫^iin后，向試管中加入稀釋好的酶液樣品0. ImL,反應;3min后，加入2mol Γ1硫酸終止反應，取出試管，測0D540的吸光值，以熱失活的酶液做空白對照，根據標準曲線的結果，計算葡萄糖氧化酶活力單位。
3.權利要求1所述黑曲霉在葡萄糖氧化酶發酵生產中的應用。
4.根據權利要求3所述方法，其特征在于，發酵培養基組成如下葡萄糖80gL—1，蛋白胨3g L—1，磷酸二氫鉀2g L—1，七水合硫酸鎂0. TgL—1，氯化鉀0. 5g L—1，硝酸鈉4g L—1，碳酸鈣、3. 5g ΛρΗ 自然。
全文摘要
本發明公開了一種產葡萄糖氧化酶的黑曲霉及其應用，屬于微生物技術領域。本發明篩選得到一株黑曲霉，發酵96小時葡萄糖氧化酶活可達2.2UmL-1，于2011年8月16日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC NOM2011291，分類學命名黑曲霉BBE11721(Aspergillus niger BBE11721)。本發明提供的黑曲霉具有葡萄糖氧化酶產量高的優點，經優化搖瓶產量可達4.6UmL-1；該菌株分泌的葡萄糖氧化酶可耐受較高溫度，粗酶液40℃、45℃條件下，60分鐘酶活沒有損失，60℃條件下30分鐘降到降到原有酶活的65％，60分鐘降到50％。
文檔編號C12Q1/32GK102382773SQ20111032942
公開日2012年3月21日 申請日期2011年10月26日 優先權日2011年10月26日
發明者劉瑋, 堵國成, 張娟, 沈伊娜, 費麗杰, 陳堅, 顧磊 申請人:江南大學