專利名稱：一種微生物發酵轉化生產甘草次酸的方法
技術領域：
本發明涉及微生物技術領域，特別是涉及一種用微生物轉化生產甘草次酸的技術。
背景技術：
甘草為我國傳統中藥材，素有“國老”之稱，味甘、性平。歸心、肺、脾、胃。補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調和諸藥。用于脾胃虛弱，倦怠乏力，心悸氣短，咳嗽痰多，脘腹、四肢攣急疼痛，癰腫瘡毒。可緩解藥物毒性、烈性。甘草廣泛應用于醫藥、煙草、食品等領域。甘草酸和甘草次酸是甘草的主要有效成分，甘草酸經胃酸水解或經肝中葡萄糖醛酸酶分解形成甘草次酸，甘草酸的藥理作用實質上是甘草次酸的效用。甘草次酸(Glycyrrhetinic Acid)的分子式為C3tlH46O4,分子量470. 64KD，為白色結晶性粉末，熔點為288-297°C，結構式如
圖1。本品在吡啶中易溶，在乙醇或氯仿中溶解， 在汽油或乙醚中微溶，在水中不溶。近年隨著現代中藥的發展，各國學者在中醫理論的基礎上，對甘草有效成分—— 甘草次酸的藥理作用進行了深入研究，以尋找高效低毒的新有效成分應用于臨床。研究發現甘草次酸不僅具有抗炎、抗潰瘍、抗病毒、降血脂、鎮咳、平喘及祛痰等作用，還可用于防治病毒性肝炎、高血脂癥和癌癥等疾病，是有效的干擾素誘生劑及細胞免疫調節劑。將甘草酸類藥物與生物堿、抗生素、氨基酸等復配或制成其金屬化合物，還可增加藥物的穩定性， 提高生物利用度，降低毒副作用。伴隨甘草次酸臨床應用價值的深入研究，甘草次酸的開發利用也越來越受到國內外醫藥界的關注。甘草次酸的制備未見化學合成法。目前多以天然豆科植物甘草經加工提取來生產，即植物提取法。植物提取法以甘草為原料提取甘草酸，再通過酸水解法水解甘草酸制取甘草次酸。
權利要求
1.一種微生物發酵轉化生產甘草次酸的方法，其特征是，所述的微生物為黃曲霉 Aspergillus flavus, CGMCC No. 5144。
2.如權利要求1所述的微生物發酵轉化生產甘草次酸的方法，其特征是，包括以下步驟步驟一、將黃曲霉Aspergillus flavus,CGMCC No. 5144接入固體PDA斜面培養基中培養，然后從斜面上按的接種量接種至新鮮種子培養基中進行培養；步驟二、將處于生長期中的經種子培養基培養的菌種按照30%的接種量接種至含新鮮發酵培養基的發酵罐中進行發酵培養，發酵產生含甘草次酸的發酵液。
3.如權利要求1所述的微生物發酵轉化生產甘草次酸的方法，其特征是，在步驟二之后還包括步驟三然后從發酵液中分離出甘草次酸粗品，并進行純化。
4.如權利要求2所述的微生物發酵轉化生產甘草次酸的方法，其中，步驟一中種子培養基的質量百分組成為玉米糖化液0. 5 1. 5%，麩皮汁4. 5 5. 5%，酵母膏0. 5 0.7%，硫酸銨0. 05 0. 15 %，硫酸鎂0. 04 0. 06 %，磷酸二氫鉀0. 09 0. 11 %，甘草酸粗品0. 09 0. 11%，其余為水。
5.如權利要求4所述的微生物發酵轉化生產甘草次酸的方法，其中，步驟一中種子培養基培養條件為菌株放置到錐形瓶中于轉速200rpm的搖床上振搖培養，通氣量0. 2m3/h, 培養時間M小時。
6.如權利要求2所述的微生物發酵轉化生產甘草次酸的方法，其中，步驟二中發酵培養基的質量百分組成為甘草酸0. 8 1. 2%，硫酸銨0. 8 1. 0%，硫酸鎂0. 03 0. 05%， 磷酸氫二鉀0. 6 0. 8 %，磷酸二氫鉀0. 7 0. 9 %，其余為水，初始pH4 5。
7.如權利要求6所述的微生物發酵轉化生產甘草次酸的方法，其中，步驟二中發酵罐中發酵培養條件為發酵培養基50 70L，發酵溫度20 40°C，通氣量0. 3 0. 5m3/h，攪拌速度為130 170rmp，發酵2 4d。
8.如權利要求3所述的微生物發酵轉化生產甘草次酸的方法，其中，甘草次酸的分離包含以下步驟通過濾布過濾，收集濾液1，然后將所得濾液1通過超濾膜PES-20，截流粒徑在IOnm以上，分子量在500 500000范圍內的物質，收集濾液2 ；采用納濾膜NF-270過濾上步驟所得濾液2，截流分子量在200 1000左右的低分子物質，收集濾液3。
9.如權利要求3所述的微生物發酵轉化生產甘草次酸的方法，其中，甘草次酸的純化包含以下步驟先通過大孔吸附樹脂H103對所述濾液3進行分離純化，得到甘草次酸粗品；然后將所得甘草次酸的粗品制成樣品膠后水平安置于硅膠柱表面，先用純石油醚通柱，再用石油醚乙酸乙酯=2 1(體積比)的流動相每次20目洗脫甘草次酸，收集濾液并進行噴霧干燥、分步收集，最后得到甘草次酸純品。
10.如權利要求1所述的微生物發酵轉化生產甘草次酸的方法，其中，黃曲霉 Aspergillus flavus,CGMCC No. 5144為通過紫外線和Licl復合誘變處理葡萄糖醛酸的曲霉屬黃曲霉獲得。
全文摘要
本發明提供了一種微生物發酵轉化生產甘草次酸的方法，其中，包括以下步驟將黃曲霉Aspergillus flavus，CGMCC No 5144接入固體PDA斜面培養基中培養，然后從斜面上按1％的接種量接種至含新鮮種子培養基中進行培養；將種子培養基所得菌株按照30％的接種量接種至含新鮮發酵培養基的發酵罐中進行發酵培養，得到含甘草次酸的發酵液；采用膜分離聯用工藝從發酵液中分離出甘草次酸粗品，再通過純化工藝得到高純甘草次酸。通過本發明最后獲得甘草次酸的發酵量達到4.38g/L，產品純度≥98％、轉化率≥90％，達到了工藝規模化水平。
文檔編號C12P7/42GK102363796SQ20111035587
公開日2012年2月29日 申請日期2011年11月10日 優先權日2011年11月10日
發明者張桐, 徐莉, 王福清 申請人:中科醫藥行業生產力促進中心有限公司