專利名稱：一種復方殺病毒制品的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種復方殺病毒制品的制備方法，屬于天然產物藥理活性和分離與提純天然產物方法。其商品名為“芩翹”。
背景技術：
自古以來，植物被認為有減輕疼痛和治愈疾病的功能。今天在75％以上藥品中，我們仍然依靠植物的治病功能。幾個世紀以來，世界各地的科學家已經建立自己的體系去研究開發藥用植物以及他們的使用方法。一些方法看起來比較合理和實用。但是，所有的使用方法都是試圖戰勝疾病和痛苦，提高生活質量。
在諸多疾病中，病毒疾病是引人驚恐的疾病之一。流感病毒十年一次大的變異流行，五年一次小的變異流行，人們無法事先知道未來的流感病毒的變異趨勢和具體變異結果，又不得不面對突發而來的流感大流行。病毒侵害人體組織，破壞機體免疫防御系統，造成廣泛的疾病傷害，殺滅病毒是醫學界渴望解決、又沒能徹底解決的難題。
發明內容技術方案包括處方新工藝、工藝流程圖及各種毒理、藥理綜述。
技術解決方案是本發明的目的公開一種復方殺病毒制品的制備方法及提供一種高純度的原料藥，是一種綠色藥物屬于天然產物藥理活性和分離。
黃芩12％、連翹20％、荊芥15％、野菊花15％、玄參15％、水牛角10％、大黃(酒炙)4.5％、皂角刺4.5％、蜂房4％復方殺病毒制品的增效藥理活性和制造方法，將水牛角、皂角刺原料和其它原料，分別用蒸汽蒸餾和水煎煮的提取方法，使用大孔樹脂吸附技術，將復方殺病毒制品組方中植物原料的有效成分吸附在大孔樹脂中，再用65％乙醇，在常溫下，將吸附在大孔樹脂上的有效成分洗脫至乙醇中，與其它的濾液，油水混合溶液合并后，在85℃條件下，噴霧干燥，用氣相層析測定儀進行指痕圖譜定量測試后，制成合格原料藥。
復方殺病毒制品的制備方法采用先進的大孔樹脂吸附有效成份并使用氣相指痕光譜定量，保證藥品的穩定性和高質量。
本發明的創造性通過臨床毒理、藥理來體現。
圖1本發明的工藝流程圖。
圖2病毒對照組。
圖3復方殺病毒制品組。
圖4病毒對照組。
圖5復方殺病毒制品組。
其工藝流程描述如下(1)本發明處方黃芩240g、連翹400g、荊芥300g、野菊花300g、玄參300g、水牛角200g、大黃(酒炙)90g、皂角刺90g、蜂房80g。
(2)溶劑水。
(3)提取液棕紅色水溶液。
(4)物理參數水蒸汽蒸餾、水提取、樹脂吸附、噴霧干燥均為常壓；水蒸汽蒸餾、水提取的溫度是100℃，樹脂吸附的溫度是常溫，噴霧干燥的溫度是80-85℃。
(5)操作過程①水牛角、蜂房加10倍量水煎煮4小時，濾過，得濾液(1)；藥渣再加10倍量水煎煮4小時，濾過，得濾液(2)。
②其它藥材用水蒸汽蒸餾4小時，得揮發油及油水混合溶液(3)；藥渣加8倍量水煎煮3小時，濾過，得濾液(4)；藥渣再加8倍量水煎煮2小時，濾過，得濾液(5)。
③合并濾液(4)、(5)靜置，取上清液，得提取液(6)。
④將提取液(6)用大孔樹脂進行吸附。
⑤用65％乙醇將吸附在樹脂上的化學成分洗脫至乙醇中，得洗脫液(7)。
⑥減壓回收洗脫液(7)，得濃縮液(8)。
⑦液濾(1)、(2)及(3)與濃縮液(8)進行噴霧干燥，得藥粉。
具體實施方式
黃芩12％、連翹20％、荊芥15％、野菊花15％、玄參15％、水牛角10％、大黃(酒炙)4.5％、皂角刺4.5％、蜂房4％復方殺病毒制品的增效藥理活性和制造方法，將水牛角、皂角刺原料和其它原料，分別用蒸汽蒸餾和水煎煮的提取方法，使用大孔樹脂吸附技術，將復方殺病毒制品組方中植物原料的有效成分吸附在大孔樹脂中，再用65％乙醇，在常溫下，將吸附在大孔樹脂上的有效成分洗脫至乙醇中，與其它的濾液，油水混合溶液合并后，在85℃條件下，噴霧干燥，用氣相層析測定儀進行指痕圖譜定量測試后，制成合格原料藥。
本發明的創造性通過毒理、藥理臨床來體現，實審時補充提供現簡介如下一種復方殺病毒制品的制備方法的藥理作用1.受檢藥物(批號20302)2.病毒流感病毒A1型、A3型、呼吸道合胞病毒(RSV)和腺病毒3型3.細胞Hela細胞、Vero細胞4.雞胚5.實驗動物純系小鼠，體重14-16g實驗方法一、體外實驗1.對病毒致細胞病變作用的影響藥物對細胞毒性的測定(即無毒限量的的選擇)采用微量培養法。用不同濃度藥液(受檢藥或陽性對照藥)加等量維持液接種于Hela(或Vero)細胞孔內，每孔0.2ml，每濃度4個孔，同時設細胞對照孔，置37℃5％CO2孵箱培養，72h判定結果，以不出細胞病變的藥物最小稀釋倍數為無毒限量。
藥物對病毒致細胞病變作用的影響(1)取100TCID50病毒液(RSV或腺病毒3型)按每孔0.1ml接種于Hela細胞培養孔中，吸附1h后洗去病毒液，加入不同濃度(維持液稀釋)藥液復方殺病毒制品0.2ml，每個濃度4孔，同時設病毒對照、細胞對照，置37℃5％CO2孵箱培養，倒置顯微鏡下觀察病變，待病毒對照出現明顯細胞病變(CPE)時，判定不出現CPE的藥物最高稀釋倍數，計算出藥物的抑制指數(用抑制病毒最高稀釋倍數除以無毒限量)。
(2)流感病毒A1感染用Vero細胞，其他步驟同上。由于細胞病變不明顯，故用紅細胞吸附試驗藥抗流感病毒A1的作用。即加藥液培養72h后，各孔內加0.08％豚鼠紅細胞0.1ml，30分鐘后，顯微鏡下觀察各孔細胞吸附紅細胞情況，判定不出現紅細胞吸附的藥物最高稀釋倍數并計算出抑制指數。
2.藥物在雞胚內對流感病毒(A1及A3)增殖的影響藥物對雞胚毒性測定取不同稀釋藥物，復方殺病毒制品為0.2ml分別接種于10日雞胚尿囊腔，每個濃度4只，設生理鹽水對照，35℃孵育72h，記錄雞胚存活數，以不引起雞胚死亡的藥物最小稀釋倍數為無毒限量。
藥物在雞胚內的抗流感病毒作用以15LD50的流感病毒液與等量不同濃度藥液，與復方殺病毒制品混合后，分別接種于雞胚尿囊腔中，總量為0.2ml，不同濃度藥液各用4只雞胚，并設病毒對照，35℃孵育72h，4℃過夜，收集尿囊液做血凝試驗，判定不發生血凝的藥物最高稀釋倍數，求出抑制指數。
二、體內實驗1.藥物對小鼠流感病毒性肺感染的影響隨機將小鼠分為殺病毒制品實驗組、病毒對照組及正常對照組，每組10只，雌雄各半。給藥組于感染前一天開始灌胃給藥不同稀釋濃度的復方殺病毒制品0.4ml，連續5天，病毒對照組以等量蒸餾水代替。給藥后24h，滴鼻感染流感病毒A1肺適應株15LD50。感染96h后進行解剖，取肺稱量，以肺重除以體重逐個算出肺指數值。與對照組比較，進行組間t檢驗。
2.對體內病毒顆粒增殖的影響用肺內含病毒顆粒特異熒光百分率表示。實驗鼠肺冰凍切片后，與鼠抗流感病毒抗體反應40分鐘，再與抗鼠IgG熒光抗體反應40分鐘，洗凈晾干后，熒光顯微鏡下觀察并計數各組細支氣管內含病毒顆粒特異熒光百分率。
3.觀察各組肺腑之言組織切片病理變化，按常規H.E.染色進行組織切片檢查。
實驗結果1.藥物在細胞內抗RSV、腺病毒3型及流感病毒A1的實驗結果表明在感染100TCID50病毒情況下，殺病毒制品抑制RSV的最高稀釋倍數為1∶256(含生藥7.81mg/ml)，抑制指數為4；抑制腺病毒3型的最高稀釋倍數1∶512(含生藥量3.90mg/ml)。抑制指數為8。抑制流感病毒A1的最高稀釋倍數1∶16(含生藥量125mg/ml)，抑制指數為8。
復方殺病毒制品對流感病毒A1的最高稀釋倍數為1∶16，抑制指數均為8(詳見表1)表1 藥物抗RSV、腺病毒3型及流感病毒A1作用結果
2.藥物在雞胚內抗流感病毒(A1及A3)的作用結果實驗表明，殺病毒制品在雞胚內抑制流感病毒A1的最高稀釋倍數為1∶2；抑制流感病毒A3的最高稀釋倍數是1∶4(詳見表2)表2 藥物在雞胚內抗流感病毒(A1及A3)作用結果
3.藥物在小鼠體內抗流感病毒作用的實驗結果(1)小鼠感染病毒96h后解剖稱肺重，求肺指數，結果詳見表3表3 殺病毒制品在小鼠體內抑流感病毒A1作用結果
結果表明，殺病毒制品按12.5g/kg/d給藥時，肺指數8.09±0.17，抑制率22.87％；按25.0g/kg/d給藥時，肺指數為7.98±0.23，抑制率為23.92％，其抑制病毒作用與濃度成正比。與病毒對照組比較，均差異顯著，P＜0.001，說明藥物在體內有明顯抑制流感病毒A1的增殖作用。
(2)肺細支氣管內含病毒顆粒特異熒光百分率，結果表明，正常對照組未見特異熒光顆粒；病毒對照組出現特異熒光顆粒；熒光百分率為64.35％；殺病毒制品組為20.12％與病毒對照組比較，均有顯著差異(P＜0.01)。
(3)鼠肺切片鏡下觀察病理所見病毒對照組病理變化嚴重，較多細支氣管腔內有中性粒細胞及退變壞死細胞，部分肺泡腔內含有粉染蛋白性液體。復方殺病毒制品組肺內病變程度減輕，只有少數肺泡或細支氣管內有少量液體或少量細胞。說明殺病毒制品在小鼠體內對流感病毒A1增殖均有抑制作用。
結論一、通過體外細胞培養法證明復方殺病毒制品對呼吸道細胞病毒(RSV)、腺病毒3型及流感病毒A1增殖均有抑制作用，對RSV及腺病毒3型的抑制指數分別為4和8，對流感病毒A1均有較強的抑制作用，抑制指數均為8，抑制作用相同。
二、通過雞胚實驗證明，復方殺病毒制品對流感病毒A1和A3的增殖有抑制作用，其抑制指數分別為2和4。
三、通過小鼠體內試驗看出，肺指數、病毒抑制率、特異熒光百分率及病理變化。復方殺病毒制品組與對照組比較均有顯著差異，說明復方殺病毒制品對小鼠感染流感病毒A1有明顯的抑制作用。
一種復方殺病毒制品的制備方法治療急性咽炎、急性扁桃體炎的臨床觀察效果表表4 綜合療效比較
秩和檢驗U＝3.24 P＜0.01治療組總顯效率為78.0％，總有效率為92.3％。
表5 綜合療效比較
秩和檢驗U＝3.65 P＜0.001治療組總顯效率為74.2％，總有效率為87.5％表6 主要癥狀和體征治療前后比較
治療組對主要癥狀及體征均有明顯改善作用，且消退率明顯。
表7 主要癥狀與體征治療前后比較
治療組對主要癥狀及體征均有明顯改善作用，其消退率明顯。
表8 急性咽炎病情與療效的關系
表9 急性扁桃體炎病情與療效的關系
表10 起效時間比較(天)
表11 起效時間比較
表12 治療急性咽炎病程與療效的關系
治療組組內病程為1天與2天療效比較，經秩和檢驗，P＜0.01，有非常顯著性差異，說明治療組對不同病程療效不同，病程為1天者療效明顯優于病程為2天者。
表13 治療急性扁桃體炎病程與療效的關系
治療組組內病程為1天、2天、3天療效比較，經秩和檢驗，P＞0.05，無顯著性差異，說明治療組對不同病程療效相近。
結 論臨床觀察結果表明，復方殺病毒制品對急性咽炎、急性扁桃體炎，療效確切。對急性咽炎的總有效率為92.3％，顯效以上率為78.0％；對急性扁桃體炎的總有效率為87.5％，顯效以上率為74.2％。
鼠肺切片鏡下觀察病毒對照組病理變化嚴重，復方殺病毒制品組肺內病變程度減輕。某大學醫院做藥理實驗表明如下復方殺病毒制品(簡稱殺病毒制品)，抑制RSV的最高稀釋倍數為1∶256，抑制指數為4；抑制腺病毒3型最高稀釋倍數為1∶512，抑制指數為8；抑制流感病毒A1的最高稀釋倍數為1∶16抑制指數為8。實驗表明，復方殺疾病制品在雞胚內抑制流感病毒A1的最高稀釋倍數為1∶2；抑制指數為2；抑制流感病毒A3的最高稀釋倍數1∶4，抑制指數為4。藥理活性實驗結果表明，殺病毒制品按12.5g/kg/d給藥時，肺指數8.09±0.17，抑制率22.87％；按25.0g/kg/d給藥時，肺指數為7.98±0.23，抑制率為23.92％。其抑制病毒作用作用與濃度成正比。說明殺病毒制品在體內有明顯抑制流感病毒A1的增殖作用。肺細支氣管內含病毒顆粒特異熒光百分率。結果表明，正常對照組未見特異熒光顆粒；病毒對照組出現特異熒光顆粒。熒光百分率為64.35％；復方殺疾毒制品組為20.12％，與病毒對照組比較，均有顯著差異。鼠肺切片，鏡下觀察病理所見，病毒對照組病理變化嚴重，較多細支氣管腔內有中性粒細胞及退變壞死細胞，部分肺泡腔內含有粉染蛋白性液體。復方殺病毒制品組肺內病變程度減輕，只有少數肺泡或細支氣管內有少量液體或少量細胞。說明殺病毒制品在小鼠體內對流感病毒A1增殖有抑制作用。
為了證實復方殺病毒制品的藥理活性，進行了復方殺病毒制品在治療人的急性咽炎、急性扁桃體炎的臨床觀察。治療急性咽炎總顯效率78.0％、總有效率92.3％。治療急性扁桃體炎總顯效率74.2％，總有效率87.5％。臨床證實，復方殺病毒制品的藥理活性是真實、可靠的。
一種復方殺病毒制品的制備方法的研究綜述急性咽炎、急性扁桃體炎屬中醫“風熱喉痹”、“風熱乳蛾”范疇。主要是由細菌和病毒引起的感染性炎癥。中醫臨床以清熱藥物治療這類常見病，療效顯著。近年來大量研究資料表明，清熱藥不僅有抗菌、抗病毒作用，而且還具有抗炎、解毒、解熱、提高機體免疫功能等廣泛的藥理作用。以清熱藥為主的這類中成藥與西藥抗菌素、抗病毒藥相比，不僅療效較好，而且不良反應較少，無毒副作用。
本復方制品與治療作用有關的主要藥效學試驗，是依據本品具有疏風清熱，解毒利咽，消腫止痛之功能，研究了該藥呼吸道感染的病毒和細菌體外、體內抗病毒、抗菌作用。并以銀黃口服液作為陽性對照藥。
抗病毒實驗結果體外抗病毒實驗，通過細胞培養法證明，本品對呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒3型及流感病毒A1的增殖均有抑制作用；體內試驗，本品對小鼠感染流感病毒A1有明顯抑制作用。本品抗病毒效果強于銀黃口服液。
體外抗菌試驗結果表明，本品對金黃色葡萄球菌、β-溶血性鏈球菌和肺炎雙球菌呈輕度或中度敏感；銀黃口服液對三種細菌均呈抗藥性，體內抗菌試驗表明，給小鼠灌胃給予本品33g(生藥)/kg，可顯著延長β-溶血性鏈球菌和金黃色葡萄球菌感染小鼠和生存時間，且能提高兩者的存活率。等效量的銀黃口服液能延長兩者細菌感染小鼠的存活時間，但僅能提高金黃色葡萄球菌感染小鼠的存活率，對β-溶血性鏈球菌感染小鼠的存活率無明顯的影響。
本實驗還研究了抗炎、解熱和鎮痛的藥理作用。并以銀黃口服液作陽性對照藥。本品對角叉菜膠誘發的大鼠足腫脹呈顯著的抑制作用，其抗炎消腫作用可持續4h以上；并對二甲苯誘發的小鼠耳腫有明顯的抑制。等效量的銀黃口服液對大鼠足腫脹和對二甲苯誘發的小鼠耳腫則無抗炎消腫作用，本品顯著抑制傷寒-副傷寒四聯菌苗引起的家兔體溫升高，其解熱作用持續4h以上，等效量的銀黃口服液的此種作用持續時間短且較弱；復方制品對傷寒菌苗引起的發熱兔的清熱作用與銀黃口服液作用無明顯差異。本品能顯著抑制醋酸引起的小鼠扭體反應，提示具有鎮痛作用；并對溫水刺激小鼠尾部引起的痛反應有一定鎮痛作用，而等效量的銀黃口服液則無鎮痛作用。免疫實驗結果表明，本品顯著拮抗環磷酰胺所致的巨噬細胞吞噬功能低下、T淋巴細胞減少和血清溶血素降低，明顯增加吞噬指數、T淋巴細胞數量和半數溶有血值(HC50)，且恢復或超過正常水平。即本品具有顯著增加巨噬細胞吞噬功能及細胞免疫和體液免疫功能的作用。
動物急性毒性試驗測定LD50為188.2g/kg，毒性作用小。動物長期毒性試驗，連續4周給大鼠灌胃給藥，分別略低于成人一日用量10、20和40倍，對大鼠的生長發育、血液系統、肝、腎功能等均無明顯的蓄積中毒反應。病理檢查結果表明，中高劑量對大鼠肝細胞的輕度損傷是可逆性的。
根據臨床前藥理、毒理研究結果，本品具有抗炎、清熱、鎮痛及體內外抗菌、抗病毒作用；且毒性小，服用安全可靠。
權利要求
1.一種復方殺病毒制品的制備方法，其特征在于將以下9位中藥黃芩、連翹、荊芥、野菊花、玄參、水牛角、大黃(酒炙)、皂角刺、蜂房，采用先進的大孔樹脂吸附有效成份，并使用氣相指痕光譜定量；其重量百分比為由黃芩12％、連翹20％、荊齊15％、野菊花15％、玄參15％、水牛角10％、大黃(酒炙)4.5％、皂角刺4.5％、蜂房4％組成。將水牛角和蜂房原料，每100kg，分別加水1000kg、1000kg，在100℃條件下，分別煎煮4小時，將水提取的濾液合并備用；再將其它原料在100℃以上的條件下，用蒸汽蒸餾4小時，吸取蒸餾后的揮發油和水混合溶液備用。將剩余殘渣每100kg分別加水800kg、800kg煎煮3小時、2小時，吸取合并水提取的濾液，通過大孔樹脂填充的柱子，用大孔樹脂吸附有效成份后，再用65％乙醇，將吸附在大孔樹脂上的成分洗脫至乙醇中，與備用的合并濾液和備用的揮發油和水混合溶液一并，在85℃條件下噴霧干燥，用氣相層析測定儀器，進行指痕圖譜定量測定后，制成合格原料藥；
2.按照權利要求所述1一種復方殺病毒制品的制備方法，其特征在于所述的原料藥可以制備成顆粒劑、片劑、丸劑、膠囊、口服液及針劑。
全文摘要
本發明涉及一種復方殺病毒制品的制備方法，屬于天然產物藥理活性和分離與提純天然產物方法。其處方是黃芩12％、連翹20％、荊芥15％、野菊花15％、玄參15％、水牛角10％、大黃(酒炙)4.5％、皂角刺4.5％、蜂房4％組成。通過大孔樹脂填充的柱子，用大孔樹脂吸附有效成分后，再用65％乙醇，將吸附在大孔樹脂上的成分洗脫至乙醇中，與備用的合并濾液和備用的揮發油和水混合溶液一并，在85℃條件下噴霧干燥，用氣相層析測定儀器，進行指痕圖譜定量測定后，制成原料藥。積極效果是復方殺病毒制品的制備方法采用先進的大孔樹脂吸附有效成分并使用氣相指痕光譜定量，保證藥品的穩定性和高質量。
文檔編號A61K9/16GK1650900SQ20041000115
公開日2005年8月10日 申請日期2004年2月2日 優先權日2004年2月2日
發明者姜偉 申請人:姜偉