專利名稱：基因工程法制備重組谷胱甘肽過氧化物酶的制作方法
技術領域：
本發明是一種應用基因工程法制備重組谷胱甘肽過氧化物酶的方法，屬于生物技術領域，涉及基因重組技術、基因突變技術和重組蛋白表達技術。
背景技術：
含硒的谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)的底物是谷胱甘肽(GSH)，催化基團是硒代半胱氨酸(SeCys)。在生物體內，GPX同超氧化物歧化酶(S0D)、過氧化氫酶(CAT)—起構成了機體抗氧化防御體系。GPX在該體系中發揮著重要的作用，它以底物GSH為還原劑，分解體內的過氧化氫和各類氫過氧化物，因而能清除體內活性氧(R0S)，防止脂質過氧化，治療由活性氧引起的各種疾病，如衰老、紫外線輻射、心腦血管疾病、白內障、腫瘤等。與其它抗氧化酶不同，GPX除了能清除ROS外，還能降解脂質過氧化物，防止細胞過氧化損傷，這種獨特的保護細胞的功能使它在抗氧化酶體系中占有特別重要的位置。然而，由于天然GPX的來源相當有限、穩定性差，致使它的人工產物及其模擬物的研究備受關注。小分子模擬物主要有PZ51 (ebselen),AL3823A,BXT系列產品，它們的弱點是活力低，僅為天然GPX的千分之一左右。大分子的模擬物主要有抗體酶(中國專利94102481.4和96112628.0)和以谷胱甘肽硫轉移酶(GST)為蛋白模板制備的GPX模擬酶，其活力顯著高于小分子模擬物。顯然，以具有谷胱甘肽(GSH)結合部位的蛋白為模板制備的大分子GPX模擬酶收到了更好的效果，因此開發制備這些高活力的GPX模擬酶制備技術就成了學術界的研究熱點，對于分子生物學，生物工程學及醫學等領域具有廣闊的應用前景。迄今已成功開發的方法有:用化學法(中國專利94102481.4,96112628.0)或缺陷型原核表達系統(中國專利200810050556.6)在非GPX類模板蛋白中引入GPX的催化基團硒代半胱氨酸(SeCys)。中國專利94102481.4,96112628.0,99104234.4,200810050556.6 公開的各類含硒抗體酶的制備方法就是應用化學突 變(修飾)法在抗體類模板蛋白中引入GPX的催化基團SeCys，有以下缺點:(I)在制備過程中，僅化學突變(修飾)這一步就會損失20_40%的酶蛋白，導致模擬酶產率顯著下降；(2)制備模擬酶的周期長，操作繁瑣，時間長；(3)在化學突變過程中需使用苯甲基磺酰氟、乙腈等，這些物質為有毒性的物質；(4)缺乏靶向性，對于大的蛋白分子而言，一次化學反應常在不同位點引入多個非特異性催化基團，因此化學突變引入催化基團無法達到基因突變法那樣的專一性。中國專利200810050556.6也公開了人源單鏈含硒抗體酶的另一種制備方法是用缺陷型原核表達系統(大腸桿菌)和基因突變法引入催化基團，但其僅限于人源單鏈含硒抗體酶的制備，不包括重組谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)及其它GPX模擬酶的制備方法。另有報道:具有GPX活性的谷胱甘肽硫轉移酶(GST)的制備方法。這種方法雖然也采用缺陷型原核表達系統和基因突變法引入催化基團，但其僅限于以GST為模板蛋白制備GPX模擬酶，不包括以天然GPX為模板制備重組GPX。用缺陷型原核表達系統在非GPX類模板蛋白中引入催化基團制備模擬酶的方法是將催化基團引入到與GPX有相同底物GSH結合部位的它種蛋白中使其產生GPX活力。然而由于這些模板蛋白不具備天然GPX自身的催化基團，因此很難找到理想而準確的催化基團的位置；同時由于這些模板蛋白中也沒有象天然GPX那樣理想的催化三聯體，因此這類模擬酶的催化效率不高。如果以天然GPX為模板用基因工程方法來制備重組GPX則可克服這些缺點。由于編碼GPX的催化基團SeCys的密碼子UGA是終止密碼子，在普通原核表達系統中，需在GPX基因的開放閱讀框內、緊鄰SeCys的密碼子UGA下游引入頸環結構才能將UGA翻譯成SeCys而不是終止密碼子，而開放閱讀框內頸環的引入必然會引起GPX空間構象的改變，進而影響酶活性。因此普通原核表達系統不適于直接表達具有GPX活性的含硒蛋白。
發明內容
本發明的目的在于提供一種應用基因工程法制備谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)的方法。應用基因工程技術、細胞培養技術、營養缺陷型原核表達技術和SPP (Single proteinproduction,單一蛋白生產)系統低溫表達技術制備具有高GPX活力的人工重組GPX。是用基因工程技術在哺乳動物細胞株或營養缺陷型原核表達系統及其SPP低溫表達系統中直接表達具有高酶活性的重組GPX的方法。本方法不需化學修飾即可制備具有較高GPX活力的人工酶。本發明方法在生物制藥方面具有廣闊的應用前景。本發明的制備重組谷胱甘肽過氧化物酶的方法，先將靶基因組裝到分泌型原核表達載體上，用基因突變(或氨基酸替換)法，通過營養缺陷型原核表達系統或通過營養缺陷型原核和SPP低溫聯合表達系統，將GPX的催化基團硒代半胱氨酸(SeCys)引入到GPX的底物結合部位，因而在該蛋白上既有GPX的底物結合部位，又有催化基團，結果賦予其高的GPX的活性，就產生了高活力的重組谷胱甘肽過氧化物酶。或先將靶基因連同硒代半胱氨酸插入序列組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上，再將硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2(SBP2)組裝到胞內型哺乳類細胞表達載體上，將兩種載體共轉染同一哺乳細胞株，然后用篩選得到的同時含有GPX和SBP2兩種基因的陽性細胞株制備各型重組GPX，就在體外產生了高活力的基因工程重組谷胱甘肽過氧化物酶，從而解決天然GPX來源有限的問題。本發明的具體制備步驟:本發明的第一種方法是用營養缺陷型原核表達系統制備重組GPX。1、表達載體的構建:在保持氨基酸序列不變的前提下，根據基因文庫中GPX基因(見NCBI)序列設計引物擴增或直接合成其編碼基因，確保GPX基因的5'端含有起始密碼子(ATG)，3'端含有終止密碼子；用多克隆位點將GPX基因組裝到分泌型原核表達載體上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據要突變為半胱氨酸(Cys)的SeCys的位置和它比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長35-50bp ;用定點突變引物和快速定點突變試劑盒(Invitrogen公司，按試劑盒說明書操作)，將構建在原核表達載體上的GPX基因中的SeCys的編碼序列突變成Cys的密碼子(t匕如TGC);同樣將GPX基因中的其它Cys突變成絲氨酸(Ser);通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發生；所述的多克隆位點，是載體上固有的由多個核酸限制性內切酶識別的堿基組成的DNA序列； 2、陽性轉化子的篩選及蛋白的表達與純化:
將含有突變的GPX基因的載體轉化營養缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys的感受態細胞，涂含Cys的營養瓊脂平板，篩選陽性轉化子；將陽性轉化子擴培養后，在含有SeCys、必需生長因子和營養素的培養基里，經異丙基硫代_β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導，營養缺陷型菌株-BL21 (DE3) Cys能用Cys的密碼子合成SeCys，最后直接表達出在底物GSH的結合部位含有SeCys的GPX，酶蛋白以可溶性形式表達并分泌到菌體的周質腔里；先小量培養篩選高表達株，再擴大培養和誘導表達；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPX，透析凍干后即得酶蛋白純品。該方法通過基因突變和營養缺陷型原核表達系統在GPX的底物結合部位引入了催化基團，因而產生高活力的重組GPX。所述的用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPX，是用pH7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。所述的將液體低溫離心，可以在4°c，8000-12000g離心15_30min。本發明的第二種方法是用SPP系統和營養缺陷型原核表達系統聯合制備重組GPX。1、表達載體的構建:在保持氨基酸序列不變的前提下，根據基因文庫中GPX的基因序列直接合成其編碼基因，確保GPX基因的5'端含有起 始密碼子(ATG)，3'端含有終止密碼子，GPX基因的SeCys的編碼序列替換為Cys的密碼子(可以是TGC等)，GPX基因中其它所有Cys的密碼子替換為絲氨酸(Ser)的密碼子，且GPX基因全長不含有ACA序列；用多克隆位點將GPX基因組裝到分泌型原核表達載體上；所述的多克隆位點，是載體上固有的由多個核酸限制性內切酶識別的堿基組成的DNA序列；2、陽性轉化子的篩選及蛋白的表達與純化:將含有合成的GPX基因的載體轉化營養缺陷型菌株_BL21(DE3)Cys的感受態細胞，涂含Cys的營養瓊脂平板，篩選陽性菌株；再將含有表達核酸內切酶MazF的pMazF(TAKARA, Cat#3367)質粒轉化陽性菌株，用含雙抗性的M9固體培養基篩選陽性轉化子；將陽性轉化子擴培養后，在含有SeCys、必需生長因子和營養素的培養基里，經IPTG低溫4-25°C誘導表達，營養缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys能用Cys的密碼子合成SeCys，直接表達出在底物GSH的結合部位含有SeCys的重組GPX，酶蛋白以可溶性形式表達并分泌到菌體的周質腔里，而MazF能通過識別并切斷單鏈RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白質的表達；先小量培養篩選高表達株，再擴大培養和誘導表達；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPX，透析凍干后即得酶蛋白純品。該方法通過低溫下誘導營養缺陷型原核表達系統在GPX的底物結合部位引入了催化基團，因而產生高活力的重組GPX。所述的用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPX，是用ρΗ7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。所述的將液體低溫離心，可以在4°C，8000-12000g離心15_30min。第三種方法:用哺乳類細胞制備重組谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)。
1.表達載體的構建:在保持氨基酸序列不變的前提下，根據基因文庫中GPX基因序列設計引物擴增或直接合成GPX的編碼基因，確保GPX基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和期望的酶切位點，3'端在終止密碼子下游引入硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)和期望的酶切位點；用多克隆位點將GPX基因連同硒代半胱氨酸插入序列組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；在保持氨基酸序列不變的前提下，根據基因文庫中硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2 (SBP2,見NCBI，NM_024077.3) C端的512個氨基酸(343_854aa)的基因序列設計引物擴增或直接合成其編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和期望的酶切位點，3'端含有終止密碼子和期望的酶切位點，用多克隆位點將SBP2基因組裝到胞內型哺乳類細胞表達載體上；所述的多克隆位點，是載體上固有的由多個核酸限制性內切酶識別的堿基組成的DNA序列；2.陽性細胞株的篩選:用含有SBP2和GPX基因的載體在轉染試劑的介導下共轉染哺乳類細胞，用兩個載體上的抗性基因通過抗生素濃度從高到低逐級遞減法篩選兼具兩種抗性的陽性細胞克隆，再用多孔培養板逐級放大培養陽性克隆，最終獲得同時穩定表達SBP2和GPX兩種外源蛋白的陽性細胞株；檢測GPX蛋白的表達量并篩選靶蛋白表達量高的細胞株；3.靶蛋白的表達與純化:在搖瓶中將同時表達兩種外源蛋白的細胞株放大培養，在含有亞硒酸鈉的培養基里用哺乳類細胞表達重組GPX，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養基里，用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化重組GPX，透析凍干 后即得酶蛋白純品。所述的檢測GPX蛋白的表達量，可以用每種靶蛋白的抗體和ELISA或GPX活力測定技術進行檢測；所述的用谷胱甘肽GSH親和層析純化重組GPX，是用pH7.5，50mmol/LTris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。本發明的第四種方法是分步用含有SBP2基因的載體和含有GPX基因的載體轉染同一哺乳類細胞。1.表達載體的構建:在保持氨基酸序列不變的前提下，根據基因文庫中GPX的基因序列設計引物擴增或直接合成GPX的編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和期望的酶切位點，3'端在終止密碼子下游引入硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)和期望的酶切位點；用多克隆位點將GPX基因連同硒代半胱氨酸插入序列組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；在保持氨基酸序列不變的前提下，根據基因文庫中SBP2 (見NCBI，NM_024077.3) C端的512個氨基酸(343-854aa)的基因序列設計引物擴增或直接合成其編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和期望的酶切位點，3'端含有終止密碼子和期望的酶切位點，用多克隆位點將SBP2基因組裝到胞內型哺乳類細胞表達載體上；所述的多克隆位點，是載體上固有的由多個核酸限制性內切酶識別的堿基組成的DNA序列；2.陽性細胞株的篩選:先用含有SBP2基因的載體轉染哺乳類細胞，通過該載體上的抗性基因篩選穩定表達SBP2的細胞株。再用含有GPX基因的載體轉染穩定表達SBP2的細胞株，用兩個載體上的抗性基因篩選同時穩定表達SBP2和GPX兩種外源蛋白的細胞株；檢測GPX蛋白的表達量并篩選靶蛋白表達量高的細胞株；3.靶蛋白的表達與純化:在搖瓶中將同時表達兩種外源蛋白的細胞株放大培養，在含有亞硒酸鈉的培養基里用哺乳類細胞表達重組GPX，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養基里；用谷胱甘肽親和層析純化重組GPX，透析凍干后即得酶蛋白純品。在陽性細胞株的篩選中，所述的陽性細胞株的篩選，也可先轉染GPX基因，后轉染SBP2基因，再用兩個載體上的抗性基因篩選同時穩定表達SBP2和GPX兩種外源蛋白的細胞株。所述的檢測GPX蛋白的表達量，可以用每種靶蛋白的抗體和ELISA或GPX活力測定技術進行檢測。所述的用谷胱甘肽親和層析純化重組GPX，是用pH7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。本發明具有以下特點:⑴本發明使用簡單的基因合成或擴增、基因突變和表達等基因工程技術，制備方法簡單。⑵本發明方法制備的重組GPX活力高，已達到天然GPX活力的數量級水平，細胞生物學實驗已證實對過氧化氫損傷的心肌細胞有防護作用。⑶本發明使用的分泌型表達載體，能將GPX以可溶性形式表達并分泌到大腸桿菌的周質腔或哺乳類細胞的體外，引導蛋白分泌表達的前導信號肽由菌體或細胞自動切除，所表達的蛋白為可溶性，具有天然蛋白的空間構象和活性，不需復性，可避免包涵體復性過程造成的產率下降和失活，因 而生產周期短。⑷本發明使用的SPP低溫表達系統能利用MazF蛋白酶特異性識別并切割含有ACA序列的mRNA的特性，使菌體只能合成編碼基因中無ACA序列的蛋白質，因此新合成的蛋白主要是外源重組蛋白，從而提高產率和Cys向SeCys的轉化率。(5)本發明使用的營養缺陷型原核表達系統及其與SPP低溫表達系統聯合制備的重組GPX具有超強的穩定性，不易失活，這一特性明顯優于天然GPX。(6)本發明所用的真核表達直接使用GPX自身的硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)，不需另外引入SECIS進入表達載體，因而操作簡單且可用常規真核表達載體實施。這些優點均有利于大規模生產，為今后的實際應用打下了堅實的基礎，解決天然GPX來源不足和性質不穩定的問題，在生物制藥方面有廣闊的應用前景。
具體實施方式
:實施例1:用營養缺陷型原核表達系統制備基因工程人GPXl在保持氨基酸序列不變的前提下，根據基因文庫中公開的GPXl的基因(參見NCBI, NM_000581.2)序列設計引物擴增或直接合成其編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和Nde I酶切位點，3'端含有終止密碼子和Hind III酶切位點。用限制性內切酶Nde I和Hind III雙酶切后，連接到同樣酶切的pColdIII (TAKARA, Cat.#3369)載體上。在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據49號SeCys比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，引物長35-50bp，以49號SeCys的密碼子(TGA)為中心。用這兩條完全互補的引物和快速定點突變試劑盒(Invitrogen公司，按試劑盒說明書操作)，將構建在原核表達載體PCold III上的GPXl基因的第49號SeCys的編碼序列TGA突變成Cys的密碼子(TGC)，通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發生，用同樣方法將GPXl基因中其它所有Cys的密碼子突變成Ser的密碼子(TCA)。用裝有突變的GPXl基因的載體(pCold II1-GPX1)轉化營養缺陷型大腸桿菌BL21(DE3)Cys，涂含有Cys的營養瓊脂平板，篩選陽性轉化子。將陽性轉化子接種于1.2L M9缺陷表達培養基(在M9培養基中加入100 μ g/ml氨節青霉素、50 μ g/ml卡那霉素、50 μ g/mlCys和除了 Cys之外的19種氨基酸各100 μ g/ml)中至0D600為0.1，培養至0D600約為
0.3-1，加入終濃度0.1-1mM的IPTG，IOmin后加入終濃度10 μ g/ml的氯霉素。加入氯霉素五分鐘后培養液離心，低溫6000rpm離心5分鐘，用冰浴的生理鹽溶液洗兩次，每次用1.2L，然后用生產培養基(在M9培養基中加入除了 Cys之外的19種氨基酸各50-400 μ g/ml)重懸，并向培養基中補充終濃度400 μ g的利福平和600 μ M SeCys。繼續培養2_12h，使GPXl以可溶性形式表達在菌體的周質腔里。收集菌體(6000rpm, IOmin)并用等體積的bufferT(50mM Tris buffer, ρΗ7.5,含ImM EDTA)洗漆兩次。用BufferT重懸菌體沉淀，加入終濃度ImM的PMSF (苯甲基磺酰氟)，超聲破碎菌體，4°C，12000rpm離心30min，收集上清。按說明書處理GSH親合柱，應用緩沖液(50mmol/L Tris, pH7.5)平衡，將上清液加入GSH親合柱上，用平衡緩沖液洗脫雜蛋白，用lOmmol/L GSH洗脫目的蛋白。將洗脫液透析并凍干，即得人源GPX1。其GPX活力為2865U/ μ mol，達到天然GPX的數量級水平。營養缺陷型大腸桿菌BL21 (DE3) Cys來源于題目為“Structure of theCathelicidin Motif of Protegrin_3Precursor: Structural Insights into theActivationMechanism of an Antimicrobial Protein，，的文章，2002 年發表在 Structure第10卷，1363 - 1370頁。該菌種的獲取可以由文章作者或August Bock教授贈予。實施例2:用SPP系統和營養缺陷型原核表達系統聯合制備基因工程人GPXl在保持氨基酸序列不變的前提下，根據基因文庫中公開的GPXl的基因(參見NCBI,NM_000581.2)序列直接合成其編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和Nde I酶切位點，3'端含有終止密碼子和Hind III酶切位點，GPXl基因的第49號SeCys的編碼序列TGA替換為Cys的密碼子(TGC)，GPX1基因中其它所有Cys的密碼子替換為Ser的密碼子，且基因全長不含有ACA序列。用限制性內切酶Nde I和Hind III雙酶切后，連接到同樣酶切的pCold III (TAKARA，Cat.#3369)載體上。用裝有GPXl基因的載體(pCold II1-GPX1)轉化營養缺陷型大腸桿菌BL21(DE3)Cys，涂含有Cys的營養瓊脂平板，篩選陽性菌株。再將表達核酸內切酶MazF的質粒pMazF(TAKARA, Cat.#3369)轉化到該陽性菌株中。將菌液均勻涂布在含100 μ g/mL Amp,25 μ g/mLKana和25 μ g/mL的M9-CAA固體培養基中篩選陽性轉化子。將陽性轉化子接種于1.2L M9缺陷表達培養基(在M9培養基中加入100 μ g/ml氨節青霉素、50 μ g/ml卡那霉素、50 μ g/mlCys和除了 Cys之外的19種氨基酸各100 μ g/ml)中至0D600為0.5。將菌液置于_20°C冰箱中5min，使菌液迅速冷卻，之后將菌液置于15°C中繼續振蕩培養45min。15°C 5000rpm離心5min,棄上清。0.9%NaCl重懸菌體沉淀，15°C 5000rpm離心5min,棄上清,重復該步驟。然后用生產培養基(在M9培養基中加入除了 Cys之外的19種氨基酸各50-400 μ g/ml)重懸菌體，加入終濃度為lmmol/L IPTG和終濃度為200 μ g/mL SeCys, 15°C振蕩培養16_48h，使GPXl以可溶性形式表達在菌體的周質腔里，而MazF能通過識別并切斷單鏈RNA特定序列ACA,抑制宿主蛋白質的表達。收集菌體(6000rpm, IOmin)并用等體積的bufferT (50mMTris buffer, pH7.5,含ImM EDTA)洗漆兩次。用BufferT重懸菌體沉淀,加入終濃度ImM的PMSF (苯甲基磺酰氟)，超聲破碎菌體，40C，12000rpm離心30min，收集上清。按說明書處理GSH親合柱，應用緩沖液(50mmol/L Tris，pH7.5)平衡，將上清液加入GSH親合柱上，用平衡緩沖液洗脫雜蛋白，用lOmmol/L GSH洗脫目的蛋白。將洗脫液透析并凍干，即得人GPXl。其GPX活力為3305U/ μ mol，達到天然GPX的數量級水平。本實施例使用的SPP低溫表達系統能利用MazF蛋白酶特異性識別并切割含有ACA序列的mRNA的特性，使菌體只 能合成編碼基因中無ACA序列的蛋白質，因此新合成的蛋白主要是外源重組蛋白，從而提高產率和Cys向SeCys的轉化率。實施例3:用真核表達系統一步轉染制備基因工程人GPX41.人GPX4表達載體的構建:用mRNA小量提取試劑盒(Sigma, Cat#MRN_10)從HepG-2 (DSMZ#ACC180)肝癌細胞中提取 mRNA，在逆轉錄酶(AMV RT, Promega, Cat#M5101)和oligo (dT)存在下，通過RT-PCR (逆轉錄聚合酶鏈反應)將其轉錄成雙鏈cDNA。在保持氨基酸序列不變的前提下，根據基因文庫中公開的人GPX4 (NCBI,NM_002085.3)的基因序列設計引物擴增GPX4的編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和EcoRI酶切位點，3'端引物選在GPX4mRNA的多聚寡核苷酸A前一個堿基后插入NotI酶切位點，確保在GPX4終止密碼子下游含有硒代半胱氨酸插入序列(從GPX4的終止密碼子到多聚寡核苷酸A之前的全部堿基序列)。用EcoRI/Notl酶切位點將GPX4基因連同硒代半胱氨酸插入序列連接到同樣酶切的哺乳類細胞表達載體pSecTag2A (Invitrogen公司)上；同理在保持氨基酸序列不變的前提下，根據基因文庫中人硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2 (SBP2, NCBI,NM_024077.3) C端的512個氨基酸(343_854aa)的基因序列設計引物擴增其編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和XbaI酶切位點，3'端含有終止密碼子和EcoRI酶切位點。用多克隆位點將SBP2的C端(343-854aa)基因組裝到同樣酶切的胞內型哺乳類細胞表達載體 pcDNA3.1/myc-His A(Invitrogen 公司)上。2.人GPX4陽性細胞株的篩選:當細胞生長到I X 106/ml的密度時，用含有SBP2和GPX4基因的表達載體在Lipofectamine2000轉染試劑(Invitrogen,按說明書使用)介導下共轉染293F細胞(Invitrogen, R79007)，轉染后72小時將細胞轉入培養皿中開始貼壁培養，貼壁培養48 (通常2-50)小時后換含有G418和Zeocin的培養液，篩選具有兩種抗性即同時穩定表達SBP2和GPXl兩種外源蛋白的陽性細胞克隆，期間G418和Zeocin濃度分別從800-200 μ g/ml和400-100 μ g/ml逐步遞減,每次分別減200 μ g/ml和100 μ g/ml,每個濃度使用5天，2-3天換一次培養液，篩選培養20天后將陽性細胞克隆用96、48、24、12和6孔培養板逐級放大培養。用抗GPX4抗體和ELISA技術檢測GPX4蛋白的表達量，挑選靶蛋白表達量高的細胞株用于擴培養和凍存。3.人GPX4的表達與純化:在大容量含有1_10 μ M亞硒酸鈉的293F表達培養基中擴培養2中篩選獲得的同時穩定表達SBP2和GPX4兩種外源蛋白的細胞株。在SBP2、SECIS和293細胞中其它蛋白因子的共同參與下，GPX4以可溶性形式表達并分泌于培養基中，每48小時收集一次培養液。培養液經IOKDa分子量超濾膜濃縮20倍后，用GSH親和層析柱純化GPX4，收集含有GPX4的洗脫液，透析除去小分子物質，凍干即得人GPX4。其GPX活力為3050U/ μ mol，達到天然GPX的數量級水平。實施例4:用真核表達系統分步轉染制備基因工程人GPX41.人GPX4表達載體的構建:用mRNA小量提取試劑盒(Sigma, Cat#MRN_10)從HepG-2 (DSMZ#ACC180)肝癌細胞中提取 mRNA，在逆轉錄酶(AMV RT, Promega, Cat#M5101)和oligo (dT)存在下，通過RT-PCR(逆轉錄聚合酶鏈反應)將其轉錄成雙鏈cDNA。在保持氨基酸序列不變的前提下，根據基因文庫中公開的人GPX4 (NCBI,NM_002085.3)的基因序列設計引物擴增GPX4的編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和EcoRI酶切位點，3'端引物選在GPX4mRNA的多聚寡核苷酸A前一個堿基后插入NotI酶切位點，確保在GPX4終止密碼子下游含有硒代半胱氨酸插入序列(從GPX4的終止密碼子到多聚寡核苷酸A之前的全部堿基序列)。用EcoRI/Notl酶切位點將GPX4基因連同硒代半胱氨酸插入序列連接到同樣酶切的哺乳類細胞表達載體pSecTag2A (Invitrogen公司)上；同理在保持氨基酸序列不變的前提下，根據基因文庫中人硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2 (SBP2, NCBI,NM_024077.3) C端的512個氨基酸(343_854aa)的基因序列設計引物擴增其編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和XbaI酶切位點，3'端含有終止密碼子和EcoRI酶切位點。用多克隆位點將SBP2的C端(343-854aa)基因組裝到同樣酶切的胞內型哺乳類細胞表達載體 pcDNA3.1/myc-His A (Invitrogen 公司)上。2.人GPX4陽 性細胞株的篩選:當細胞生長到lX106/ml的密度時，用含有SBP2基因的表達載體在Lipofectamine2000轉染試劑(Invitrogen,按說明書使用)介導下轉染293F細胞(Invitrogen，R79007)，轉染后72小時將細胞轉入培養皿中開始貼壁培養，貼壁培養48 (通常2-50)小時后換含有G418的培養液，篩選具有G418抗性即穩定表達SBP2的陽性細胞克隆，期間G418濃度從800 μ g/ml逐步遞減到200 μ g/ml,每次減200 μ g/ml,每個濃度使用5天，2-3天換一次培養液，篩選培養20天后將陽性細胞克隆用96、48、24、12和6孔培養板逐級放大培養。再用含有GPX4基因的表達載體在lipofectamine2000轉染試劑(Invitrogen,按說明書使用)介導下轉染穩定表達SBP2的293F細胞(Invitrogen,R79007)，轉染后72小時將細胞轉入培養皿中開始貼壁培養，貼壁培養48 (通常2_50)小時后換含有G418和Zeocin的培養液篩選具有兩種抗性即同時穩定表達SBP2和GPXl兩種外源蛋白的陽性細胞克隆，期間G418濃度維持在200 μ g/ml, Zeocin濃度從400 μ g/ml逐步遞減到100 μ g/ml,每次減100 μ g/ml,每個濃度使用5天，2_3天換一次培養液,篩選培養20天后將具有兩種抗性的陽性細胞克隆用96、48、24、12和6孔培養板逐級放大培養。用抗GPX4抗體和ELISA技術檢測GPX4蛋白的表達量，挑選靶蛋白表達量高的細胞株用于擴培養和凍存。上述方法也可以先轉染GPX4基因，后轉染SBP2基因。3.人GPX4的表達與純化:在大容量含有1_10 μ M亞硒酸鈉的293F表達培養基中擴培養2中篩選獲得的同時穩定表達SBP2和GPX4兩種外源蛋白的細胞株。在SBP2、SECIS和293F細胞中其它蛋白因子的共同參與下，GPX4以可溶性形式表達并分泌于培養基中，每48小時收集一次培養液。培養液經IOKDa分子量超濾膜濃縮20倍后，用GSH親和層析柱純化GPX4，收集含有GPX4的洗脫液，透析除去小分子物質，凍干即得人源GPX4。其GPX活力為3050U/ μ mol，達到天然GPX的數量級水平。
權利要求
1.一種基因工程法制備重組谷胱甘肽過氧化物酶GPX，是用營養缺陷型原核表達系統制備重組GPX，具體過程是， 1)表達載體的構建: 在保持氨基酸序列不變的前提下，根據基因文庫中GPX基因序列設計引物擴增或直接合成其編碼基因，確保GPX基因的5'端含有起始密碼子，3'端含有終止密碼子；用多克隆位點將GPX基因組裝到分泌型原核表達載體上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據要突變為半胱氨酸的硒代半胱氨酸的位置和它比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長35-50bp，用定點突變引物和快速定點突變試劑盒，將構建在原核表達載體上的GPX基因中的硒代半胱氨酸的編碼序列突變成半胱氨酸的密碼子；同樣將GPX基因中的其它半胱氨酸突變成絲氨酸；通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發生；所述的多克隆位點，是載體上固有的由多個核酸限制性內切酶識別的堿基組成的DNA序列； 2)陽性轉化子的篩選及蛋白的表達與純化: 將含有突變的GPX基因的載體轉化營養缺陷型菌株-BL21 (DE3) Cys的感受態細胞，涂含半胱氨酸的營養瓊脂平板，篩選陽性轉化子；將陽性轉化子擴培養后，在含有硒代半胱氨酸、必需生長因子和營養素的培養基里，經異丙基硫代-β-D-半乳糖苷誘導，營養缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys能用半胱氨酸的密碼子合成硒代半胱氨酸，最后直接表達出在底物谷胱甘肽的結合部位含有硒代半胱氨酸的GPX，酶蛋白以可溶性形式表達并分泌到菌體的周質腔里；先小量培養篩選高表達株，再擴大培養和誘導表達；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽親和層析純化GPX，透析凍干后即得酶蛋白純品。
2.根據權利要求1所述的基因工程法制備重組谷胱甘肽過氧化物酶GPX，其特征是，所述的用谷胱甘肽親和 層析純化GPX，是用pH7.5,50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含10mmol/L谷胱甘肽的緩沖液洗脫目的蛋白。
3.一種基因工程法制備重組谷胱甘肽過氧化物酶GPX，是用單一蛋白生產系統和營養缺陷型原核表達系統聯合制備重組GPX，具體過程是， 1)表達載體的構建: 在保持氨基酸序列不變的前提下，根據基因文庫中GPX的基因序列直接合成其編碼基因，確保GPX基因的5'端含有起始密碼子，3'端含有終止密碼子，GPX基因的硒代半胱氨酸的編碼序列替換為半胱氨酸的密碼子，GPX基因中其它所有半胱氨酸的密碼子替換為絲氨酸的密碼子，且GPX基因全長不含有ACA序列；用多克隆位點將GPX基因組裝到分泌型原核表達載體上；所述的多克隆位點，是載體上固有的由多個核酸限制性內切酶識別的堿基組成的DNA序列； 2)陽性轉化子的篩選及蛋白的表達與純化: 將含有合成的GPX基因的載體轉化營養缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys的感受態細胞，涂含半胱氨酸的營養瓊脂平板，篩選陽性菌株；再將表達核酸內切酶MazF的質粒pMazFR化陽性菌株，用含雙抗性的M9固體培養基篩選陽性轉化子；將陽性轉化子擴培養后，在含有硒代半胱氨酸、必需生長因子和營養素的培養基里，經異丙基硫代-β -D-半乳糖苷低溫4-25°C誘導表達，營養缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys能用半胱氨酸的密碼子合成硒代半胱氨酸，直接表達出在底物谷胱甘肽的結合部位含有硒代半胱氨酸的重組GPX，酶蛋白以可溶性形式表達并分泌到菌體的周質腔里,而MazF能通過識別并切斷單鏈RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白質的表達；先小量培養篩選高表達株，再擴大培養和誘導表達；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽親和層析純化GPX，透析凍干后即得酶蛋白純品。
4.根據權利要求3所述的基因工程法制備重組谷胱甘肽過氧化物酶GPX，其特征是，所述的用谷胱甘肽親和層析純化GPX，是用pH7.5,50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含10mmol/L谷胱甘肽的緩沖液洗脫目的蛋白。
5.一種基因工程法制備重組谷胱甘肽過氧化物酶GPX，是用哺乳類細胞制備重組GPX，具體過程是， 1)表達載體的構建: 在保持氨基酸序列不變的前提下，根據基因文庫中GPX基因序列設計引物擴增或直接合成GPX的編碼基因，確保GPX基因的5'端含有起始密碼子和期望的酶切位點，3'端在終止密碼子下游引入硒代半胱氨酸插入序列和期望的酶切位點；用多克隆位點將GPX基因連同硒代半胱氨酸插入序列組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；在保持氨基酸序列不變的前提下，根據基因文庫中硒代半胱氨酸插入序列結合硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2C端的512個氨基酸(343-854aa)的基因序列設計引物擴增或直接合成其編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子和期望的酶切位點，3'端含有終止密碼子和期望的酶切位點，用多克隆位點將硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2基因組裝到胞內型哺乳類細胞表達載體上；所述的多克隆位點，是載體上固有的由多個核酸限制性內切酶識別的堿基組成的DNA序列； 2)陽性細胞株的篩選: 用含有硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2和GPX基因的載體在轉染試劑的介導下共轉染哺乳類細胞，用兩個載體上的抗`性基因通過抗生素濃度從高到低逐級遞減法篩選兼具兩種抗性的陽性細胞克隆，再用多孔培養板逐級放大培養陽性克隆，最終獲得同時穩定表達硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2和GPX兩種外源蛋白的陽性細胞株；檢測GPX蛋白的表達量并篩選靶蛋白表達量高的細胞株； 3)靶蛋白的表達與純化: 在搖瓶中將同時表達兩種外源蛋白的細胞株放大培養，在含有亞硒酸鈉的培養基里用哺乳類細胞表達重組GPX，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養基里，用谷胱甘肽親和層析純化重組GPX，透析凍干后即得酶蛋白純品。
6.根據權利要求5所述的基因工程法制備重組谷胱甘肽過氧化物酶GPX，其特征是，所述的檢測GPX蛋白的表達量，是用每種靶蛋白的抗體和ELISA或GPX活力測定技術進行檢測。
7.根據權利要求5所述的基因工程法制備重組谷胱甘肽過氧化物酶GPX，其特征是，所述的用谷胱甘肽親和層析純化重組GPX，是用pH7.5,50mmol/LTris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L谷胱甘肽的緩沖液洗脫目的蛋白。
8.一種基因工程法制備重組谷胱甘肽過氧化物酶GPX，是分步用含有硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2基因的載體和含有GPX基因的載體轉染同一哺乳類細胞，具體過程是，1)表達載體的構建: 在保持氨基酸序列不變的前提下，根據基因文庫中GPX的基因序列設計引物擴增或直接合成GPX的編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子和期望的酶切位點，3'端在終止密碼子下游引入硒代半胱氨酸插入序列和期望的酶切位點；用多克隆位點將GPX基因連同硒代半胱氨酸插入序列組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；在保持氨基酸序列不變的前提下，根據基因文庫中硒代半胱氨酸插入序列結合硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2C端的512個氨基酸(343-854aa)的基因序列設計引物擴增或直接合成其編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子和期望的酶切位點，3'端含有終止密碼子和期望的酶切位點，用多克隆位點將硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2基因組裝到胞內型哺乳類細胞表達載體上；所述的多克隆位點，是載體上固有的由多個核酸限制性內切酶識別的堿基組成的DNA序列； 2)陽性細胞株的篩選: 先用含有硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2基因的載體轉染哺乳類細胞，通過該載體上的抗性基因篩選穩定表達硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2的細胞株。再用含有GPX基因的載體轉染穩定表達硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2的細胞株，用兩個載體上的抗性基因篩選同時穩定表達硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2和GPX兩種外源蛋白的細胞株；檢測GPX蛋白的表達量并篩選靶蛋白表達量高的細胞株； 3)靶蛋白的表達與純化: 在搖瓶中將同時表達兩種外源蛋白的細胞株放大培養，在含有亞硒酸鈉的培養基里用哺乳類細胞表達重組GPX，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養基里；用谷胱甘肽親和層析純化重組GPX，透析凍干后即得 酶蛋白純品。
9.根據權利要求8所述的基因工程法制備重組谷胱甘肽過氧化物酶GPX，其特征是，在陽性細胞株的篩選中，所述的陽性細胞株的篩選，先轉染GPX4基因，后轉染硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2基因，再用兩個載體上的抗性基因篩選同時穩定表達蛋白2和GPX兩種外源蛋白的細胞株；所述的檢測GPX蛋白的表達量，是用每種靶蛋白的抗體和ELISA或GPX活力測定技術進行檢測。
10.根據權利要求8所述的基因工程法制備重組谷胱甘肽過氧化物酶GPX，其特征是，所述的用谷胱甘肽親和層析純化重組GPX，是用pH7.5,50mmol/LTris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含10mmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
全文摘要
本發明的基因工程法制備重組谷胱甘肽過氧化物酶屬于生物技術的領域。先將靶基因組裝到分泌型原核表達載體上，用基因突變法通過營養缺陷型原核表達系統或營養缺陷型和SPP低溫聯合表達系統，將GPX的催化基團SeCys引入到GPX的底物結合部位，結果賦予其高的GPX的活性；或者先將靶基因連同SeCys插入序列組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上，再將SeCys插入序列結合蛋白2組裝到胞內型哺乳類細胞表達載體上，將兩種載體共轉染同一哺乳細胞株，在亞硒酸鈉存在下用哺乳細胞合成GPX。本發明方法簡單，重組GPX活力和產量高、穩定性好，避免包涵體復性造成的產率下降和失活，從而解決天然GPX來源有限和性質不穩定問題。
文檔編號C12N15/85GK103224915SQ20131014286
公開日2013年7月31日 申請日期2013年4月24日 優先權日2013年4月24日
發明者魏景艷, 宋健, 邢瑞慶 申請人:吉林大學