專利名稱：鑒定野油菜黃單胞菌野油菜致病變種四號生理小種的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一對輔助鑒定野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonas campestris pv. campestris)四號生理小種的引物及其應用。
背景技術：
野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonas campestris pv. campestris)具有生理小種分化現象，目前國際上常見的報道是將其劃分為6個小種，目前國內外對野油菜黃單胞菌野油菜致病變種生理小種鑒定大多數采用鑒別寄主法(Vicente，J. G. ,Conway, J.，Roberts，S. J.，and Taylor, J. D. 2001. Identification and origin of Xanthomonas campestris pv.campestris races and related pathovars.Phytopathology 91 492-499.嚴紅，裘季燕，張濤濤，田兆豐.2001.白菜苗期三種病原復合接種的多抗性鑒定方法研究.植物病理學報，31C3) :109-113.)。基于生理小種鑒定的常規鑒別寄主法存在鑒定時間長和受環境因素影響大等缺點，迫切需要注入現代分子技術手段。AFLP標記是擴增片段長度多態性技術(amplified fragment length polymorphism, AFLP)是由荷蘭科學家 Zabeau 及 Vos(Zabeau Μ, Vos P. Selective restrietion fraglnent amPlifieation a general method for DNA fingapnnting[J]. European Pat Ent Applieation 942060297 (Pubulication No. 0534858). Paris =European Patent Offiee,1993. 1405.)在 1993年發展起來的一種新的檢測DNA多態性的方法。AFLP標記技術的出現，是DNA指紋技術的重大突破。該技術最初用于植物的遺傳育種、種質資源鑒定等，現已被大量用于動植物和微生物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構建、醫療診斷、系統發育和分類等研究領域。AFLP 技術是目前使用的一種比較有效的基因多態性分析方法，它既包含了 RFLP分析的可靠性又具有PCR的能力，是一種相對價廉、簡單、快速和可靠的DNA指紋技術，可產生幾百條遺傳標記。2001 年，Vicente 等人(Vicente, J. G. , Conway, J. , Roberts, S. J. , and Taylor, J.D.2001. Identification and origin of Xanthomonas campestris pv. campestris races and related pathovars. Phytopathology 91 :492-499. ) 144 ^ ! , ^t Wirosa Fl (B. oleracea)、Just Right Hybrid Turnip (B. rapa)、Line 14R of Cobra (B. napus)、 Seven Top Turnip (B. rapa) > PI 199947 (B. carinata) > Florida Broad Leaf Mustard (B. juncea)和Miracle Fl (B. oleracea)等7個十字花科蔬菜品種(鑒別寄主)上進行了十字花科黑腐病菌致病性的測定，根據Xanthomonas campestris pv. campestris在這7個品種上的不同的致病情況，將收集到的菌株鑒定為6個生理小種，即小種1、2、3、4、5和6號，其中1號小種占62 %，4號小種占32 %，其余4個小種共占6 %。我國十字花科蔬菜黑腐病菌的致病力分化研究比較常見，但是目前未見該菌生理小種的相關報道。目前國內進行致病型劃分常用的方法是鑒別寄主法。了解我國十字花科黑腐病菌的生理小種分布，對十字花科蔬菜的種植及抗病性育種等方面有指導作用。
發明內容
本發明的目的是提供一對輔助鑒定野油菜黃單胞菌野油菜致病變種 (Xanthomonas campestris pv. campestris) 0 /]、禾中白勺弓L&gj^ffi。本發明所提供的輔助鑒定野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonas campestris pv. campestris)四號生理小種的引物，名稱為I3Xcl它們的核苷酸序列分別為序列表中序列1和序列表中序列2。本發明還提供一種輔助鑒定野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonas campestris pv. campestris)四號生理小種的試劑盒，包括權利要求1所述的引物。本發明提供的上述引物的應用，是上述引物在輔助鑒定野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonas campestris pv. campestris)四號生理小種中的應用，該輔助鑒定野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonas campestris pv. campestris)四號生理小種的方法，包括下述步驟1)待測野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonas campestris pv. campestris)的基因組DNA為模板，用權利要求1所述的引物進行PCR擴增；2)鑒定步驟1)所述的PCR擴增產物的大小，擴增產物中含有一個230bp的DNA片段的待測野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonas campestris pv. campestris)菌株為野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonas campestris pv. campestris)四號生理小種。上述引物和所述試劑盒均可應用于篩選不同生理小種的野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonas campestris pv. campestris)菌株，特別是篩選四號生理小種的野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonas campestris pv. campestris)菌株。可以利用本發明的引物對野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonas campestris pv. campestris)菌株進行生理小種鑒定縮短鑒定時間，從而較快地鑒定出野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonas campestris pv. campestris)四號生理小種， 利用本發明引物進行鑒定生理小種的方法克服了傳統生理小種鑒定方法鑒別寄主法中易受環境因素和鑒別寄主生長期長的干擾而導致鑒定效率低等問題。
圖1為本發明鑒定四號生理小種引物擴增野油菜黃單胞菌野油菜致病變種 (Xanthomonas campestris pv. campestris) 一號至六號生理小種標準菌株的結果，圖中， 泳道M為分子量Marker (D2000 DNA Ladder)，泳道1_6分別為野油菜黃單胞菌野油菜致病變禾中(Xanthomonas campestris pv. campestris) 一號至六號生理小禾中標準菌株，ck為是以清水為模板的PCR擴增。圖2為本發明鑒定四號生理小種引物擴增野油菜黃單胞菌野油菜致病變種 (Xanthomonas campestris pv. campestris)四號生理小種的結果，最左側泳道為分子量 Marker (D2000 DNA Ladder)，左側第二泳道是以四號生理小種標準菌株為模板的擴增產物，其余是以鑒別寄主法鑒定的四號生理小種菌株為模板的擴增產物。圖3為本發明鑒定四號生理小種引物擴增野油菜黃單胞菌野油菜致病變種 (Xanthomonas campestris pv. campestris)非四號生理小種的結果，最左側泳道為分子量Marker (D2000 DNA Ladder)，左側第二泳道是以四號生理小種標準菌株為模板的擴增產物，其余是以鑒別寄主法鑒定的非四號生理小種菌株為模板的擴增產物。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的試驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的實驗材料，如無特殊說明，均為常規生化試劑商店購買得到的。實施例1、鑒定野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonas campestris pv. campestris)四號生理小種的引物及其應用一、鑒定野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonas campestris pv. campestris)四號生理小種的引物的獲得采用AFLP標記(擴增片段長度多態性技術)方法對六個生理小種標準菌株進行分析，得到六個生理小種標準菌株的AFLP指紋圖譜，將四號生理小種標準菌株具有的特異條帶進行回收，得到四號生理小種特有的DNA片段，對此DNA片段進行測序，根據所得序列設計引物，所得引物即為本發明的引物hcMPrimer )(CC4的縮寫)。引物序列為上游正向引物序列為5，-GAAGCTCCTCGCGGAAATG-3 (序列表中序列1)，下游反向引物序列為 5，-CAAGGCATATGCACTGAGCG-3 (序列表中序列 2)。二、本發明的鑒定野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonas campestris pv. campestris)四號生理小種的引物(Pxc4)的效果驗證1、引物合成Pxc4引物對上游正向引物序列為5，-GAAGCTCCTCGCGGAAATG-3 (序列表中序列 1)，下游反向引物序列為5，-CAAGGCATATGCACTGAGCG-3 (序列表中序列2)，委托上海生工生物技術有限公司合成。2,Pxc4引物對的擴增與四號生理小種的相關性驗證購自英國華威大學的 HRI 3811 Xcc race 1 (Xanthomonas campestris pv. campestrts 一號生理小禾中)，HRI 3849A Xcc race2(Xanthomonas campestrts pv. campestrts 二號生理小禾中)，HRI 5212 Xcc race3(Xanthomonas campestris pv. campestris 三號生理小禾中)，HRI 1279A Xcc race4(Xanthomonas campestris pv. campestris 四號生理小禾中)，HRI 3880 Xcc race5 (Xanthomonas campestris pv. campestris 五號生理小禾中)，HRI 6181 Xcc race6(Xanthomonas campestris pv. campestris六號生理小種)六個生理小種代表性菌株，和從我國不同地區采集分離到的44野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonas campestris pv. campestris)菌株， 已經采用鑒別寄主法(Vicente, J. G.，Conway, J.，Roberts, S. J.，and Taylor, J. D. 2001. Identification and origin of Xanthomonas campestris pv.campestris races and related pathovars. Phytopathology 91:492-499.嚴紅,裘季燕，張濤濤，田兆豐· 2001. 白菜苗期三種病原復合接種的多抗性鑒定方法研究.植物病理學報，31C3) :109-113.)鑒定出其生理小種類別，其中四號生理小種22株，其余22株中，4株是3號生理小種，18株1 號生理小種。采用 CTAB 法分別提取每個 Xanthomonas campestris pv. campestris 菌株的全基因組DNA，以上述)(CC4引物對進行PCR擴增實驗。PCR 反應體系為10 X Ex Buffer 2. 5 μ 1 (含 Mg2+)，dNTPl μ 1 (IOmM)，上游正向引物和下游反向引物各 1 μ I(IOmM)，基因組 DNAl μ l(10ng/μ 1)，Ex Taq 酶 0. 2 μ 1 (5U/μ 1)， 反應體積為25 μ 1。PCR 反應程序為94 °C 3min ； 94°C 30s、58°C 30s, 72 °C 60s，35 個循環；72 °C 5min。PCR擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳分析。結果見圖1-圖3。結合PCR擴增實驗結果，分析如下供試的六個生理小種標準菌株中，只有四號生理小種存在一個230bp的DNA 特異性擴增片段。全部的22個四號生理小種有14個能檢測到該特異帶型Q30bp)，檢出率為63. 6%;而在22份其他生理小種材料中只有3份檢測到該特異帶型。因此，引物I^XC4 是與四號生理小種相關位點相連鎖的標記，可以用于四號生理小種的輔助鑒定。
權利要求
1.一對引物，它們的核苷酸序列分別為序列表中序列1和序列表中序列2。
2.一種輔助鑒定野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonas campestris pv. campestris)四號生理小種的試劑盒，包括權利要求1所述的引物。
3.權利要求1所述的引物在制備輔助鑒定野油菜黃單胞菌野油菜致病變種 (Xanthomonas campestris pv. campestris)四號生理小種的試劑盒中的應用。
4.權利要求2所述的試劑盒在輔助鑒定野油菜黃單胞菌野油菜致病變種 (Xanthomonas campestris pv. campestris)四號生理小禾中中的應用。
5.一種輔助鑒定野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonas campestris pv. campestris)四號生理小種的方法，包括下述步驟1)待測野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonascampestris pv. campestris) 的基因組DNA為模板，用權利要求1所述的引物進行PCR擴增；2)鑒定步驟1)所述的PCR擴增產物的大小，擴增產物中含有一個230bp的DNA特異性擴增片段的待測 Xanthomonas campestris pv. campestris 菌株為 Xanthomonas campestris pv. campestris 四號生理小禾中。
全文摘要
本發明公開了一對輔助鑒定野油菜黃單胞菌野油菜致病變種四號生理小種的引物及其應用。該對引物，它們的核苷酸序列分別為序列表中序列1和序列表中序列2。可以利用本發明的引物對野油菜黃單胞菌野油菜致病變種菌株進行生理小種鑒定縮短鑒定時間，從而較快地鑒定出野油菜黃單胞菌野油菜致病變種四號生理小種，利用本發明引物進行鑒定生理小種的方法克服了傳統生理小種鑒定方法鑒別寄主法中易受環境因素和鑒別寄主生長期長的干擾而導致鑒定效率低等問題。
文檔編號C12R1/64GK102373199SQ20111035017
公開日2012年3月14日 申請日期2011年11月8日 優先權日2011年11月8日
發明者嚴紅, 劉凡, 林秀敏, 燕繼曄, 翟文慧 申請人:北京市農林科學院