H1n1、prrsv、o-fmdv四重檢測試劑盒的制作方法

專利名稱：H1n1、prrsv、o-fmdv四重檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測技術領域，特別涉及一種甲型HlNl流感病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒及O型ロ蹄疫病毒四重同步核酸定量檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
甲型HlNl流感病毒為A型流感病毒，正黏病毒科。新分離的病毒多為絲狀，顆粒呈多形性，直徑為80 120nm。病毒粒子有囊膜與纖突，核衣殼螺旋形對稱。基因組由8條單鏈負義分節段RNA片段組成，分別編碼一到兩種蛋白，具體為PB2編碼PB2聚合酶，PBl編碼PBl聚合酶，PA編碼PA聚合酶，HA編碼血凝素HA，NP編碼核蛋白NP，NA編碼神經氨酸酶NA，M編碼基質蛋白Ml、M2，NS編碼非結構蛋白NS1、NS2。每節段兩端均有末端重復 序列，所有節段3’端核苷酸序列相同。5’端有與3’端核苷酸序列互補的保守區段和重復序列。整個基因組約13. 5kp。M為流感病毒的分類依據之一，根據M及NP，流感病毒被分為A、B、C三種類型，而HA則為A型流感病毒的進ー步分類依據之一，根據HA及NA抗原抗性，可將A型流感病毒共分為16中HA亞型及9中NA亞型，因此理論上A型流感病毒存在135中亞型可能性。通過M鑒別A型，HA鑒別H1，理論上可將HlNl特異性的檢測出來。確定目標基因及其相對保守的序列，合成相應的引物探針，達到特異性的檢測甲型HlNl流感病毒的目的。不僅如此，M基因及HA基因編碼的蛋白均為功能性蛋白，如M蛋白可裂解為Ml及M2，Ml蛋白同囊膜結合，其固定支撐作用，而M2蛋白則形成四聚體分部于囊膜內部，可調節病毒PH值從而有利于病毒侵染過程中的基因組釋放，M2對病毒復制過程中調節宿主細胞高爾基體的PH值也具有很大作用。HA為跨膜蛋白，其主要成分位于膜外，以唾液酸(N-こ-神經氨酸)為受體，通過膜融合，介導病毒顆粒進入細胞。因此，研究該基因片段對進一歩深入的研究病毒的致病機理至關重要。甲型HlNl流感病毒雖然是ー種新型病毒，但是病人感染這種病毒后的表現癥狀卻和一般的流感基本相同，因此，很難從癥狀上判斷到底是不是感染了甲型HlNl流感。其癥狀與普通感冒幾乎是ー樣的。從臨床癥狀上基本無法區別，必須得通過實驗室的檢測，才能確診。本發明通過設計針對Matrix基因及血凝素Hl基因的LNA探針及引物，以此來特異性檢測檢測甲型HlNl流感病毒，靈敏度高，特異性強，可大批量檢測。高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒，俗稱豬藍耳病毒，為套式病毒目，動脈炎病毒科、屬，分血清型有美洲型及歐洲型兩種，兩型間核苷酸序列差異較大，而對型內而言，歐洲型較為保守，美洲型變異較大，我國目前流行的為美洲型。PRRSV病毒粒子有囊膜及纖突，直徑50 60nm，基因組為不分節段的單股正義RNA組成，含8個開放閱讀框，點突變率高，存在基因重組現象。目前針對高致病性豬藍耳病毒的核酸檢測，目標基因大致為RNA Pol,0RF5、6、7區域，根據以上HlNl敘述的理由，選定GP5為目標基因，GP5為PRRSV的主要結構蛋白，也是重要的功能性蛋白，該蛋白含病毒的6個抗原決定簇，其中ー個為血清型特異性線性中和決定簇，能在體外中和抗體，是病毒的主要免疫性保護性抗原。良好的免疫原性及反應原性決定了該核酸及蛋白在疫苗研究等方面的重要意義。PRRS是危害養豬業最嚴重的疾病之一，除疾病本身造成危害外，更重要的是PRRSV感染機體，導致機體免疫抑制，致使很多其它病原體(PCV2、鏈球菌、APP和副豬嗜血桿菌、CSFV等)繼發感染或混合感染，從而導致豬場很高的死亡率和較大的經濟損失。根據流行病學、臨床癥狀和病理變化可對高致病性藍耳病做出初步診斷。但確診需要實驗室進行病毒分離鑒定或用分子生物學檢測方法，本研究通過檢測GP5來診斷PRRSV。ロ蹄疫病毒為最早發現的動物過濾性病毒。該病毒為小RNA病毒科，ロ蹄疫病毒屬，共分為七個血清型，及03、(、541'1、54了2、54了3以及Asial。各血清型內還可分為各種亞型，七大血清型間無免疫交叉反應，而血清型內亞型則存在部分交叉反應。病毒粒子無囊膜，直徑為20 30η，病毒基因組為單鏈正義RNA分子。含一大開放閱讀框，分別編碼L蛋白VP4、VP2、VP3、VPl四種結構蛋白，以及2B-3D等非結構蛋白。調查研究表明，針對ロ蹄疫病毒的核酸檢測的目標基因有5’ UTR, 1D，2B，3D等區域，根據項目實施方案，確定檢測ロ蹄疫病毒檢測的目的基因為VP1，該基因編碼的蛋白為功能性蛋白，不僅為主要的結構蛋白，保護病毒遺傳物質免受降解，同時也含病毒主要的抗原位點，以有實驗表明VPl蛋白可有效的誘發實驗動物產生中和抗體，研究該基因具有重要意義。ロ蹄疫病毒抵抗力較強，發 病率幾乎達100%。該病的病程一般呈良性經過，死亡率只有2 3%，有時達5%，犢牛和仔豬以及惡性病型，死亡率可達50 70%。但主要的經濟損失并非動物死亡，而是來自患病期間肉和奶的生產停止，病后肉、奶產量減少，種用價值喪失及產品廢棄，動物的生產性能降低等損失，并引發嚴重的公共衛生安全問題。由于該病傳染性極強，可造成巨大的經濟損失和政治影響。0、A、C型FMDV的毒力和抗原性均易發生變異，這種獨特的演化給防治和消滅ロ蹄疫帶來了一系列復雜問題，致使FMD在ー些國家或地區長期流行。本項目通過檢測VPl基因來特異性的檢測O型ロ蹄疫病毒。根據以上的研究分析，本項目病原體的診斷部分將分別建立四重熒光定量RT-PCR同步檢測甲型HlNl流感病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒以及O型ロ蹄疫病毒，建立四重同步檢測可有效的將幾種病毒存在的混合感染同時檢測出來，以達到省時省力的目的。現有技術中這三種疫病病毒的快速檢測方法如下I、病毒分離法為病毒性疾病診斷最常用以及高度敏感的方法之一。分離出的病毒再經電子顯微鏡、免疫學技術或分子生物學進ー步鑒定。大致操作為獲取病毒分離的樣品、病毒分離操作、接種后觀察或其他方法。分離出的病毒可用于長期保存，抗原性、基因特性或藥物敏感性等分析，但也存在一定的使用限制。目前最常用的分離病毒的組織系一般為MDCK，而雞胚則是最常用的活體。大多數毒株均可適應于該細胞，將病料或其它處理，接種到細胞系上，3 4天可見CPE，表明病毒分離。總體而言，病毒分離認為檢測病毒的ー種經典、準確、敏感的病原學診斷金標準，特異性和敏感性均較高，但較為費時。2、電子顯微鏡技術電鏡已成為病毒研究的常規手段之一，可以很直觀地顯示病毒粒子的形態結構、病毒在寄主細胞內的存在狀態、寄主細胞的結構變化、以及病毒的復制和裝配等過程。電子顯微鏡技術分常規電鏡和免疫電鏡。可用電子顯微鏡直接觀察到新城疫病毒顆粒或感染部位組織。常規電鏡法樣品用量小、制樣速度快、觀察比較直觀，但觀察靈敏度較低，要求樣品的病毒量大。而免疫電鏡法較常規電鏡法的敏感性高，但樣品制備過程較復雜，對操作者的技能要求較高。在此基礎上還研究開發出了ー些新方法及技術，如免疫電子顯微鏡或固相免疫電子顯微鏡，這些方法是利用抗原抗體反應并通過負染色在電子顯微鏡下進行觀察，靈敏度相對提升了許多，但相應的樣品制備過程較復雜，對操作者的技能要求較高。3、血清學實驗血清學檢測方法主要是檢測甲病毒感染過程中產生的抗原抗體免疫標志物，主要包括免疫過氧化物單層試驗(IPMA)、免疫熒光試驗(IFA)、酶免疫法(EIA)和血清中和試驗等。血清學測定的靈敏度高于電子顯微鏡，但其特異性低，實驗室診斷方面局限性較大。此夕卜，由于該技術建立于病毒抗原識別的基礎之上，病毒的抗原多樣性會對該技術的應用產生影響。操作上較為簡單快速，但現有的方法缺乏足夠的敏感性和特異性，如不能準確區分甲型HlNl流感病毒與季節性流感，且不能檢測新變異的毒株。免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA)，廣泛用于疫病病毒診斷，敏感性和特異性 都比較好。可用于病毒抗原檢測、病毒鑒定及血清抗體檢測。間接熒光抗體試驗間接熒光抗體試驗(indirect fluorescent anti-body test, IFA),為標記突光素在抗原抗體上進行抗原抗體反應。新報道的微球免疫法即將利用結合于聚苯こ烯微球的抗體鑒定病毒，敏感性和特異性均相當高，并且，由于該微球系統可發出不同顔色的熒光，因此，理論上可同時檢測100種不同的抗體，且試劑用量極少。該法是國際上檢測疫病病毒陽性抗體通用而且比較敏感的血清檢測方法。IFA特異性可達99%。IFA可以確定抗體的滴度，抗體滴度達到16或20的可以判為陽性。關于ΕΙΑ，其應用最廣的技術為酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體(聚苯こ烯微量反應板)表面，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除，再加底物顯色，最后根據色澤深淺推算待測抗原或抗體的含量。檢測方法分為有多種形式，如間接ELISA、捕捉ELISA、阻斷ELISA、夾心ELISA等。抗原檢測ELISA特異性較強，操作快速簡便，可應用于大批量樣本檢測，并且抗體偵測的反應譜比抗原更廣。而血清中和試驗(serumneutralization test, SNT)，分常量和微量兩種，基本原理為利用完整的病毒來檢測中和抗體，WHO推薦使用微量中和法，其敏感性大大高于血凝抑制(HI)試驗，但中和抗體在血清中出現比較遲，不適用于早期診斷。該法特異性很強，可區別不同毒力的病毒株型。此法是評價豬群免疫保護水平的唯一客觀可信的方法，為經典方法，但操作繁瑣、費時費料，對安全及檢驗技術要求高，現在已較少使用。另外還有SPRIA法、MEIA法、瓊脂凝膠擴散試驗(agar gel immunodiffusion, ACID)、血凝抑制(HI)試驗、免疫膠體金技術(Immunecolloidal gold techniqueノ 善。4、分子生物學方法病毒的核酸檢測敏感度高，檢測周期短，目前應用較為廣泛。分子診斷中使用最多的 3 種技術為 PCR法、NASBA (nucleic acid sequence-based amplification)及 DNA 芯片。PCR法是通過兩段特異性寡核甘酸引物，在體外經DNA聚合酶催化，擴增與兩引物互補的DNA序列之間的區段，檢測樣品中是否有該序列。PCR較血清學方法更敏感，但特異性和重復性較低，若結合斑點雜交、微孔板雜交、濾膜核酸探針雜交等核酸雜交方法和酶聯免疫等方法對PCR產物進行分析，靈敏度和特異性均可大大提高。隨著現代核酸技術的發展，建立在基因水平上的核酸擴增技術PCR及相關技木，由于其高敏感性和高特異性，在甲型HlNl流感病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒及O型ロ蹄疫病毒病毒的臨床檢測中得到廣泛應用，成為實驗室診斷的主要方法。這些以PCR為基礎的檢測方法，都需要花費時間對PCR擴增產物進行后處理，PCR擴增產物中高濃度的目標DNA分子會以氣溶膠的形式污染整個實驗空間，由于PCR的高度靈敏性，甚至可以檢測出反應體系中10個拷貝的模板濃度，從而可能給今后的PCR實驗帶來嚴重的假陽性；常規PCR方法是終點檢測法，由于PCR反應具有平臺期，無法依據終產物對起始模板進行精確定量檢測。在此基礎上研發出競爭PCR(competitive PCR)，巢式PCR(nested PCR)，半巢式 PCR(semi-nested PCR),多重巢式 PCR(multiplex nested PCR),限制片段長度多態性PCR (RELP-PCR)，多重 PCR 等。逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCI^i )是ー種靈敏度很強的技術，可以檢測很低拷貝數的RNA。RT-PCR廣泛應用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量監測某種RNA的含量。建立病毒RT-PCR檢測方法的原則是擴增病毒特異而保守的基因片段，具有很高的特異性和敏感性。的靈敏度可能因樣本中存在其抑制物而低于預期，目前已逐步發展為病毒檢測的“金標準”。在所有常規方法中，該反應最為靈敏。 逆轉錄實時熒光定量PCR法，該法在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法，分一歩法和兩步法兩種，具高通量，可定量，単位檢測成本較低，穩定性、精確性、重復性好，以及自動化程度高等特點。并且單管封閉檢測且不需后續處理而大大減小交叉污染的可能。檢測周期短。敏感性為傳統RT-PCR的10 100倍。而使用特異性的探針可進一歩極高檢測的效率及限制，據研究報道使用TaqMan探針的RRT-PCR方法的檢測限可達O. 00 6TCID50/ml O. 2TCID50/ml (50% tissue culture infectious dose,半數組織培養感染劑量)。而應用MGB探針可減少背景熒光，進ー步提高敏感性，檢測限可達O. 08 EID5tl或O. 006 TCID5tl (約5個RNA拷貝)。探針的應用使假陽性最小化。依賴核酸序列的擴增(Nucleicacid sequence-based amplification, NASBA)是ー種快速、等溫的RNA擴增技術，整個反應有賴于AMV逆轉錄酶、T7RNA多聚酶和核酸酶H(RNase H)共同協作而完成，不需特殊儀器，不需溫度循環，是以轉錄為基礎，單鏈核苷酸的連續擴增，其反應產物是單鏈RNA。擴增產物與磁珠上的捕捉探針及釕標記的電化學發光寡棱苷酸探針(ECL探針)雜交后，形成復合物，經NucliSens閱讀器直接檢測電化學發光強度。該法周期較短，靈敏度與雞胚培養相當。NASBA擴增不要需要復雜的溫度變化，其擴增效率高于傳統的PCR，其敏感性要高于傳統PCR，但現有的敏感性評估均為體外實驗結果，需要進行直接檢測臨床樣品的徹底評估。在NASBA技術上進一步發展出來的實時NASBA技術，使檢測的敏感性和特異性大大提高，達到O. 1TCID，相當于RRT-PCR。檢測臨床樣品的陽性率高于細胞培養法及直接免疫熒光法多達64%。NASBA技術擁有RRT-PCR相似的優點，且因為不需要變性DNA，即便有基因組DNA污染也可以特異性擴增出目的RNA ;而且還是一種高通量的方法，可以同時檢測50個樣本。非常適用于大規模樣品的篩查。NASBA技術的擴增產物為RNA分子，使用者可以根據需要選擇不同的檢測方法，如電化學發光法和酶聯法等。而且，與PCR的產物DNA分子不同，RNA分子不易對實驗儀器和環境造成污染，避免了產物交叉污染實驗儀器、操作環境導致的假陽性結果。但缺點是單位均檢測成本要高于RRT-PCR，所以有條件的實驗室，最適合的技術還是RRT-PCR。
基因芯片技術(gene chips)又稱DNA芯片(DNA chips)或生物芯片(biologicalchips)。其原理是將大量特定的寡核苷酸或基因片段作為探針，有規律地和高密度地排列，固定在一塊很小的支持物如硅片、玻片等，然后與待檢的熒光標記樣品核酸按堿基配對原則雜交，經洗滌后通過激光共聚焦熒光系統檢測雜交信號強度，再經計算機分析處理數據從而獲取樣品的生物信息。將特異探針固定在載玻片上，在PCR擴增甲型HlNl流感病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒及O型ロ蹄疫病毒病毒分型區域吋，應用熒光標記的dNRP使PCR產物帶有熒光，通過將PCR產物與甲型HlNl流感病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒及O型ロ蹄疫病毒病毒芯片雜交后某型處的雜交點出現熒光而確定。將RT-PCR獲得的病毒各種基因的cDNA或合成的特異性寡核苷酸探針固化于芯片，利用核酸雜交技術可構建檢測流感病毒A、B及其亞型的芯片平臺，CY3、CY5標記待檢的cDNA或擴增的DNA，與芯片雜交，檢測病毒核酸或進ー步鑒別混合體系中擴增產物。理論上單次雜交可以檢測多種病毒，并有潛カ進行成千上萬種核酸序列的篩選。可用于甲型HlNl流感病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒及O型ロ蹄疫病毒病毒的基因變異、基因分型的檢測。該技術具有自動化程度高、靈敏度高、檢測目的分子量少、效率高等優點，但也存在成本高、假陽性率偏高、重復性差等缺陷。目前基因芯片技術在流感的檢測中還遠遠低于其它檢測方法，且 檢測成本及硬件要求均較高.離實際應用還有很長的路要走。此外還有原位核酸分子雜交技術(in situ hybridization, ISH)、核酸探針法、環介導的等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)等。

發明內容
本發明的目的是提供ー種克服能同步檢測甲型HlNl流感病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒及O型ロ蹄疫病毒病毒核酸定量檢測試劑盒。為了實現上述目的，為了實現上述目的，本發明首先提供ー種甲型HlNl流感病毒、高致病性豬繁殖與綜合征病毒及豬瘟病毒核酸定量檢測引物和探針，包括如下的序列組I)包括下述正向引物，反向引物和熒光探針的四組序列a)針對甲型HlNl流感病毒matrix基因正向引物5'-CATGGARTGGCTAAAGAC-3'，反向引物5'-WAGGGCAITTTGGACAAA-3'，熒光探針5'-CCAATCTTGTCACCTCT-3'，下劃為 LNA 修飾；b)針對甲型HlNl流感病毒haemagglutinin基因正向引物5'-TGCTGGATCTGGTATTATC-3'，反向引物5'-ATCGGATGTATATTCTGAAATG-3'，熒光探針5'-TCAGATACACCAGTCCAC-3'，下劃為 LNA 修飾；c)針對高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因正向引物5'-CTTYCTTCTGGACACTAAG-3'，反向引物5'-CTCTGGTTAffAGGGGTTG-3;，熒光探針5'AACCRTCAAGCACAACTC-3'，下劃為 LNA 修飾；d)針對O型ロ蹄疫病毒VPl基因
正向引物5'-GTGACCTTCAAGTGTTRG-3'，反向引物5'-GGCCCTCTTCATGCGGTA-3'，5，-GGCTCTCTTCATTCTGTA-3'，熒光探針5' CTGCCTACCTCCTTCAAC-3'，下劃為 LNA 修飾。2)上述I)中序列的5’端和/或3’端有延長的核苷酸片段的ー組序列；3)與上述I)或2)中序列的同源性大于85%，且具有特異性的ー組序列；4)與上述I)或2)或3)中序列的堿基互補的ー組序列；5)上述1)、2)和3)中任何三個或多個序列形成的具有正向引物、反向引物以及與之向對應的熒光探針的分別對應上述a) d)中所述基因的四組序列；其中，所述4種探針分別使用四種激發不同熒光信號的熒光基團；所述序列中，Y 為C或T，R為A或G，W為A或T。其中，所述針對甲型HlNl流感病毒Matrix基因熒光探針的5’端和3’端分別使用熒光基團VIC和BHQl修飾，針對甲型HlNl流感病毒Haemagglutinin基因熒光探針的5’端和3’端分別使用熒光基團ROX和BHQ2修飾，針對高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因熒光探針的5’端和3’端分別使用熒光基團CY5和BHQ3修飾，而針對O型ロ蹄疫病毒VPl基因熒光探針的5’端和3’端分別使用熒光基團FAM和BHQl修飾。進ー步，本發明提供含有上述引物和探針的HlNl流感病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒及O型ロ蹄疫病毒核酸定量檢測試劑盒。該試劑盒還可進ー步含有以下試劑中的ー種或多種(I)PCR 反應液；(2) RNA 提取液；(3)陰性質控品，為不含甲型HlNl流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因及O型ロ蹄疫病毒病毒VPl基因的PMD18-T載體質粒DNA片段；(4)陽性質控品，為含1.0X108copy/ml濃度的甲型HlNl流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因及O型ロ蹄疫病毒病毒基因VPl基因的DNA片段；(5)臨界陽性質控品，為含1.0X104COpy/ml濃度的甲型HlNl流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因及O型ロ蹄疫病毒病毒基因VPl基因的DNA片段；(6)工作標準品，為含有甲型HlNl流感病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒及O型ロ蹄疫病毒病毒的致病機理相關決定基因，即HlNlMatrix基因的127個堿基對、HlNlHaemagglutinin基因的的114個堿基對、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因的146個堿基對以及O型ロ蹄疫病毒VPl基因的127個堿基對的核苷酸片段的PMD18-T重組質粒。其中，所述(I)PCR反應液，包括DEPC處理水、具有5’ 一 3’外切活性的HotStartTaq DNA 聚合酶、M-MLV 反轉錄酶、RNase 抑制劑、dNTP MixUOX ー步法 PCR Buffer^MgCl2溶液，所述探針和引物溶于PCR反應液中。所述工作標準品,具體包括a、工作標準品I，約I. O X 109copy/ml的甲型HlNl流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因及O型ロ蹄疫病毒病毒基因VPl基因的非傳染性DNA片段；b、工作標準品2，約I. O X 108copy/ml的甲型HlNl流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因及O型ロ蹄疫病毒病毒基因VPl基因的非傳染性DNA片段；C、工作標準品3，約I. O X 107copy/ml的甲型HlNl流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因及O型ロ蹄疫病毒病毒基因VPl基因的非傳染性DNA片段；d、エ作標準品4，約I. O X 106copy/ml的甲型HlNl流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因及O型ロ蹄疫病毒病毒基因VPl基因的的非傳染性DNA片段。所述具有5’ 一 3’外切活性的HotStart Taq DNA聚合酶酶、M-MLV反轉錄酶以及RNase抑制劑。 所述PCR反應液各組分含量的配比為DEPC處理水用量4μ I ；5U/y I的熱啟動Taq 酶 O. 9 μ I ；200U/ μ I M-MLV 反轉錄酶 2· O μ I ；Rnase 抑制劑 I. O μ I ；10mmol/l 的 dNTPMix 12 μ I ;10X —步法 RT-PCR Buffer 5 μ I ；50mmol/l 的 MgCl2 溶液用量 10 μ I ;、濃度為20μπιο1/1的甲型HlNl流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因及O型ロ蹄疫病毒病毒VPl基因正向引物各O. 7 μ I、濃度為20μπιο1/1的甲型HlNl流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因及O型ロ蹄疫病毒病毒VPl基因反向引物O. 7 μ I、濃度為20 μ mo I/L的甲型HlNl流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因及O型ロ蹄疫病毒病毒VPl基因熒光探針O. 5 μ I。所述Trizol試劑主要成分為苯酚，另外還加入了 8_羥基喹啉、異硫氰酸胍、β -巰基こ醇等；所述氯仿為三氯甲烷，純品；異丙醇為純品；所述こ醇濃度為75% ;所述DEPC處理水為O. 1% DEPC水，經高壓滅菌，同時也滅活了有毒性的DEPC。本發明實施例還提供利用所述的試劑盒檢測甲型HlNl流感病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒及O型ロ蹄疫病毒病毒核酸的檢測方法，包括下列步驟(I)采集樣品采集血清、鼻咽拭子、咽拭子或是病料組織；具體可按以下方式進行樣品的預處理血清樣品收集5ml靜脈血置IOml帶墊圈的螺ロ塑料離心管中(不含抗凝劑)，以1，OOOg離心IOmin,在無菌條件下吸取血清,并分裝到若干個Iml帶墊圈的螺ロ塑料血清管中(100 μ I/管)，于48h內冷藏(4 8°C )運輸到實驗室。咽拭子和鼻咽拭子標本先用生理鹽水將棉拭子沾濕(不要用含有青霉素的標本運輸液，以防過敏)，鼻咽拭子采集是將棉簽平行于上顎插入鼻孔，停留幾秒鐘，吸收分泌物，拭抹雙側鼻孔；咽拭子采集是用棉簽適度用力擦拭雙側咽后壁部位，應避免觸及舌部。采完咽拭子和鼻咽拭子后，迅速將拭子放入含有3ml標本運輸液的IOml帶墊圈的螺ロ塑料離心管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋。在48h內冷藏(4 8°C )運輸到實驗室。如無病毒保存液，也可用生理鹽水替代。病料組織采集新鮮病料，如豬的內臟，大小I 2cm見方即可，存放在消毒過的容器內，若用于病理組織學檢查，則要采集病灶及臨近正常組織，并存放于10%福爾馬林溶液中。米集的樣品于24h內送達實驗室。長期保存血清樣品存于-20°C以下冰箱，拭子和病料組織保存于-70°C或以下冰箱。(2) RNA提取取已處理的樣本200 μ 1，加600 μ I溶液1，充分震蕩混勻，室溫靜置IOmin ;加150 μ I溶液2，再次充分震蕩混勻，室溫靜置5min，13，OOOrpm離心15min，取上清置等體積預冷的溶液3中,溫和顛倒混勻,靜置IOmin, 12，OOOrpm離心IOmin,棄上清,加入
I,000 μ I 75%溶液4洗漆沉淀2次,8, OOOrpm離心5min。去上清,干燥2 5min,加15 30 μ I溶液5溶解，-80°C保存；(3)加樣向裝有45 μ I PCR反應液的PCR反應管中分別加入處理后的樣品，陰性質控品，陽性質控品，臨界陽性質控品，工作標準品5 μ 1，蓋好管蓋，5，OOOrpm離心IOs ； (4)PCR擴增將各反應管放入熒光定量PCR儀器的反應槽內，設置標記熒光基團種類、樣品名稱及類型，按下列條件進行PCR擴增；420C 60min, I 個循環；94°C 5min, I 個循環；940C 30s, 580C 45s，5 個循環；94°C 30s,58°C 45s，35個循環；收集熒光信號，在反應程序的第四步的終了讀取熒光值。(5)分析判斷Ct值小于28的為陽性；Ct值大于32的為陰性；Ct值大于等于28且小于等于32的為臨界陽性。當需要繪制標準曲線時，另取4個反應管，直接加入不同濃度梯度的工作標準品5 μ 1，5，OOOrpm離心10s，同樣本一起進行熒光定量PCR反應。本發明實施范例提供的技術方案帶來的有益效果是本發明試劑盒利用特異性的TaqMan探針來檢測甲型HlNl流感病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒及O型ロ蹄疫病毒病毒，檢測完成后無需開蓋電泳，避免了產物污染及對實驗室人員的傷害。本發明使用LNA探針，也可用MGB探針，Al lGlo 探針來代替。本發明實現了 PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，實時檢測克服了擴增產物終點檢測所存在的“平臺效應”對產物定量的影響，它具有高度的特異性、靈敏度與準確性(如實例4、實例5所示)，且技術操作簡便、自動化程度高，由于采用閉管操作，不需要PCR產物后處理，有效解決PCR污染問題等特點，結果可靠。同時，采用將逆轉錄及熒光定量PCR法結合起來，大大簡化了實驗步驟，在實際操作及推廣上具有重大意義。在此基礎上，同時特異性的檢測三種疫病病毒，解決了混合感染或非典型感染中檢測多次重復問題，達到了省時省力的目的。


圖I是本發明實施例2中提供的實驗結果圖；圖2是本發明實施例3中提供的實驗結果圖；圖3、4是本發明實施例4中提供的實驗結果圖；圖5、6是本發明實施例5中提供的實驗結果圖；圖7是重組質粒PMD18-T載體圖。
圖中圖I、圖2、圖3、圖5的橫坐標表示表示循環數(Cycle number),縱坐標表示突光值(Delta Rn);圖4、圖6的橫坐標表示LogC縱坐標表示Ct值。
具體實施例方式為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明實施方式作進ー步地詳細描述。實施例I試劑盒的組成該試劑盒含有PCR反應液，其中包括DEPC處理水、具有5’ 一3’外切活性的HotStart Taq DNA 聚合酶、M-MLV 反轉錄酶、dNTP MixUOXPCR Buffer、MgCl2 溶液、甲型HlNl流感病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒及O型ロ蹄疫病毒病毒正向引物、甲型HlNl流感病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒及O型ロ蹄疫病毒病毒反向引物、甲型HlNl流感病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒及O型ロ蹄疫病毒病毒探針；溶液I為Trizol試劑，溶液2為氯仿，溶液3為異丙醇，溶液4為75 %こ醇，溶液5為DEPC處理 水；陰性質控品，為不含甲型HlNl流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因及O型ロ蹄疫病毒病毒VPl基因的PMD18-T載體質粒DNA片段；陽性質控品，為含I. OX 108COpy/ml濃度的甲型HlNl流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因及O型ロ蹄疫病毒病毒基因VPl基因的DNA片段；臨界陽性質控品，為含I. OX IO4 copy/ml濃度的甲型HlNl流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因及O型ロ蹄疫病毒病毒基因VPl基因的DNA片段；工作標準品，為含有甲型HlNl流感病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒及O型ロ蹄疫病毒病毒的致病機理相關決定基因，即HlNlMatrix基因的127個堿基對、HlNlHaemagglutinin基因的的114個堿基對、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因的146個堿基對以及O型ロ蹄疫病毒VPl基因的127個堿基對的核苷酸片段的PMD18-T重組質粒，該質粒在大腸桿菌DH5 α中增殖；試劑盒的制造I.試劑本試劑盒制造過程中所用的試劑主要購自江蘇碩世生物科技有限公司及上海生エ生物科技有限公司。2. PCR反應液制備(I)引物及探針設計與合成選擇甲型HlNl流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因及O型ロ蹄疫病毒病毒基因VPl基因作為目標檢測基因，通過美國國家生物技術信息中心(NCBI) (http://www. ncbi. nlm. nih. gov),選擇并下載有代表性的甲型HlNl流感病毒Matrix基因22條序列，Haemagglutinin基因的20條序列、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因40條序列及O型ロ蹄疫病毒病毒基因VPl基因44條序列，使用MAGA 4. O軟件進行比對分析，在基因區選擇一段相對保守序列，序列如序列表中 SEQ ID NO. 14-17 所示No. 14 Matrix GeneCATGGAGTGGCTAAAGACAAGGCCAATCTTGTCACCTCTGACCAAGGGAATTTTGGGATTTGTATTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCTANo. 15 Haemagglutinin GeneTGCTGGATCTGGTATTATCATTTCAGATACACCAGTCCACGATTGCAATACAACTTGTCAGACACCCAAGGGTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTCAGAATATACATCCGATNo. 16 GP5 GeneCTTCCTTCTGGACACTAAGGGCAGACTCTATCGTTGGCGGTCACCCGTCATTGTGGAGAAAGGGGGTAAGGTTGAGGTCGAAGGTCACCTGATCGACCTCAAGAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCGCGGCAACCCCTTTAACCAGAGNo. 17 VP1 GeneGTGACCTTCAAGTGTTAGCTCAGAAGGCAGAAAGAACTCTGCCTACCTCCTTCAACTTCGGTGCCATCAAGGCAACTCGTGTTACTGAACTACTCTACAGAATGAAGAGAGCC在本發明中，甲型HlNl流感病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒及O型ロ蹄疫病毒病毒探針的5’端修飾的熒光染料可選自FAM，HEX, TET, JOE, VIC, ROX, Cy3或Cy5 ；3’端修飾的熒光染料可選自TAMRA、Eclipse，BHQl，BHQ2，BHQ3或DABCYL。本實施例中熒光報告基團設計為甲型HlNl流感病毒Matrix Gene。甲型HlNl流感病毒Matrix基因LNA探針熒光探針的5’端和3’端分別使用熒光基團VIC和BHQl修飾，VIC的激發波長為535nm，接收波長為556nm，接收針對甲型HlNl流感病毒haemagglutinin基因LNA探針的5’端和3’端分別使用熒光基團ROX和BHQ2修飾，ROX的激發波長為575nm，接收波長為602nm，針對高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因LNA探針的5’端和3’端分別使用熒光基團CY5和BHQ3修飾，CY5的激發波長為649nm，接收波長為670nm，而針對O型ロ蹄疫病毒VPl基因LNA探針的5’端和3’端分別使用熒光基團FAM和BHQl修飾，FAM的激發波長為495nm，接收波長為 521nm ;所述引物序列中，Y = (C/T)，R = (A/G), W = (A/T)；設計結果如下表所示
權利要求
1.一種甲型HlNl流感病毒、高致病性豬繁殖與綜合征病毒及O型ロ蹄疫病毒核酸定量檢測引物和探針，包括如下的序列組 1)包括下述正向引物，反向引物和熒光探針的四組序列 a)針對甲型HlNl流感病毒matrix基因 正向引物5，- CATGGARTGGCTAAAGAC -3，， 反向引物5，- WAGGGCATTTTGGACAAA -3，， 突光探針5’ - ccaAtcTtgTcaCctct _3’，下標為 LNA 修飾； b)針對甲型HlNl流感病毒haemagglutinin基因 正向引物5’- TGCTGGATCTGGTATTATC -3’， 反向引物5，- ATCGGATGTATATTCTGAAATG -3，， 突光探針5’- tcaGatAcaCcaGtccac _3’，下標為 LNA 修飾； c)針對高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因 正向引物5’- CTTYCTTCTGGACACTAAG -3，， 反向引物5，- CTCTGGTTAWAGGGGTTG-3，， 突光探針5’- aacCrtCaaGcaCaactc _3’，下標為 LNA 修飾； d)針對O型ロ蹄疫病毒VPl基因 正向引物5’- GTGACCTTCAAGTGTTRG -3’， 反向引物5’ -GGCCCTCTTCATGCGGTA -3’，5，- GGCTCTCTTCATTCTGTA -3’ 突光探針5’- ctgCctAccTccTtcaac _3’，下標為 LNA 修飾； 2)上述I)中序列的5’端和/或3’端有延長的核苷酸片段的ー組序列； 3)與上述I)或2)中序列的同源性大于85%，且具有特異性的ー組序列； 4)與上述I)或2)或3)中序列的堿基互補的ー組序列； 5)上述1)、2)和3)中任何三個或多個序列形成的具有正向引物、反向引物以及與之向對應的熒光探針的分別對應上述a) ^d)中所述基因的四組序列； 其中，所述4種探針分別使用四種激發不同熒光信號的熒光基團；所述序列中，Y為C或T，R為A或G，W為A或T。
2.根據權利要求I所述的引物和探針，其特征在于，其中，所述針對甲型HlNl流感病毒Matrix基因熒光探針的5’端和3’端分別使用熒光基團VIC和BHQl修飾，針對甲型HlNl流感病毒Haemagglutinin基因熒光探針的5’端和3’端分別使用熒光基團ROX和BHQ2修飾，針對高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因熒光探針的5’端和3’端分別使用熒光基團CY5和BHQ3修飾，而針對O型ロ蹄疫病毒VPl基因熒光探針的5’端和3’端分別使用熒光基團FAM和BHQl修飾。
3.含有權利要求I或2所述引物和探針的三重同步核酸定量檢測試劑盒。
4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括以下試劑中的ー種或多種 (1)PCR反應液； (2)RNA提取液； (3)陰性質控品，為不含甲型HlNl流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因及O型ロ蹄疫病毒病毒VPl基因的PMD18-T載體質粒DNA片段； (4)陽性質控品，為含1.0X108copy/ml濃度的甲型HlNl流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因及0型口蹄疫病毒病毒基因VPl基因的DNA片段； (5)臨界陽性質控品，為含I.OX IO4 copy/ml濃度的甲型HlNl流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因及0型口蹄疫病毒病毒基因VPl基因的DNA片段； (6)工作標準品，為含有甲型HlNl流感病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒及0型口蹄疫病毒病毒的致病機理相關決定基因，即HlNl Matrix基因的127個堿基對、HlNlHaemagglutinin基因的的114個堿基對、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因的146個堿基對以及0型口蹄疫病毒VPl基因的127個堿基對的核苷酸片段的PMD18-T重組質粒。
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述RNA提取液分為溶液1，溶液2，溶液3，溶液4及溶液5，其中溶液I為Trizol試劑，溶液2為氯仿，溶液3為異丙醇，溶液4為75%乙醇，溶液5為DEPC處理水。
6.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述工作標準品包括 a、工作標準品I，含有I.0 X IO9 copy/ml的甲型HlNl流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因及0型口蹄疫病毒病毒基因VPl基因的非傳染性DNA片段； b、工作標準品2，含有1.0X108copy /ml的甲型HlNl流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因及0型口蹄疫病毒病毒基因VPl基因的非傳染性DNA片段； C、工作標準品3，含有LOXlO7 copy /ml的甲型HlNl流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因及0型口蹄疫病毒病毒基因VPl基因的非傳染性DNA片段； d、工作標準品4，含有LOXlO6 copy /ml的甲型HlNl流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因及0型口蹄疫病毒病毒VPl基因的非傳染性DNA片段。
7.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于， 所述PCR反應液各組分含量的配比為DEPC處理水用量4 m ；5 U/m的熱啟動Taq酶0. 9 m ； 200 U/m M-MLV 反轉錄酶 2.0 m； Rnase 抑制劑 l.O ； 10 mmol/1 的 dNTPMix 12 m ；10X 一步法 RT-PCR Buffer 5 ；50 mmol/1 的 MgCl2 溶液用量 10 ;濃度為20 u mol/1的甲型HlNl流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因及0型口蹄疫病毒病毒VPl基因正向引物各0.7 W ;濃度為20 u mol/1的甲型HlNl流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因及0型口蹄疫病毒病毒VPl基因反向引物0. 7 W ;濃度為20U mol/1的甲型HlNl流感病毒Matrix基因和Haemagglutinin基因、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因及0型口蹄疫病毒病毒VPl基因熒光探針0. 5 W。
8.權利要求I或2所述引物及探針，或權利要求31任一所述試劑盒在檢測甲型HlNl流感病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒及O型ロ蹄疫病毒病毒核酸中的應用。
9.ー種利用權利要求:Γ8任一項所述的試劑盒檢測甲型HlNl流感病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒及O型ロ蹄疫病毒病毒核酸的檢測方法，其特征在于，包括下列步驟 (1)樣品預處理采集血清、鼻咽拭子、咽拭子或是病料組織； (2)樣品處理取已處理的樣本200μ 1，加600 μ I溶液I，充分震蕩混勻，室溫靜置·10 min ;加150 μ I溶液2，再次充分震蕩混勻，室溫靜置5 min, 13，000 rpm離心15 min,取上清置等體積預冷的溶液3中,溫和顛倒混勻，靜置10 min, 12, 000 rpm離心10 min,棄上清，加入1,000 μ I 75%溶液4洗漆沉淀2次,8，000 rpm離心5 min;去上清,干燥2 ·5 min，加15 30 μ I溶液5溶解，-80°C保存；其中溶液I為Trizol試劑，溶液2為氯仿，溶液3為異丙醇，溶液4為75%こ醇，溶液5為DEPC處理水； (3)加樣向裝有45μ PCR反應液的PCR反應管中分別加入處理后的樣品，陰性質控品，陽性質控品，臨界陽性質控品，工作標準品各5 μ ，蓋好管蓋，5，000 rpm離心10 s ； (4)PCR擴增將各反應管放入熒光定量PCR儀器的反應槽內，設置標記熒光基團種類、樣品名稱及類型，按下列條件進行PCR擴增； 420C 60 min, 1個循環； 94°C 5 min, 1 個循環； 940C 30 s , 580C 45 S，5 個循環； 94°C 30 s ,58°C 45 s，35個循環；收集熒光信號，在反應程序的第四步的終了讀取熒光值； (5)分析判斷Ct值小于28的為陽性；Ct值大于32的為陰性；Ct值大于或等于28且小于或等于32的為臨界陽性。
全文摘要
本發明公開了一種四重同步核酸定量檢測試劑盒，屬于生物技術領域。本試劑盒包括PCR反應液，其中包括DEPC處理水、Taq酶、M-MLV反轉錄酶、RNase抑制劑、dNTPMix、10×一步法RT-PCRBuffer、MgCl2溶液，SEQIDNo.1~13所示的針對H1N1流感病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒及O型口蹄疫病毒的引物和探針；試劑盒中還包括RNA提取液、陰性質控品、工作標準品、陽性質控品和臨界陽性質控品。本發明采用實時熒光定量PCR技術定量檢測甲型H1N1流感病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒及O型口蹄疫病毒病毒核酸，具有特異、靈敏、快速、操作簡便的優點。
文檔編號C12Q1/68GK102676691SQ20111033691
公開日2012年9月19日 申請日期2011年10月31日 優先權日2011年10月31日
發明者王業富, 胡萌 申請人:武漢大學