專利名稱：纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶復合酶及其制備方法
技術領域：
本發明涉及微生物發酵領域，具體涉及一種液態混合菌發酵纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的方法。
背景技術：
纖維質原料中纖維素、半纖維素、木質素分別占30 40%、15 30%、10 20%。 纖維素作為植物光合作用的主要多糖類產物，是地球上最為豐富的可再生性天然資源。據估計，地球上纖維素中所蘊藏的能量大約相當于6400億噸的石油所含的能量，而且纖維素的可再生性是石油等礦質能源所不可比擬的。充分利用纖維素酶處理纖維素，有可能從根本上解決人類所面臨的能源與糧食問題，其深遠影響是不可低估的。然而，目前約80%纖維素未被開發利用，具有極為誘人的前景。纖維素酶的生產和其它酶制劑一樣，主要有固體發酵和液體深層發酵兩種，國內外在這方面做了許多有價值的工作。固體發酵法是以玉米等農作物秸稈為主要原料，其投資少，工藝簡單，產品價格低廉，目前國內絕大部分纖維素酶生產廠家均采用該技術生產纖維素酶。但是固體發酵法存在著一定的缺陷，以秸稈為原料的固體發酵法生產的纖維素酶自動化程度低，勞動強度大，產品質量不穩定。因此，隨著液體發酵酶工藝的發展及菌種性能的提高，采用液體發酵法生產纖維酶素是必然趨勢。木聚糖在植物細胞壁中的含量僅次于纖維素，是半纖維素中含量最豐富的一種。 木聚糖是由D-木糖主鏈(以0_1，4鍵相連)和L-阿拉伯糖分枝(a-l，2和a-l，3相連) 所組成的聚合物。半纖維素木聚糖在木質組織中占總量的50%，它結合在纖維素微纖維的表面，并且相互連接，這些纖維構成了堅硬的細胞相互連接的網絡。這種堅硬的網絡阻礙了纖維素酶對纖維素吸附，從而影響了纖維素的降解速率。在天然纖維素水解成葡萄糖的過程中，必須依靠3種組分的協同作用才能完成。 纖維素大分子首先在C1酶和Cx酶的作用下逐步降解成纖維二糖，而纖維二糖酶則進一步將纖維二糖水解成2個葡萄糖。由于高濃度的纖維二糖對C1酶和Cx酶活力有強烈的抑制作用，而在低濃度時則是纖維素酶的誘導物，如果纖維素酶復合組分中缺乏纖維二糖酶組分就會嚴重影響纖維素的降解速率。
發明內容
本發明的目的在于提供一種纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的復合酶及其制備方法。本發明提供的纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的復合酶的制備方法，其為將制備的綠色木霉液體種子和黑曲霉液體種子先后接入發酵培養基中發酵生產纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的復合酶。在本發明的一個實施方案中，先將綠色木霉液體種子以體積比1 5%的接種量接種后發酵3 8天后，以體積比1 5%的接種量接入黑曲酶液體種子，再共同發酵3 8天。優選的，先將綠色木霉液體種子以體積比5%的接種量接種后發酵3 8天后，以體積比3%的接種量接入黑曲酶液體種子，再共同發酵3 8天。其中，所述的發酵培養基為液體培養基。優選的發酵培養基含有微晶纖維素 20-30wt %、玉米漿5-10wt %、尿素5-10wt %、硫酸銨5_10wt %、磷酸氫二鉀5_10wt %、硫酸鎂 Tween800. l_lwt%，其余為水。本發明中，優選的發酵條件為pH維持在5 7，溫度25 30°C，轉速200 400 轉/min，罐壓0. 05 0. 15Mpa，通風比(發酵液體積氣體體積)1 0. 5 1 1.5。其中，用于培養綠色木霉液體種子的種子培養基含有葡萄糖3-5wt%、玉米漿 2-4wt %、尿素l_3wt %、硫酸銨%、磷酸氫二鉀%，硫酸鎂0. 5-lwt %，其余組分為水。用于培養黑曲霉液體種子的種子培養基含有麩皮3-5wt%、尿素l-3wt%、硝酸銨 l-3wt%、磷酸二氫鉀l_3wt%、碳酸鈣l_3wt%，其余組分為水。本發明中，綠色木霉液體種子的制備方法如下將綠色木霉的孢子接入液體種子培養基中，20 30°C培養48小時。黑曲霉液體種子的制備方法如下將黑曲霉孢子接入液體種子培養基中，20 30°C培養48小時。本發明中，所述的綠色木霉優選為綠色木霉CGMCC 3. 3744，所述的黑曲霉優選為黑曲霉 CGMCC 3. 3150。本發明的關鍵點在于所得酶系豐富，各酶之間相互協同作用，促進酶活增加。用單一綠色木霉菌種發酵所得到纖維素酶活為20IU/ml，用單一黑曲霉菌種發酵所得到木聚糖酶酶活1000IU/ml，纖維二糖酶酶活50IU/ml，采用本技術混菌發酵后增加至纖維素酶活 50IU/ml，木聚糖酶酶活4000IU/ml，纖維二糖酶酶活400IU/ml。本發明中纖維素酶的測定方法用0. Ig濾紙作為底物，加0. 9mL pH4. 8檸檬酸緩沖液，再加 0. ImL粗酶離心上清液，50°C恒溫水浴搖床反應30min，用3，5- 二硝基水楊酸法測定生成的還原糖，以葡萄糖為標準糖，以每分鐘生成ι μ mol還原糖所需的酶量定義成一個纖維素酶酶活力單位(IU)。液體發酵好的醪液離心取上清液即為粗酶液。檸檬酸緩沖液為21g無水檸檬酸、7. 8g氫氧化鈉加蒸餾水定容至2L，pH為4. 8。還原糖測定方法采用DNS法，以葡萄糖為標準。木聚糖酶的測定方法是用0. 2g木聚糖作為底物，加0. 9mL pH4. 8檸檬酸緩沖液， 再加0. ImL粗酶稀釋液，50°C恒溫水浴搖床反應30min，用3，5- 二硝基水楊酸法測定生成的還原糖，以木糖為標準糖，以每分鐘生成1 μ mol還原糖所需的酶量定義成一個木聚糖酶酶活力單位(IU)。液體發酵好的醪液離心取上清液即為粗酶液。檸檬酸緩沖液為21g無水檸檬酸、7. 8g氫氧化鈉加蒸餾水定容至2L，pH為4. 8。還原糖測定方法采用DNS法，以木糖為標準。固體培養基水分測定水分測定儀測定。纖維二糖酶的測定方法是在小試管中加入Iml酶液，再加入Iml 二糖底物，用橡皮塞封口。試管放入50°C水浴中，預熱5min，保溫30min后終止反應。一個纖維二糖酶活力國際單位定義為標準反應條件下，每分鐘生成2 μ mol葡萄糖的酶量。液體發酵好的醪液離心取上清液即為粗酶液。檸檬酸緩沖液為21g無水檸檬酸、7. Sg氫氧化鈉加蒸餾水定容至 2L, pH 為 4. 8。
本發明中，黑曲霉能高產木聚糖酶和纖維二糖酶，而綠色木霉生產木聚糖酶和纖維二糖酶的能力較弱，生產纖維素酶的能力較強。而纖維素的水解需要多種酶的協同作用， 故在發酵過程中，通過木聚糖酶對木聚糖的水解可以降低其和纖維素的連接，從而增加了纖維素酶對纖維素吸附，從而提高了纖維素的利用率，使發酵液中的糖含量有所增加。而纖維二糖酶則水解產生纖維二糖，會使纖維二糖的含量在發酵過程中處于低濃度水平，從而誘導纖維素酶降解纖維素。最終使發酵液中的纖維素酶酶活增加，同時聯產木聚糖酶和纖維二糖酶。在發酵罐中進行培養，生產出同時含有纖維素酶、木聚糖酶、纖維二糖酶的液體復合酶。該方法生產的液體、生產周期短、成本低、質量穩定。本發明提供的纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的復合酶在造紙、紡織等各種需要纖維素預處理的環節中均可以應用。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例1以綠色木霉(CGMCC 3. 3744，購自中科院微生物所)為單一菌種的發酵培養基含有微晶纖維素20wt%、玉米漿5wt%、尿素10wt%、硫酸銨5wt%、磷酸氫二鉀5wt%、其余為水。選擇長勢良好的綠色木霉菌種斜面，輕輕挑取斜面孢子接入含有121°C 30min滅菌的綠色木霉液體種子培養基的種子瓶中，扎好8層紗布，30°C下190轉經4 搖床培養。 其中，所述的種子培養基含葡萄糖日襯^^玉米漿-丨^^尿素3wt%、硫酸銨2wt%、磷酸氫二鉀2wt%，硫酸鎂lwt%，其余組分為水。培養結束后接入70%裝液量的30L發酵罐中按 5%接種量進行發酵，控制pH 6、溫度30°C、轉速200轉/min、罐壓0. 05Mpa、通風1 1.4。 維持條件不變發酵培養7天，得到纖維素酶活為20IU/ml。實施例2以黑曲霉(CGMCC 3. 3150，購自中科院微生物所)為單一菌種的發酵培養基含有 玉米漿5wt %、尿素IOwt %、磷酸氫二鉀5wt %、硫酸鎂5wt %和Tween801.0wt%,其余為水。選擇長勢良好的黑曲霉菌種斜面，輕輕挑取斜面孢子接入含121°C 30min滅菌的黑曲霉液體種子培養基的種子瓶中，扎好8層紗布，30°C下210轉經4 搖床培養。其中， 黑曲霉液體種子培養基含麩皮5wt%、尿素^^^、硝酸銨；？襯^^磷酸二氫鉀Iwt %、碳酸鈣 3wt%，其余組分為水。培養結束后按3%接種量接入70%裝液量的30L發酵罐中進行發酵，控制PH 5、溫度30°C、轉速300轉/min、罐壓0.05Mpa、通風1 1。維持條件不變發酵培養5天，得到木聚糖酶酶活為1000IU/ml，纖維二糖酶酶活為50IU/ml。實施例3制備發酵培養基微晶纖維素30wt%、玉米漿5wt%、尿素IOwt %、硫酸銨5wt%、 磷酸氫二鉀10wt%、硫酸鎂5 丨％和Tween801. 0wt%，其余為水。選擇長勢良好的綠色木霉(CGMCC 3.3744)菌種斜面，輕輕挑取斜面孢子接入含有121°C 30min滅菌的綠色木霉液體種子培養基的種子瓶中，扎好8層紗布，30°C下190轉經4 搖床培養。其中，所述的種子培養基含葡萄糖5wt %、玉米漿%、尿素3wt %、硫酸銨2wt%、磷酸氫二鉀2wt%，硫酸鎂lwt%，其余組分為水。培養結束后按3%接種量接入 70%裝液量的30L發酵罐中進行發酵，控制pH5、溫度30°C、轉速200轉/min、罐壓0. 05Mpa、通風1 1.4。選擇長勢良好的黑曲霉菌種斜面，輕輕挑取斜面孢子接入含12rC30min滅菌的黑曲霉液體種子培養基的種子瓶中，扎好8層紗布，30°C下210轉經4 搖床培養。其中，黑曲霉液體種子培養基含麩皮5wt%、尿素^^^、硝酸銨；？襯^^磷酸二氫鉀lwt%、碳酸鈣3wt%，其余組分為水。待綠色木霉發酵3天后按3%接種量接入黑曲霉(CGMCC3. 3150) 液體種子，維持原條件不變繼續發酵培養5天。得到纖維素酶活為50IU/ml，木聚糖酶酶活為3000IU/ml，纖維二糖酶酶活為300IU/ml。實施例4制備發酵培養基微晶纖維素20wt%、玉米漿8wt%、尿素5wt%、硫酸銨7wt%、磷酸氫二鉀5wt%、硫酸鎂Tween800. 6wt%，其余為水。選擇長勢良好的綠色木霉(CGMCC 3.3744)菌種斜面，輕輕挑取斜面孢子接入含有121°C 30min滅菌的綠色木霉液體種子培養基的種子瓶中，扎好8層紗布，30°C下190轉經4 搖床培養。其中，所述的綠色木霉種子培養基含葡萄糖3wt%、玉米漿2wt%、尿素 Iwt %、硫酸銨%、磷酸氫二鉀%，硫酸鎂0. 5wt %，其余組分為水。培養結束后按5 % 接種量接入70%裝液量的30L發酵罐中進行發酵，控制pH 6、溫度^TC、轉速300轉/min、 罐壓0.07Mpa、通風比1 1.2。選擇長勢良好的黑曲霉菌種斜面，輕輕挑取斜面孢子接入含121°C 30min滅菌的黑曲霉液體種子培養基的種子瓶中，扎好8層紗布，30°C下210轉經 4 搖床培養。其中，黑曲霉液體種子培養基含麩皮3wt%、尿素3wt%、硝酸銨lwt%、磷酸二氫鉀3wt %、碳酸鈣Iwt %，其余組分為水。待綠色木霉發酵3天后按1 %接種量接入黑曲霉(CGMCC 3.3150)(購自中科院微生物所)液體種子，維持原條件不變繼續發酵培養4天。 得到纖維素酶活為50IU/ml，木聚糖酶酶活為4000IU/ml，纖維二糖酶酶活為400IU/ml。實施例5制備發酵培養基微晶纖維素25wt%、玉米漿10wt%、尿素6wt%、硫酸銨10wt%、 磷酸氫二鉀7wt%、硫酸鎂10 丨％和Tween800. lwt%，其余為水。選擇長勢良好的綠色木霉(CGMCC 3.3744)菌種斜面，輕輕挑取斜面孢子接入含有121°C 30min滅菌的綠色木霉液體種子培養基的種子瓶中，扎好8層紗布，30°C下190轉經4 搖床培養。其中，所述的綠色木霉種子培養基含葡萄糖#丨％、玉米漿3wt%、尿素 2wt %、硫酸銨3wt %、磷酸氫二鉀3wt %，硫酸鎂0. 8wt %，其余組分為水。培養結束后按5 % 接種量接入70%裝液量的30L發酵罐中進行發酵，控制pH 7、溫度、轉速400轉/min、 罐壓0.09Mpa、通風1 1.3。選擇長勢良好的黑曲霉菌種斜面，輕輕挑取斜面孢子接入含 121°C 30min滅菌的黑曲霉液體種子培養基的種子瓶中，扎好8層紗布，30°C下210轉經4 搖床培養。其中，黑曲霉液體種子培養基含麩皮^t %、尿素2wt %、硝酸銨2wt %、磷酸二氫鉀2wt %、碳酸鈣2wt %，其余組分為水。待綠色木霉發酵3天后按3 %接種量接入黑曲霉 (CGMCC 3.3150)液體種子，維持原條件不變繼續發酵培養4天。得到纖維素酶活為40IU/ ml，木聚糖酶酶活為4500IU/ml，纖維二糖酶酶活為400IU/ml。實施例6制備發酵培養基微晶纖維素30wt%、玉米漿5wt%、尿素IOwt %、硫酸銨6wt%、 磷酸氫二鉀9 丨％、硫酸鎂6 丨％和Tween800. ，其余為水。選擇長勢良好的綠色木霉(CGMCC 3.3744)菌種斜面，輕輕挑取斜面孢子接入含有121°C 30min滅菌的綠色木霉液體種子培養基的種子瓶中，扎好8層紗布，30°C下190轉經4 搖床培養。其中，所述的綠色木霉種子培養基含葡萄糖3wt%、玉米漿3wt%、尿素 2wt%、硫酸銨2wt%、磷酸氫二鉀#t%，硫酸鎂lwt%，其余組分為水。培養結束后按5% 接種量接入70%裝液量的30L發酵罐中進行發酵，控制pH 7、溫度、轉速400轉/min、 罐壓0. 13Mpa、通風1 1.5。選擇長勢良好的黑曲霉菌種斜面，輕輕挑取斜面孢子接入含 121°C 30min滅菌的黑曲霉液體種子培養基的種子瓶中，扎好8層紗布，30°C下210轉經4 搖床培養。其中，黑曲霉液體種子培養基含麩皮5wt %、尿素2wt %、硝酸銨3wt %、磷酸二氫鉀lwt%、碳酸鈣3wt%，其余組分為水。待綠色木霉發酵3天后按5%接種量接入黑曲霉 (CGMCC 3.3150)液體種子，維持原條件不變繼續發酵培養4天。得到纖維素酶活為40IU/ ml，木聚糖酶酶活為4000IU/ml，纖維二糖酶酶活為400IU/ml。 以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的復合酶的制備方法，其特征在于，將制備的綠色木霉液體種子和黑曲霉液體種子先后接入發酵培養基中發酵生產纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的復合酶。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，先將綠色木霉液體種子以體積比1 5%的接種量接種后發酵3 8天后，以體積比為1 5%的接種量接入黑曲霉液體種子，再共同發酵3 8天。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，先將綠色木霉液體種子以體積比5% 的接種量接種后發酵3 8天后，以體積比為3%的接種量接入黑曲霉液體種子，再共同發酵3 8天。
4.根據權利要求1 3任一項所述的制備方法，其特征在于，所述的發酵培養基含有微晶纖維素20-30wt%、玉米漿5-10wt%、尿素5-10wt%、硫酸銨5_10wt %、磷酸氫二鉀 5-10wt%、硫酸鎂 5-10wt%iP Tween800. l_lwt%，其余為水。
5.根據權利要求1 3任一項所述的制備方法，其特征在于，所述的發酵條件為pH 維持在5 7，溫度25 30°C，轉速200 400轉/min，罐壓0. 05 0. 15Mpa，通風比 1 0. 5 1 1. 5。
6.根據權利要求1 3任一項所述的制備方法，其特征在于，所述綠色木霉液體種子的種子培養基含有葡萄糖3_5wt %、玉米漿%、尿素l-3wt %、硫酸銨%、磷酸氫二鉀2-#t%，硫酸鎂0. 5-lwt%，其余組分為水。
7.根據權利要求1 3任一項所述的制備方法，其特征在于，所述的黑曲霉液體種子的種子培養基含有麩皮3-5wt%、尿素l-3wt%、硝酸銨l-3wt%、磷酸二氫鉀l-3wt%、碳酸鈣 l-3wt%，其余組分為水。
8.根據權利要求1 3任一項所述的制備方法，其特征在于，所述的綠色木霉為綠色木霉CGMCC 3. 3744，所述的黑曲霉為黑曲霉CGMCC 3.3150。
9.權利要求1 8任一項所述的制備方法制備的纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的復合酶。
10.權利要求9所述的纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的復合酶在纖維素類原料預處理中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶復合酶及其制備方法。本發明提供的纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的復合酶的制備方法，其為將制備的綠色木霉液體種子和黑曲霉液體種子先后接入發酵培養基中發酵生產纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的復合酶。該方法生產的液體復合酶活力高、組分配比合理、生產周期短、成本低、質量穩定。
文檔編號C12R1/885GK102392004SQ201110332000
公開日2012年3月28日 申請日期2011年10月27日 優先權日2011年10月27日
發明者戴嘉, 李榮杰 申請人:安徽豐原發酵技術工程研究有限公司