專利名稱：抗口蹄疫病毒RNAi轉基因家畜的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種獲得抗口蹄疫病毒RNAi轉基因家畜的動物轉基因技術方法，屬于細胞工程領域。
背景技術：
口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的牛、羊、豬等偶蹄類動物發生的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，世界動物衛生組織將其列為A類烈性傳染病之首，一旦暴發，必須撲殺感染及接觸感染的動物。2001年英國暴發口蹄疫損失約90億英鎊，占其國內生產總值的1. 1%；2005年我國部分地區暴發Asia I型FMD，2009年初多個省區又發生了 A型FMD，不僅造成了巨大的直接經濟損失，而且嚴重危害畜牧業的健康發展以及相關產品的對外貿易，對國家的政治、 經濟具有深遠的影響。目前，大多數流行FMD的國家以計劃免疫為主的措施預防FMD。盡管新型疫苗不斷涌現，但傳統滅活疫苗仍是預防FMD的基礎。FMDV變異快，血清型多，且不同血清型疫苗之間沒有交叉保護，故通過疫苗免疫的單一手段很難控制和根除FMD。因此，科學家們在注重疫苗研發的同時，開始探索防控FMD的新策略，RNAinterference (RNAi)因快速、特異的抗病毒能力而成為新的研究熱點。表達針對病毒不同基因的RNAi可切斷病毒復制的源頭，進而阻斷病毒感染及其擴散和傳播，將打破傳統的通過免疫學手段預防病毒病的思維模式，為控制和消滅家畜病毒病開辟新的途徑。RNAi是抑制病毒增殖的理想工具，其抗病毒功能在HIV(Chang等， 2005 ；Das 等；2004 ；Dave 和 Pomerantz，2004 ；Wu 等，2007)、HBV (Wu 等，2005 ；Wu 等，2007)、 埃博拉病毒(Geisbert等，2006)、脊髓灰質炎病毒(Gitlin等，200 等病毒病的防控中進行了廣泛的研究，并得到了驗證。許多學者針對FMDV不同基因并在細胞、實驗動物及敏感動物豬等不同水平對 RNAi抗FMDV作用進行了探索和研究，目前的研究結果如下Liu等Q005)體外合成針對FMDV基因組5’ NCR、VP4、VPg,3D和3’ NCR保守區的siRNA可抑制同種及異種FMDV在 BHK-21細胞內的增殖，病毒感染4 后的抑制率為10-1000倍，其特異性的抑制作用可持續6天以上；該研究以多基因交叉保護的方式抑制了 FMDV在BHK-21細胞內的復制，為高度變異的FMDV的防控提供了新的策略。de Ios Santos等^00 構建了針對4種血清型2B 基因保守區的shRNA表達質粒，轉染豬細胞后，可明顯抑制病毒RNA及蛋白的合成，并減少了病毒的產率，該shRNA抗病毒作用是其序列特異性的，并不是誘導產生的干擾素導致的。 Kahana等Q004)針對FMDV所有血清型和3D基因的保守區設計并合成了 3個siRNA， 共轉染BHK-21細胞后，病毒在細胞內的增殖被100%的抑制。Kim等Q008)在FMDV感染前，接種表達siRNA的腺病毒有效地抑制了 FMDV在豬IBRS-2細胞內的增殖，若在FMDV感染前和感染后均使用siRNA，其抗病效果更理想。Lv等Q009)利用T7RNA聚合酶體外合成的3個siRNA可特異性地沉默VPl-EGFP融合基因在293細胞內的表達；瞬時轉染的siRNA可抑制FMDV在BHK-21細胞內的增殖。Pengyan等(2008)針對7個血清型的3D和2B1基因的siRNA/shRNA可減少FMDV在BHK-21細胞內的生長滴度；頸部皮下注射shRNA表達質粒后，FMDV對乳鼠的攻擊減弱。Joyappa等Q009)將表達針對3D基因的shRNA的質粒轉染BHK-21細胞后，用IO2TCID5tl的FMDV攻毒，與對照組比，病毒生長滴度下降3倍；用該質粒接種豚鼠后，對IO3GPID5tl的FMDV攻毒保護率為80%。Chen等Q004)轉染針對VPl的 shRNA重組表達質粒，可使FMDV VPl在BHK-21細胞內的表達下降80-90%，進而特異性地抗病毒感染，其抗病毒作用可持續48h;皮下注射該質粒的乳鼠對FMDV的敏感性顯著下降。 Chen等Q006)利用表達針對3D基因siRNA的復制缺陷型的人5型腺病毒阻止同種和異種FMDV對豬IBRS-2細胞的感染，并顯著地降低了豚鼠及豬對FMDV感染的敏感性。Cong等 (2010a)構建了可針對VPl基因的不同靶點的siRNA表達質粒，在BHK-21細胞內其對A、0 和Asia I型VPl的表達具有沉默作用，并可抑制0型和Asia I型病毒的增殖；頸部皮下注射其可明顯地降低乳鼠對0型和Asia I型病毒的敏感性。Cong等(2010b)利用BHK-21 細胞病毒感染及乳鼠攻毒保護試驗，篩選出針對3D(p3D-NT56)和2B基因的抗FMDV RNAi ； 在豚鼠的攻毒保護試驗中，攜帶P3D-NT56的&ilmonella choleraesuis C500減毒疫苗株 (P3D-NT56/S. cho)對RNAi同種的FMDV的攻毒保護率為80% ；預先接種p3D_NT56/S. cho 劑量為^clO9CFU的豬，在FMDV攻毒后9天內的保護率為100%。上述研究結果表明，RNAi 是控制高傳染性FMDV在家畜中傳播的可選擇的具有潛力的策略。轉基因體細胞克隆技術是比較常用的家畜轉基因技術，是基因組修飾技術與動物體細胞核移植技術有機結合而產生的一種新的轉基因動物制作技術，它部分地克服了傳統轉基因動物外源基因整合率低、大動物生產成本高的技術瓶頸，代表當前轉基因動物制作的主流方向。在該方法中，核供體細胞在核移植前要經過重組質粒載體轉染或重組病毒載體感染、篩選和鑒定等環節，提高了轉基因動物的陽性率。各種轉基因動物的制作方法均需先構建目的基因的重組載體，用于轉基因技術的基因載體可分為病毒載體、質粒載體及人工染色體等。其中Lenti-virus在介導基因轉移研究中，發揮了重要作用。以人類免疫缺陷病毒I型(HIV-I)為代表的Lenti-virus是復雜的逆轉錄病毒，經改造的Lenti-virus 作為外源基因載體，具有其獨特的優勢。慢病毒載體具有可感染分裂細胞及非分裂細胞、轉移基因片段容量較大、目的基因表達時間長、不易誘發宿主免疫反應等優點(Cockrell等， 2007)，是較好的RNAi轉基因載體。Golding等Q006)利用RNAi技術針對引起牛瘋牛病和羊癢病的PRNP基因序列設計有效的siRNA，獲得1頭轉基因羊胎兒，檢測發現siRNA很好地抑制了體內PRNP基因的表達。本發明根據Kahana 等 Q004)及 Joyappa 等 Q009)驗證的抗 FMDV siRNA/shRNA 序列(本發明中分別為3B1、3D1和3D2)，構建了表達抗FMDV的shRNA重組Lenti-virus載體，利用轉基因體細胞克隆技術獲得了抗FMDV RNAi轉基因家畜。參考文獻1. 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發明內容
針對上述現有技術，本發明的發明人進行了研究，研究表明，通過表達抗口蹄疫病毒RNAi獲得的雜合子或純合子轉基因家畜的FMDV感染率明顯下降，具備了抗FMD的能力。 因此，制備抗口蹄疫病毒RNAi轉基因家畜的方法是獲得抗FMD轉基因家畜的最佳方法之一。本發明的目的是提供一種通過表達抗口蹄疫病毒RNAi獲得抗口蹄疫轉基因家畜的方法。通過本發明的方法獲得的轉基因家畜抑制FMDV在體內的增殖，其FMDV感染率明顯下降。本發明是通過以下技術方案實現的一種通過表達抗口蹄疫病毒RNAi獲得抗口蹄疫轉基因家畜的方法，其特征在于 是將攜帶shRNA堿基序列如表1及GFP報告基因的抗口蹄疫病毒RNAi重組Lenti-virus 載體線性化并轉染正常家畜的胎兒成纖維細胞，利用報告基因GFP、通過流式細胞分選儀篩分轉基因核供體細胞，將核供體細胞核導入家畜的去核卵母細胞中得到重構胚，再將重構胚移入代孕家畜子宮中，得到的子代即為抗口蹄疫病毒RNAi的雜合子轉基因家畜。還包括以下方法雜合子轉基因公畜和雜合子轉基因母畜正常交配或人工授精繁殖而獲得純合子轉基因家畜。所述家畜為牛、羊或豬，優選奶牛和肉牛。所述家畜胎兒成纖維細胞為35 150日齡胎兒不同組織來源的成纖維細胞，包括耳成纖維細胞、皮膚成纖維細胞、輸卵管上皮細胞或卵丘細胞，優選皮膚成纖維細胞。所述將線性化的攜帶有抗口蹄疫病毒RNAi及報告基因的重組Lenti-virus載體轉染家畜胎兒成纖維細胞方法為電轉染法、脂質體轉染法、病毒載體法或磷酸鈣沉淀法，優選脂質體轉染法。所述脂質體轉染法的條件為線性化的載體DNA濃度不低于lyg/yL，DNA 脂質體 LTX =1:3。所述將抗口蹄疫病毒RNAi轉基因核供體細胞核導入家畜的去核卵母細胞的方法為顯微注射法。所述去核卵母細胞不帶有第一極體。本發明利用RNAi技術和體細胞克隆的方法將線性化的攜帶有抗口蹄疫病毒RNAi 及報告基因的重組Lenti-virus載體轉染家畜胎兒成纖維細胞，獲得抗口蹄疫病毒RNAi轉基因核供體細胞，將其細胞核導入家畜的去核卵母細胞中得到重構胚，再將重構胚移入代孕家畜子宮中，得到的子代即為抗口蹄疫病毒RNAi的雜合子轉基因家畜。經雜合子轉基因公畜和雜合子轉基因母畜正常交配或人工授精繁殖而獲得純合子轉基因家畜。用本方法獲得的轉基因家畜可表達抗口蹄疫病毒RNAi，使FMDV感染率明顯下降，具備了抗FMD的能力。 本發明打破了傳統的通過免疫學手段預防FMD的思維模式，為控制和消滅家畜FMD開辟了新的途徑，具有較高的實用價值和廣闊的市場前景。
圖1為體細胞克隆抗口蹄疫病毒RNAi轉基因家畜的生產流程圖。圖 2Lenti-virus Hl 載體酶切結果，其中，M :DL marker 10，000 ；1 =SmaI 和 AgeI 雙酶切Hl載體；2 =XbaI和AgeI雙酶切Hl載體。圖3RNAi重組Hl載體的PCR鑒定結果，其中，M =DL marker 2，000 ；1 陽性對照； 2 空載體陰性對照；3 :RNAi-3Bl ；4 :RNAi_3Dl ；5 :RNAi_3D2#l ；6 :RNAi-3D2#20圖4抗口蹄疫病毒RNAi轉基因奶牛胎兒的PCR鑒定結果，其中，M :DL marker 2，000 ；1和2 轉基因胎兒，3 非轉基因奶牛胎兒對照。圖5為抗口蹄疫病毒RNAi轉基因奶牛的Southern雜交鑒定結果，其中，1.普通荷斯坦奶牛，2為轉基因奶牛。圖6反向PCR方法擴增RNAi插入位點的側翼序列，在第一次PCR基礎上，做槽式 PCR，對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，其中，M.DNA Marker ；1.為轉基因奶牛1 ；2 為轉基因奶牛2。圖7為接種病毒后奶牛出現臨床體癥時間的比較結果，接種病毒的正常奶牛組奶牛全部發病(3/3)，抗病個體率為0，而接種病毒的轉基因奶牛組中抗病毒感染的奶牛(抗 FMD奶牛)1頭，發病奶牛2頭(2/3)，抗病個體率33. 3% ；接種病毒后，與正常奶牛發病時間(平均為2. 05天)比較，發病的轉基因奶牛出現臨床體癥時間(平均為4. 85天)明顯的滯后。其中，1.正常荷斯坦奶牛，2為轉基因奶牛。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步的說明。下述實施例中無特別說明均為常規方法，所用試劑及藥品如無特別說明均購自 Sigma公司。
實施例1 體細胞克隆抗口蹄疫病毒RNAi轉基因奶牛的生產及分子生物學檢測體細胞克隆抗口蹄疫病毒RNAi雜合子轉基因奶牛的生產流程如圖1所示，具體過程包括如下步驟1. shRNA重組Hl表達質粒的構建將化學合成的RNAiIBll 和 RNAi_3B12、RNAi_3Dll 和 RNAi_3D12、RNAi_3D21 和 RNAi-3D22 (見表1)分別退火后，與經XbaI和AgeI雙酶切的Hl Lenti-virus載體所獲得的12. 5kb以及經SmaI和AgeI雙酶切Hl載體所獲得的1. 5kb片段(圖2)按照如下體系連接12. 51Λ 載體片段，IOOng ；1. 51Λ 載體片段，50ng ；shRNA oligo，50ng ；T4DNA 連接酶， 0. 5 μ L ； 10 X T4DNA連接酶buffer，2 μ L，補足H2O使體系至20 μ L，16°C過夜連接。轉化大腸桿菌DH5ci株感受態細胞，挑選克隆，提取質粒DNA，經PCR鑒定并經測序確認獲得了相應的shRNA重組Hl載體，用于后續試驗。PCR鑒定陽性重組質粒的方法是以小提質粒為模板，以已知重組陽性質粒及空載體為對照，在引物LT-Pl 5’ -TGTCGCTATGTGTTCTGGGA-3’和引物LT-P2:5’ -GGTACAGTGCAGGGGAAAGA-3’的引導下，反應條件如下94°C30s ；94°C 20s 57°C 20s 68°C 30s，;35 個循環；68°C 3min,反應結束后對PCR產物進行3 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，重組shRNA的質粒PCR擴增結果為300bp片段，空載體的擴增結果為250bp片段。結果如圖3所示，其中，M =DL marker2, 000 ；1 陽性對照；2 空載體陰性對照；3 :RNAi_3Bl ；4 :RNAi_3Dl ；5 RNAi-3D2#l ；6 :RNAi_3D2#2。表1沉默FMDV 及3D基因的shRNA序列
權利要求
1.一種通過表達抗口蹄疫病毒RNAi獲得抗口蹄疫轉基因家畜的方法，其特征在于是將攜帶shRNA堿基序列及GFP報告基因的抗口蹄疫病毒RNAi重組Lenti-virus載體線性化并轉染正常家畜的胎兒成纖維細胞，利用報告基因GFP、通過流式細胞分選儀篩分轉基因核供體細胞，將核供體細胞核導入家畜的去核卵母細胞中得到重構胚，再將重構胚移入代孕家畜子宮中，得到的子代即為抗口蹄疫病毒RNAi的雜合子轉基因家畜。
2.根據權利要求1所述的通過表達抗口蹄疫病毒RNAi獲得抗口蹄疫轉基因家畜的方法，其特征在于，還包括以下方法雜合子轉基因公畜和雜合子轉基因母畜正常交配或人工授精繁殖而獲得純合子轉基因家畜。
3.根據權利要求1或2所述的通過表達抗口蹄疫病毒RNAi獲得抗口蹄疫轉基因家畜的方法，其特征在于所述家畜為牛、羊或豬。
4.根據權利要求3所述的通過表達抗口蹄疫病毒RNAi獲得抗口蹄疫轉基因家畜的方法，其特征在于所述家畜為奶牛或肉牛。
5.根據權利要求1或2所述的通過表達抗口蹄疫病毒RNAi獲得抗口蹄疫轉基因家畜的方法，其特征在于所述家畜胎兒成纖維細胞為35 150日齡胎兒不同組織來源的成纖維細胞。
6.根據權利要求5所述的通過表達抗口蹄疫病毒RNAi獲得抗口蹄疫轉基因家畜的方法，其特征在于所述家畜胎兒成纖維細胞為耳成纖維細胞、皮膚成纖維細胞、輸卵管上皮細胞或卵丘細胞。
7.根據權利要求1或2所述的通過表達抗口蹄疫病毒RNAi獲得抗口蹄疫轉基因家畜的方法，其特征在于所述將線性化的攜帶有抗口蹄疫病毒RNAi及報告基因的重組 Lenti-virus載體轉染家畜胎兒成纖維細胞方法為電轉染法、脂質體轉染法、病毒載體法或磷酸鈣沉淀法。
8.根據權利要求7所述的通過表達抗口蹄疫病毒RNAi獲得抗口蹄疫轉基因家畜的方法，其特征在于所述將線性化的攜帶有抗口蹄疫病毒RNAi及報告基因的重組 Lenti-virus載體轉染家畜胎兒成纖維細胞方法為脂質體轉染法，脂質體轉染法的條件為 線性化的載體DNA濃度不低于1 μ g/ μ L，DNA 脂質體LTX = 1 3。
9.根據權利要求1或2所述的通過表達抗口蹄疫病毒RNAi獲得抗口蹄疫轉基因家畜的方法，其特征在于所述將抗口蹄疫病毒RNAi轉基因核供體細胞核導入家畜的去核卵母細胞的方法為顯微注射法。
10.根據權利要求1或2所述的通過表達抗口蹄疫病毒RNAi獲得抗口蹄疫轉基因家畜的方法，其特征在于所述去核卵母細胞不帶有第一極體。
全文摘要
本發明公開了一種通過表達抗口蹄疫病毒RNAi獲得抗口蹄疫轉基因家畜的方法是將攜帶shRNA堿基序列及GFP報告基因的抗口蹄疫病毒RNAi重組Lenti-virus載體線性化并轉染正常家畜的胎兒成纖維細胞，利用報告基因GFP、通過流式細胞分選儀篩分轉基因核供體細胞，將核供體細胞核導入家畜的去核卵母細胞中得到重構胚，再將重構胚移入代孕家畜子宮中，得到的子代即為抗口蹄疫病毒RNAi的雜合子轉基因家畜。雜合子轉基因公畜和雜合子轉基因母畜正常交配或人工授精繁殖即獲得純合子轉基因家畜。用本方法獲得的轉基因家畜可表達抗口蹄疫病毒RNAi，使FMDV感染率明顯下降，具備了抗FMD的能力。
文檔編號C12N15/85GK102559762SQ20111034977
公開日2012年7月11日 申請日期2011年11月8日 優先權日2010年11月8日
發明者仲躋峰, 何洪彬, 侯明海, 劉曉, 宋玲玲, 楊宏軍, 武剛, 武建明, 王洪梅, 高運東 申請人:山東省農業科學院奶牛研究中心