專利名稱：檢測谷胱甘肽作用于氧化葡糖桿菌過程中細胞內蛋白質變化的方法
技術領域：
本發明屬于工業微生物領域，涉及一種檢測谷胱甘肽促進氧化葡糖桿菌產 2-酮-L-古龍酸過程中細胞內蛋白質變化的方法。
背景技術：
蛋白質是構成細胞的重要組成部分，對蛋白質結構和功能的研究將直接闡明細胞在不同生長條件下的變化機制。一方面可以對其上游的基因組學信息進行驗證，提供后續基因改造的依據，另一方面又可以對其下游的代謝物研究提供指導。蛋白組學的發展，主要依托高效的蛋白分離和鑒定技術，主要有二維凝膠電泳和液相色譜分離兩種分離方法，其中，液相色譜分離然后經質譜鑒定蛋白質，具有高度自動化，高分辨率的優勢，是目前蛋白組學發展的主流。基于液相色譜分離，Q-TOF鑒定蛋白技術的使用，可以從整體水平上檢測細胞在發酵過程中各種結構蛋白以及功能蛋白的變化水平。氧化葡糖桿菌被用于維生素C的工業發酵，此發酵是氧化葡糖桿菌與巨大芽孢桿菌共同作用完成的，然而氧化葡糖桿菌單獨發酵，生長緩慢，產量較低。添加谷胱甘肽后，菌體生長及2-酮-L-古龍酸產量顯著提高，其作用機理尚不明確，對以后對氧化葡糖桿菌進行分子改造尚不能提供有利信息。
發明內容
本發明的目的是通過高通量的蛋白組學的手段來了解添加谷胱甘肽進行氧化葡糖桿菌發酵過程中的蛋白質變化規律，進一步揭示谷胱甘肽促進氧化葡糖桿菌生長及
2-酮-L-古龍酸生產的作用機制，為對氧化葡糖桿菌進行分子生物學改造提供有利信息， 從而提高其生長及生產能力，提供一種檢測谷胱甘肽提高氧化葡糖桿菌產2-酮-L-古龍酸過程中細胞內蛋白質變化的方法。本發明的技術方案概述如下一種檢測谷胱甘肽作用于氧化葡糖桿菌過程中細胞內蛋白質變化的方法，包括如下步驟(1)細胞內蛋白質的測定①細胞收集及淬滅取3-5份氧化葡糖桿菌以8% 16%的體積比分別接種到發酵培養基A中，另取
3-5份所述氧化葡糖桿菌以8% 16 %的體積比分別接種到發酵培養基B中，將兩種接種后的培養基在 32°C，轉速為200 250rpm的條件下培養發酵，在發酵過程中選取lh、 15h為取樣點取出發酵液樣品，在4°C下，以4000 6000rpm的轉速離心，收集下層的細胞， 并用PH為7. 2 7. 4的磷酸鹽緩沖液清洗，用液氮淬滅，終止代謝反應；用液氮研磨破碎細胞，獲得3-5份從培養基A中發酵Ih收集淬滅的破碎細胞，3-5份從培養基A中發酵1 收集淬滅的破碎細胞，3-5份從培養基B中發酵Ih收集淬滅的破碎細胞，3-5份從培養基B中發酵1 收集淬滅的破碎細胞；所述發酵培養基A為80g · L—1山梨糖，20g · L—1玉米漿，Ig · L—1 KH2PO4, 0. 2g · L-1MgSO4，和 12g · L-1 尿素，余量為水；所述發酵培養基B為80g · L—1山梨糖，20g · L—1玉米漿，Ig · L—1 KH2PO4, 0. 2g · L^1MgSO4, and 12g · Γ1 尿素，0. 8 1. 5mg · mL"1 的谷胱甘肽，余量為水；②提取細胞內蛋白取步驟①獲得的破碎細胞，每份100 200mg分別置于離心管中，每管加入0. 5 2ml細胞裂解液，混勻，冰上間歇超聲破碎20 50s ；加入5 15 μ L的質量比為2 4 1 的DNase I/RNaseA酶混合溶液，混勻，4°C靜置反應10 30min ；加入5 15 μ L 80 120mM的苯甲基磺酰氟異丙醇溶液，4°C靜置1 汕；15000rpm離心25 40min ；取上清， 得到蛋白溶液；所述細胞裂解液為8mol *L-1尿素，質量濃度為4%的(3_[(3_膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸)，40mM的Tris，余量為水；③蛋白濃度測定采用Bradford試劑盒，將牛血清蛋白由低濃度到高濃度加入考馬斯亮藍G-250溶液中，測定步驟②獲得的各個蛋白溶液在595nm處的吸光值，建立標準曲線；測定各個蛋白溶液蛋白的濃度；④沉淀蛋白分別取包含50 150 μ g蛋白的步驟③獲得的各個蛋白溶液，加入4 6倍體積的-20°C _40°C的丙酮，沉淀12 20h ；離心，棄上清，沉淀用_20°C _40°C的體積濃度為70% -85%的丙酮水溶液洗滌；冷凍干燥備用；_80°C貯存；⑤蛋白還原以及酶解向步驟④所得的各個干燥蛋白中，添加10 40 μ L 40 60mM的三乙基碳酸氫銨水溶液溶解蛋白；加入1 4yL三(2-羧乙基)膦，在50 60°C反應lh，對各個蛋白進行還原化處理；然后加入1 2μ L甲基硫代磺酸甲酯，室溫反應10 15min，終止還原反應；向上述溶液中，加濃度為0. 2 0. 3 μ g/ μ L的胰蛋白酶水溶液20 30 μ L，37°C 反應12 18小時，進行蛋白酶解；⑥蛋白標記在每個經步驟⑤酶解的蛋白酶解液中分別加入一管用60 80 μ L乙醇溶解的 iTRAQ標記試劑，室溫反應Ih ；⑦溶液混合將步驟溶液⑥獲得的溶液混合得3-5份混合液，使每個混合液中都包括從培養基 A中發酵Ih收集淬滅的破碎細胞再經步驟②-⑥后獲得的標記蛋白、從培養基A中發酵15h 收集淬滅的破碎細胞再經步驟②-⑥后獲得的標記蛋白、從培養基B中發酵Ih收集淬滅的破碎細胞再經步驟②-⑥后獲得的標記蛋白和從培養基B中發酵1 收集淬滅的破碎細胞再經步驟②-⑥后獲得的標記蛋白；于_20°C保存；⑧差異表達蛋白鑒定將⑦中得到的混合液，進行Q-Tof質譜鑒定，得到蛋白譜，通過定量得到各混合組樣品的差異表達蛋白；
(2)主成分分析采用matlab對步驟(1)⑧中得到的數據進行標準化后，進行主成分分析，得到具有不同變化規律的數據類別，獲得候選差異蛋白；(3)過程分析將步驟( 獲得的候選差異蛋白含量按照時間序列制成圖表，觀察并分析這些蛋白變化的規律，進而發現谷胱甘肽在提高氧化葡糖桿菌產2-酮-L-古龍酸過程中的作用。利用本發明的方法可以從揭示氧化葡糖桿菌受谷胱甘肽作用后細胞內蛋白變化規律，找到發酵過程中的重要蛋白，這些蛋白含量的變化規律為了解發酵過程的內在機理提供依據，從而為進一步優化發酵過程，提高維生素C產量，對氧化葡糖桿菌進行分子改造提供理論基礎。同時也為工業混菌發酵過程的研究提供新的思路和方法。
圖1為對四組樣品蛋白(混合溶液)數據進行主成分分析A、得分圖“ ▲”表示來自培養基B Ih的樣品/來自培養基A Ih的樣品，“〇”表示來自培養基A 1 的樣品/來自培養基A Ih的樣品，“■”表示來自培養基B 1 的樣品 /來自培養基A Ih的樣品；B、物質載荷2為硫胺素轉運蛋白及以其為輔酶的重要酶表達情況GSH-lh/KV_lh，表示來自培養基B Ih的樣品/來自培養基A Ih的樣品；KV-Mh/KV-lh，表示來自培養基A 1 的樣品/來自培養基A Ih的樣品，GSH-15h/KV-lh，表示來自培養基B 1 的樣品/來自培養基A Ih的樣品；圖3為三羧酸循環、磷酸戊糖途徑中的關鍵酶表達情況GSH-lh/KV_lh，表示來自培養基B Ih的樣品/來自培養基A Ih的樣品；KV-Mh/KV-lh，表示來自培養基A 1 的樣品/來自培養基A Ih的樣品，GSH-15h/KV-lh，表示來自培養基B 1 的樣品/來自培養基 A Ih的樣品；
具體實施例方式下面的實施例可以使本領域技術人員更全面的理解本發明，但不以任何方式限制本發明。下面結合具體實施例對本發明作進一步說明實施例1一種檢測谷胱甘肽作用于氧化葡糖桿菌過程中細胞內蛋白質變化的方法，其特征是包括如下步驟(1)細胞內蛋白質的測定①細胞收集及淬滅取3份氧化葡糖桿菌以8%的體積比分別接種到發酵培養基A中，另取3份所述氧化葡糖桿菌以8 %的體積比分別接種到發酵培養基B中，將兩種接種后的培養基在28°C，轉速為200rpm條件下培養發酵，在發酵過程中選取lh、Mh為取樣點取出發酵液樣品，在4°C 下，以4000rpm的轉速離心，收集下層的細胞，并用pH為7. 2的磷酸鹽緩沖液清洗，立即用液氮淬滅，終止代謝反應；用液氮研磨用于破碎細胞，獲得3份從培養基A中發酵Ih收集淬滅的破碎細胞，3份從培養基A中發酵1 收集淬滅的破碎細胞，3份從培養基B中發酵Ih 收集淬滅的破碎細胞，3份從培養基B中發酵1 收集淬滅的破碎細胞；所述發酵培養基A為80g · L—1山梨糖，20g · L—1玉米漿，Ig · L—1 KH2PO4, 0. 2g · L-1MgSO4，和 12g · L-1 尿素，余量為水；所述發酵培養基B為80g · L—1山梨糖，20g · L—1玉米漿，Ig · L—1 KH2PO4, 0. 2g · L^1MgSO4, and 12g · Γ1 尿素，0. 8 1. 5mg · mL"1 的谷胱甘肽，余量為水；②提取細胞內蛋白取步驟①獲得的破碎細胞，每份IOOmg分別置于離心管中，每管加入0. 5ml細胞裂解液，混勻，冰上間歇超聲破碎20s ；加入5 μ L的質量比為2 1的DNase I/RNaseA酶混合溶液，混勻，4°C靜置反應IOmin ；加入5μ L SOmM的苯甲基磺酰氟異丙醇溶液，4°C靜置Ih ； 15000rpm離心25min ；取上清，得到蛋白溶液。所述細胞裂解液為8mol · L—1尿素，質量濃度為4%的(3-[(3_膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸)(CHAPS)，40mM的Tris，余量為水；③蛋白濃度測定采用Bradford試劑盒，將牛血清蛋白由低濃度到高濃度加入考馬斯亮藍G-250溶液中，測定步驟②獲得的各個蛋白溶液在595nm處的吸光值，建立標準曲線；測定各個蛋白溶液蛋白的濃度；④沉淀蛋白 分別取包含50 μ g蛋白的步驟③獲得的各個蛋白溶液，加入4倍體積的-20°C的丙酮，沉淀12h ；離心，棄上清，沉淀用-20°C的體積濃度為70%的丙酮水溶液洗滌；冷凍干燥備用；-80°C貯存；⑤蛋白還原以及酶解向步驟④中所得的各個干燥蛋白中，添加IOyL 40mM的三乙基碳酸氫銨水溶液溶解蛋白；加入IyL三(2-羧乙基)膦，在50°C反應lh，對各個蛋白進行還原化處理；然后加入1 μ L甲基硫代磺酸甲酯，室溫反應lOmin，終止還原反應；向上述溶液中，加濃度為0. 2 μ g/ μ L的胰蛋白酶水溶液30 μ L，37。C反應12小時， 進行蛋白酶解；⑥蛋白標記在每個經步驟⑤酶解的蛋白酶解液中分別加入一管用60 80 μ L乙醇溶解的 iTRAQ標記試劑，室溫反應Ih ；⑦溶液混合將步驟溶液⑥獲得的溶液混合得3份混合液，使每個混合液中都包括從培養基A 中發酵Ih收集淬滅的破碎細胞再經步驟②-⑥后獲得的標記蛋白、從培養基A中發酵15h 收集淬滅的破碎細胞再經步驟②-⑥后獲得的標記蛋白、從培養基B中發酵Ih收集淬滅的破碎細胞再經步驟②-⑥后獲得的標記蛋白和從培養基B中發酵1 收集淬滅的破碎細胞再經步驟②-⑥后獲得的標記蛋白；于_20°C保存；⑧差異表達蛋白鑒定將⑦中得到的混合液，進行Q-Tof質譜鑒定，得到蛋白譜，通過定量得到各混合組樣品的差異表達蛋白；
(2)主成分分析采用matlab對步驟(1)⑧中得到的數據進行標準化后，進行主成分分析，得到具有不同變化規律的數據類別，獲得候選差異蛋白；(3)過程分析將步驟( 獲得的候選差異蛋白含量按照時間序列制成圖表，觀察并分析這些蛋白變化的規律，進而發現谷胱甘肽在提高氧化葡糖桿菌產2-酮-L-古龍酸過程中的作用。添加谷胱甘肽后，氧化葡糖桿菌發酵過程中，胞內鑒定到的蛋白如表1所示。表1氧化葡糖桿菌胞內蛋白
權利要求
1. 一種檢測谷胱甘肽作用于氧化葡糖桿菌過程中細胞內蛋白質變化的方法，其特征是包括如下步驟(1)細胞內蛋白質的測定①細胞收集及淬滅取3-5份氧化葡糖桿菌以8% 16%的體積比分別接種到發酵培養基A中，另取3-5 份所述氧化葡糖桿菌以8% 16%的體積比分別接種到發酵培養基B中，將兩種接種后的培養基在 32°C，轉速為200 250rpm的條件下培養發酵，在發酵過程中選取lh、1 為取樣點取出發酵液樣品，在4°C下，以4000 6000rpm的轉速離心，收集下層的細胞，并用 pH為7. 2 7. 4的磷酸鹽緩沖液清洗，用液氮淬滅，終止代謝反應；用液氮研磨破碎細胞， 獲得3-5份從培養基A中發酵Ih收集淬滅的破碎細胞，3-5份從培養基A中發酵1 收集淬滅的破碎細胞，3-5份從培養基B中發酵Ih收集淬滅的破碎細胞，3-5份從培養基B中發酵1 收集淬滅的破碎細胞；所述發酵培養基 A 為:80g .L—1 山梨糖，20g .L—1 玉米漿，Ig .L—1 KH2PO4,0. 2g .L4MgSO4, 和Ug·!/1尿素，余量為水；所述發酵培養基 B 為:80g .L—1 山梨糖，20g .L—1 玉米漿，Ig .L—1 KH2PO4,0. 2g .L4MgSO4, and 12g · Γ1尿素，0. 8 1. 5mg · mL—1的谷胱甘肽，余量為水；②提取細胞內蛋白取步驟①獲得的破碎細胞，每份100 200mg分別置于離心管中，每管加入0. 5 ^iil 細胞裂解液，混勻，冰上間歇超聲破碎20 50s ；加入5 15 μ L的質量比為2 4 1的 DNase I/RNaseA酶混合溶液，混勻，4°C靜置反應10 30min ；加入5 15 μ L 80 120mM 的苯甲基磺酰氟異丙醇溶液，4°C靜置1 池；15000rpm離心25 40min ；取上清，得到蛋白溶液；所述細胞裂解液為8mol ^L-1尿素，質量濃度為4%的(3-[(3_膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸)，40mM的Tris，余量為水；③蛋白濃度測定采用Bradford試劑盒，將牛血清蛋白由低濃度到高濃度加入考馬斯亮藍G-250溶液中，測定步驟②獲得的各個蛋白溶液在595nm處的吸光值，建立標準曲線；測定各個蛋白溶液蛋白的濃度；④沉淀蛋白分別取包含50 150 μ g蛋白的步驟③獲得的各個蛋白溶液，加入4 6倍體積的-20°C -40°C的丙酮，沉淀12 20h ；離心，棄上清，沉淀用_20°C _40°C的體積濃度為70% -85%的丙酮水溶液洗滌；冷凍干燥備用；_80°C貯存；⑤蛋白還原以及酶解向步驟④所得的各個干燥蛋白中，添加10 40 μ L 40 60mM的三乙基碳酸氫銨水溶液溶解蛋白；加入1 4μ L三(2-羧乙基)膦，在50 60°C反應Ih，對各個蛋白進行還原化處理； 然后加入1 2μ L甲基硫代磺酸甲酯，室溫反應10 15min，終止還原反應；向上述溶液中，加濃度為0. 2 0. 3 μ g/ μ L的胰蛋白酶水溶液20 30 μ L，37。C反應 12 18小時，進行蛋白酶解；⑥蛋白標記在每個經步驟⑤酶解的蛋白酶解液中分別加入一管用60 80 μ L乙醇溶解的iTRAQ 標記試劑，室溫反應Ih;⑦溶液混合將步驟溶液⑥獲得的溶液混合得3-5份混合液，使每個混合液中都包括從培養基A中發酵Ih收集淬滅的破碎細胞再經步驟②-⑥后獲得的標記蛋白、從培養基A中發酵1 收集淬滅的破碎細胞再經步驟②-⑥后獲得的標記蛋白、從培養基B中發酵Ih收集淬滅的破碎細胞再經步驟②-⑥后獲得的標記蛋白和從培養基B中發酵15 h收集淬滅的破碎細胞再經步驟②-⑥后獲得的標記蛋白；于_20°C保存；⑧差異表達蛋白鑒定將⑦中得到的混合液，進行Q-Tof質譜鑒定，得到蛋白譜，通過定量得到各混合組樣品的差異表達蛋白；(2)主成分分析采用matlab對步驟(1)⑧中得到的數據進行標準化后，進行主成分分析，得到具有不同變化規律的數據類別，獲得候選差異蛋白；(3)過程分析將步驟( 獲得的候選差異蛋白含量按照時間序列制成圖表，觀察并分析這些蛋白變化的規律，進而發現谷胱甘肽在提高氧化葡糖桿菌產2-酮-L-古龍酸過程中的作用。
全文摘要
本發明公開了一種檢測谷胱甘肽作用于氧化葡糖桿菌過程中細胞內蛋白質變化的方法，包括如下步驟(1)細胞內蛋白質的測定①細胞收集及淬滅；②提取細胞內蛋白；③蛋白濃度測定；④沉淀蛋白；⑤蛋白還原以及酶解；⑥蛋白標記；⑦溶液混合；⑧差異表達蛋白鑒定；(2)主成分分析；(3)過程分析。利用本發明的方法可以從揭示氧化葡糖桿菌受谷胱甘肽作用后細胞內蛋白變化規律，找到發酵過程中的重要蛋白，這些蛋白含量的變化規律為了解發酵過程的內在機理提供依據，從而為進一步優化發酵過程，提高維生素C產量，對氧化葡糖桿菌進行分子改造提供理論基礎。同時也為工業混菌發酵過程的研究提供新的思路和方法。
文檔編號C12Q1/02GK102520184SQ201110346058
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月4日 優先權日2011年11月4日
發明者元英進, 張璐, 馬倩 申請人:天津大學