一種地衣芽孢桿菌及其應用的制作方法

專利名稱：一種地衣芽孢桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及Y-PGA高產菌株及其應用，即地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis)P-104 及其發酵生產 γ-PGA 的方法。
背景技術：
Y -聚谷氨酸(Y -polyglutamic acid, y -PGA)是一種由 L-谷氨酸和 D-谷氨酸為單體，通過α-氨基和Y-羧基以肽鍵的形式縮合而成的同聚酰胺。Y-PGA多由微生物發酵產生，分子量通常為IOO-IOOOkDa (Buescher，J. Μ. and A. Margaritis. Microbial biosynthesis of polyglutamic acid biopolymer and applications in the biopharmaceutical, biomedical and food industries. Critical Reviews in Biotechnology，2007，27 :1-19)，不同分子量的Y-PGA具有不同的用途。Y-PGA不僅具有良好的生物相容性和生物可降解性，還具有增稠性、乳化性、成膜性、成纖維性、保濕性、粘性等功能特性，其降解產物為對人體和環境無公害的谷氨酸，是一種對環境友好且具有優良性能的綠色高分子材料。廣泛應用于醫藥領域作為藥物載體以及結構材料、用于化妝品保濕添加劑、食品工業的增稠劑和抗凍劑、工業膠黏劑等等，具有極大的商業開發價值和應用前景。目前，眾多學者開展Y-聚谷氨酸高產菌的選育、代謝途徑、發酵工藝、分離純化工藝以及性質、應用的研究。發酵生產Y-PGA的菌種主要為芽胞桿菌屬細菌，其中枯草芽抱桿菌、地衣芽抱桿菌研究最多。枯草芽孢桿菌的產量普遍較地衣芽孢桿菌高， 但是因為容易受到噬菌體的侵染，造成損失，因此地衣芽孢桿菌更加受到關注。Cheng 等采用 B. licheniformis A35 生產 γ-PGA(Cheng C, Asada Y, Aaida Τ. Production of y-polyglutamic acid by Bacillus licheniformis A35under denitrifying conditions. Agric. Biol. Chem.，1989，53 :2369-2375)產量為 8g/L,且存在發酵周期長、需要無機厭氧培養基、發酵產率低、產物分子量小等不足。為了解決這一問題，研究者公開了采用 B. licheniformis ATCC 9945A 生產聚 Y-PGA 的方法(US Patent 5378807,1995)。先后有眾多研究者通過基因工程、培養基優化、培養條件控制等手段，使其產量有所提高，但使用B. licheniformis ATCC 9945A，產量一般在17_45g/L左右，且發酵時間一般為9 ι相對較長，且過程中需添加高濃度的甘油，故其生產成本高。B. licheniformis SAB46的產量較高(Abdel-Fattah, Y. R. ,N. A. Soliman, and Μ. Μ. Berekaa, Application of Box-Behnken Design for Optimization of Poly-y-Glutamic Acid Production by Bacillus licheniformis SAB-26. Research journal of microbiology, 2007, 2 (9) :664-670),能夠達到產量59. 9g/L，但是周期為72h也較長，且B. licheniformis SAB-洸生產的γ-PGA分子量僅有70kDa-180kDa，不能夠滿足高分子量的需求。綜上所述，地衣芽孢桿菌生產周期長、生產效率低、成本高。因此，篩選一株高效Y-PGA生產菌并開發低成本的生產工藝具有重要的意義。

發明內容
本發明目的在于提供一種生產周期短、生產效率高、生產成本低的菌株，以及用該菌株發酵生產Y-PGA的方法。為了達到上述目的，本發明通過如下技術方案實現本發明提供一種用于Y -PGA發酵生產的地衣芽孢桿菌(Bacillus lichenifOrmis)P-104，于2010年9月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 4156。本發明所提供的菌株P-104細胞呈直桿狀，革蘭氏染色陽性。在LB固體培養基上菌落圓形，干燥，不透明，蔓延，邊緣不齊，毛發狀。最適生長溫度30-37°C，適宜pH 6. 8-7. 2。接觸酶試驗陽性，硝酸鹽試驗陽性，檸檬酸鹽試驗陽性，明膠液化試驗陽性。本發明所提供菌株P-104的16S rRNA基因序列有1382個堿基，測得的16SrRNA 序列通過MEG. 4軟件進行系統進化樹的構建，進化樹顯示該菌株屬于地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis)0綜合形態學鑒定、生理生化鑒定和16S rRNA基因分子鑒定結果，該菌株被鑒定為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。本發明同時提供了一種用B. licheniformis P-104生產Y-PGA的方法。包括以下步驟a、采用地衣芽孢桿菌p-104、保藏編號為CGMCC No. 4156的菌株作為生產菌株；b、將上述菌株接在LB培養基固體斜面上培養8_14h ；刮取菌苔至無菌甘油保藏管中；在冷凍條件下保藏，冷凍溫度不高于-70°C ；C、制備種子液(1)將上述冷凍保藏的菌種接種到LB固體培養基平板上，培養至少對-3他，使其活化；(2)將上述活化的種子轉接到LB液體種子培養基中，培養至對數生長中期；d、發酵培養(1)配置發酵培養基每IL培養基加入谷氨酸鈉IO-IOOg ；碳源IO-IOOg ；無機氮源 3-20g ；K2HPO4 · 3H20 0. l_2g ；MgSO4 · 7H20 0. l_2g ；檸檬酸鈉 2-10g ；MnSO4O. 01-0. 2g ；補充蒸餾水至IOOOmL,調節pH 6. 0-7. 5 ；(2)將上述發酵培養基投入搖瓶或發酵罐中，高壓蒸汽滅菌至少20min后，冷卻至 30-37°C，按1-5%的接種量接入種子液，培養Μ-4 !；e、提取將d中得到的菌株培養液離心除去菌體、收集上清液，并用乙醇或異丙醇沉淀、回收Y-PGA。制備種子液步驟O)時培養8-1 至對數生長中期。搖瓶培養是在三角瓶中裝入一定量的培養基配上瓶塞，經滅菌后接種，在搖瓶上進行恒溫振蕩培養。搖瓶培養依賴搖動振蕩使培養基液面與上方空氣不斷接觸，供給微生物生長所需的溶氧量。本發明采用搖瓶培養時，按50-100mL/500mL三角瓶的裝液量投入發
酵培養基。發酵罐，指工業上用來進行微生物發酵的裝置。其主體一般為用不銹鋼板制成的主式圓筒，其容積在Im3至數百m3。在設計和加工中應注意結構嚴密，合理。能耐受蒸汽滅菌、有一定操作彈性、內部附件盡量減少(避免死角)、物料與能量傳遞性能強，并可進行一定調節以便于清洗、減少污染，適合于多種產品的生產以及減少能量消耗。發酵罐是一種對物料進行機械攪拌與發酵的設備。該設備采用內循環方式，用攪拌槳分散和打碎氣泡，它溶氧速率高，混合效果好。罐體采用SUS304或316L進口不銹鋼，罐內配有自動噴淋清洗機頭，確保生產過程符合GMP要求。本發明采用發酵罐培養時，按發酵罐容積的40-80%投入發酵培養基，攪拌速度為200-600rpm，通氣量為0. 5-2vvm。在發酵罐培養過程中可以進行補料；補料方式優選加入葡萄糖。補料發酵可以解除底物抑制、葡萄糖效應、代謝阻退等問題，得到較高的轉化率、染菌和退化的概率小、對發酵過程可實現優化控制等優點。深層發酵是指在發酵過程中從發酵底部通入無菌空氣并攪拌，使空氣與發酵液的接觸面積極大提高。從而大幅度提高氧氣含量。本發明使用發酵罐時為深層發酵，能夠有效提高轉化率。LB培養基是一種培養基的名稱，生化分子實驗中一般用該培養基來預培養菌種， 使菌種成倍擴增，達到使用要求。培養的菌種一般是經過改造的無法在外界環境單獨存活和擴增的工程菌。通過培養工程菌，我們可以表達大量的外源蛋白，也可以拿到帶有外源基因的質粒，工程菌的有效擴增是生化分子實驗的基礎。本發明所述LB固體培養基含蛋白胨 10g/L、酵母浸出物5g/L、NaC110g/L、瓊脂18g/L，pH 7. 0 ；LB液體種子培養基含蛋白胨IOg/ L、酵母浸出物 5g/L、NaCl 10g/L, pH 7.0。本發明所述發酵培養基成分還包括NaN032_10g ；CaCl2 · 2H20 0. l_2g，添加NaNO3 和CaCl2 ·2Η20的發酵培養基培養效果更好；谷氨酸鈉的含量為30-100g/L ；優選地，無機氮源為硫酸銨、氯化銨或硝酸鈉中的一種或幾種，例如硫酸銨、硝酸鈉、或同時添加硫酸銨和硝酸鈉作為氮源；含量為5-20g/L ；優選地，碳源為葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、淀粉或淀粉水解液，例如葡萄糖、蔗糖、同時添加葡萄糖和淀粉作為碳源；含量為30-100g/L。本發明各步驟所述的培養優選在30-37°C下進行。高壓蒸汽滅菌法(autoclaving)可殺滅包括芽胞在內的所有微生物，是滅菌效果最好、應用最廣的滅菌方法。方法是將需滅菌的物品放在高壓鍋(autoclave)內，加熱時蒸汽不外溢，高壓鍋內溫度隨著蒸汽壓的增加而升高。在103.4kPa(1.05kg/cm2)蒸汽壓下， 溫度達到121. 3°C，維持15 20分鐘。適用于普通培養基、生理鹽水、手術器械、玻璃容器及注射器、敷料等物品的滅菌。本發明所述高壓蒸汽滅菌優選在115°C下滅菌30min。本發明所提供的B. Iicheniformis P-104在用于生產γ-PGA時，性能明顯優于已報道B. Iicheniformis菌株，主要體現在發酵周期短，生產效率高采用本發明菌株 B. Iicheniformis Ρ-104，在7L發酵罐中間歇發酵生產Y-PGA，發酵周期為M_36h，y-PGA 產量可達到40g/L以上。


附圖1 ； γ -PGA紫外掃描圖譜；附圖2 γ -PGA紅外吸收圖譜；附圖3 菌株P-104的掃描電鏡圖片；附圖4 菌株P-104的16S rRNA系統進化樹；附圖5 :B. Iicheniformis P-104發酵生產聚合物產物水解樣品的HPLC分析圖譜， 保留時間為2. 74min的峰與谷氨酸標準樣品保留時間相同。下面對本發明進一步詳細說明。但下述的實例僅僅是本發明的簡易例子，并不代表或限制本發明的權利保護范圍，本發明的權利范圍以權利要求書為準。
具體實施例方式為更好地說明本發明，便于理解本發明的技術方案，本發明的典型但非限制性的實施例如下本發明提供一種用于Y-PGA發酵生產的地衣芽孢桿菌Bacillus Iicheniformis P-104，于2010年9月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)，保藏編號為 CGMCC No. 4156。實施例1 本發明菌株的分離、篩選選取國內生產的多種豆豉醬，各取Ig于滅菌試管中，加無菌水9mL，用棉塞封口， 振蕩2min，然后放入水浴鍋中，70°C加熱lOmin，再靜置30min。冷卻后，吸取上清液0. ImL, 稀釋IO2和IO3倍，分別取0. 2mL,涂布LB平板(谷氨酸鈉10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/ L，氯化鈉10g/L，瓊脂粉15g/L，pH7. 2)，37°C培養4 觀察結果，挑選在LB培養基上呈乳液狀能拉絲的單菌落，接入新鮮LB液體種子培養基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉 10g/L, pH7. 2)中，37°C搖床培養1 后，按2%的接種量分別接種到裝有50mL滅菌基本發酵培養基的250mL搖瓶(谷氨酸鈉50g/L，葡萄糖50g/L，檸檬酸鈉12g/L，氯化銨7g/L， KH2PO4O. 5g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L, CaCl2 · 2Η200· 15g/L, MnSO4 · H2O 0. 104g/L, pH7. 2)中， 37°C，ISOrpm，振蕩培養3 結束發酵。對發酵產物分別取樣離心除去菌體，用3倍乙醇沉淀上清液，輕輕振蕩后4000rpm離心15min，收集沉淀物，冷凍干燥，再加入蒸餾水溶解沉淀物，透析去除離子，利用HPLC檢測產物。實施例2 本發明菌株的鑒定生理生化鑒定本發明所提供的地衣芽孢桿菌菌株菌體直桿狀，革蘭氏染色陽性。在LB固體培養基上菌落圓形，干燥，不透明，蔓延，邊緣不齊，毛發狀。最適生長溫度30-37°C，適宜pH 6. 8-7. 2。接觸酶試驗陽性，硝酸鹽試驗陽性，檸檬酸鹽試驗陽性，明膠液化試驗陽性。利用16S rRNA基因序列分析進行菌種鑒定菌株P-104總DNA通過細菌基因組抽提試劑盒抽提，16S rRNA基因PCR擴增采用通用引物 :AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和(1492r GGTTACCTTGTTACGACTT)進行。PCR程序為:94°C預變性5min ；94°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸1.5min，28個循環；72°C延伸 IOmin0基因測序通過ABI Prism 370自動測序儀完成。測序結果顯示該菌株的16S rRNA 基因序列有1382個堿基，通過MEG. 4軟件進行系統進化樹的構建，進化樹顯示菌株LSSE-62 屬于地衣芽胞桿菌。結合16S rRNA分子鑒定與前面的形態學和生理生化鑒定結果，鑒定 P-104為芽胞桿菌屬地衣芽胞桿菌。實施例3 采用本發明菌株P-104所生產高分子產物的定性定量分析采用紫外光譜掃描和紅外光譜分析，通過與Y-PGA標準品光譜圖比較，表明菌株 P-104發酵所得高分子產物為γ-PGA。對本發明菌株P-104所生產的高分子產物在酸性條件下水解，對水解產物采用HPLC進行定性和定量分析，所用色譜柱為Brava C18-BDS，流動相為1 Ommo 1 /LKH2PO4 加5. 0 %甲醇(用磷酸調pH值至2. 5，過濾，超聲波脫氣)，流速為lmL/min，紫外檢測波長為210nm，谷氨酸標準品作為定性和定量的標準物。Y-PGA濃度=水解后谷氨酸濃度 X129/147。實施例4 γ -PGA發酵生產(1)用冷凍保藏的本發明菌株P-104作為生產菌株；(2)將冷凍保藏的菌株P-104，接種到LB培養基固體斜面(含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L、瓊脂18g/L、pH 7. 0)，37°C培養8h,刮取菌苔至無菌的20%甘油保藏管中；-70°C冷凍保藏；(3)種子液培養將上述冷凍保藏的菌種接種到LB固體培養基平板上，37°C培養Mh，使其活化；將活化的種子轉接到含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L、pH7. 0的LB三角瓶液體種子培養基中，37°C，200rpm培養1 至對數生長中期；(4)搖瓶發酵培養按照每IL培養基的加入量配置發酵培養基谷氨酸鈉70g ；葡萄糖80g ；檸檬酸鈉 IOg ；硫酸銨 IOg ；K2HPO4 ·3Η20 0. 6g ；MgSO4 ·7Η20 0. 6g ；MnSO4O. 15g ；補充蒸餾水至 IOOOmL, PH 7. 5，配制IOOmL發酵液分裝500mL三角瓶，在115°C下，高壓蒸汽滅菌30min，冷卻至 370C，按照1 %的接種量接入種子液，搖床轉速180rpm，發酵溫度37°C，發酵至36h結束發酵；(5)將上述菌株培養液離心除去菌體、收集上清液，用95%的乙醇沉淀、回收 Y-PGA。(6)檢測分析所得到的Y -谷氨酸的濃度為44. 7g/L。實施例5 γ -谷氨酸的發酵生產(1)用冷凍保藏的本發明菌株P-104作為生產菌株；(2)將冷凍保藏的菌株P-104，接種到LB固體斜面(含蛋白胨10g/L、酵母浸出物 5g/L、NaCl 10g/L、瓊脂18g/L、pH 7. 0)，30°C培養14h，刮取菌苔至無菌的20%甘油保藏管中；-80°C冷凍保藏；(3)種子液培養將上述冷凍保藏的菌種接種到LB固體培養基平板上，30°C培養36h，使其活化；將活化的種子轉接到含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L、pH7. 0的LB三角瓶液體種子培養基中，35°C，200rpm培養14h至對數生長中期；(4)發酵罐發酵培養按照每IL培養基的加入量配置發酵培養基谷氨酸鈉70g ；葡萄糖80g ；檸檬酸鈉 IOg ；硫酸銨 IOg ；K2HPO4 · 3H20 0. 6g ；MgSO4 · 7H20 0. 8g ；MnSO4O. 15g ；NaN032g，補充蒸餾水至1000mL，pH 7. 5，配制3L發酵液分裝7L發酵罐，以115°C高壓蒸汽滅菌維持30min，冷卻至37°C按照3%的接種量接入種子液，攪拌速度為600rpm，通風量0. 5vvm，發酵溫度37°C， 發酵至36h結束發酵。(5)將上述菌株培養液離心除去菌體、收集上清液，用異丙醇沉淀、回收Y-PGA。(6)檢測分析所得到的Y -谷氨酸的濃度為32g/L。實施例6 Y -谷氨酸的發酵生產(1)用冷凍保藏的本發明菌株P-104作為生產菌株；
(2)將冷凍保藏的菌株P-104，接種到LB固體斜面(含蛋白胨10g/L、酵母浸出物 5g/L、NaCl 10g/L、瓊脂18g/L、pH7. 0)，33°C培養10h，刮取菌苔至無菌的20%甘油保藏管中；-100°C冷凍保藏；(3)種子液培養將上述冷凍保藏的菌種接種到LB固體培養基平板上，34°C培養30h，使其活化；將活化的種子轉接到含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L、pH7. 0的LB三角瓶液體種子培養基中，30°C，200rpm培養1 至對數生長中期；(4)發酵罐發酵培養按照每IL培養基的加入量配置發酵培養基谷氨酸鈉70g ；葡萄糖80g ；檸檬酸 IOg ；硫酸銨 IOg ；K2HPO4 · 3H20 0. 6g ；MgSO4 · 7H20 0. 8g ；MnSO4O. 15g ；NaN034g ；CaCl2 · 2H20 0. lg，補充蒸餾水至lOOOmL，pH 7. 0，配制3L發酵液分裝6. 6L發酵罐，以115°C高壓蒸汽滅菌維持31分鐘，冷卻至30°C按照5%的接種量接入種子液，攪拌速度為400rpm，通風量 2vvm,發酵溫度37 °C，發酵至2 Ih時加入40g/L葡萄糖120ml，繼續發酵至3 結束發酵。(5)將上述菌株培養液離心除去菌體、收集上清液，用95%的乙醇沉淀、回收 Y-PGA。(6)檢測分析所得到的Y -谷氨酸的濃度為41. 6g/L。實施例7 y -PGA發酵生產(1)用冷凍保藏的本發明菌株P-104作為生產菌株；(2)將冷凍保藏的菌株P-104，接種到LB固體斜面(含蛋白胨10g/L、酵母浸出物 5g/L、NaCl 10g/L、瓊脂18g/L、pH 7. 0)，32°C培養llh，刮取菌苔至無菌的20%甘油保藏管中；-70. 5°C冷凍保藏；(3)種子液培養將上述冷凍保藏的菌種接種到LB固體培養基平板上，37°C培養^h，使其活化；將活化的種子轉接到含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L、pH7. 0的LB三角瓶液體種子培養基中，370C，200rpm培養他至對數生長中期；(4)搖瓶發酵培養按照每IL培養基的加入量配置發酵培養基谷氨酸鈉IOg ；葡萄糖和淀粉IOOg ； 檸檬酸鈉 5g ；硫酸銨和氯化銨 20g ;K2HP04 · 3H20 0. Ig ；MgSO4 · 7H20 2g ；MnSO4O. Olg ；補充蒸餾水至lOOOmL，pH 6.0，配制50mL發酵液分裝500mL三角瓶，在115°C下，高壓蒸汽滅菌 50min，冷卻至37°C，按照5%的接種量接入種子液，搖床轉速230rpm，發酵溫度37°C，發酵至24h結束發酵；(5)將上述菌株培養液離心除去菌體、收集上清液，用異丙醇沉淀、回收Y-PGA。(6)檢測分析所得到的Y -谷氨酸的濃度為38. 2g/L。實施例8 γ -谷氨酸的發酵生產(1)用冷凍保藏的本發明菌株P-104作為生產菌株；(2)將冷凍保藏的菌株P-104，接種到LB固體斜面(含蛋白胨10g/L、酵母浸出物 5g/L、NaCl 10g/L、瓊脂18g/L、pH7. 0)，30°C培養8h，刮取菌苔至無菌的20%甘油保藏管中；-120°C冷凍保藏；(3)種子液培養
將上述冷凍保藏的菌種接種到LB固體培養基平板上，37°C培養30h，使其活化；將活化的種子轉接到含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L、pH7. 0的LB三角瓶液體種子培養基中，30°C，200rpm培養1 至對數生長中期；(4)發酵罐發酵培養按照每IL培養基的加入量配置發酵培養基谷氨酸鈉IOOg ；葡萄糖IOg ；檸檬酸鈉 IOg ；硫酸銨3g ；K2HPO4 ·3Η20 2g ；MgSO4 ·7Η200· Ig ；MnSO4O. 15g ；NaNO3IOg ；CaCl2 '2H202g, 補充蒸餾水至1000mL，pH7. 0，配制2. 4L發酵液分裝3L發酵罐，以115°C高壓蒸汽滅菌維持 20分鐘，冷卻至30°C按照2%的接種量接入種子液，攪拌速度為200rpm，通風量1. 2vvm，發酵溫度37°C，發酵至25h時加入40g/L葡萄糖120ml，繼續發酵至4 結束發酵。(5)將上述菌株培養液離心除去菌體、收集上清液，用95%的乙醇沉淀、回收 Y-PGA。(6)檢測分析所得到的Y -谷氨酸的濃度為40. Og/L。申請人:聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的具體操作步驟，但本發明并不局限于上述操作步驟，即不意味著本發明必須依賴上述具體操作步驟才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護范圍和公開范圍之內。
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權利要求
1.一種用于Y-PGA發酵生產的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)P-104，于 2010年9月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為 CGMCC No. 4156。
2.一種如權利要求1所述地衣芽孢桿菌P-104在合成、-PGA中的應用。
3.一種如權利要求1所述地衣芽孢桿菌P-104合成制備Y-PGA的方法，包括以下步驟a、采用地衣芽孢桿菌P-104、保藏編號為CGMCCNo. 4156的菌株作為生產菌株；b、將上述菌株接在LB培養基固體斜面上培養8-14h；刮取菌苔至無菌甘油保藏管中； 在不高于-70°C冷凍條件下保藏；C、制備種子液(1)將上述冷凍保藏的菌種接種到LB固體培養基平板上，培養至少對-3他，使其活化；(2)將上述活化的種子轉接到LB液體種子培養基中，培養至對數生長中期；d、發酵培養(1)配置發酵培養基每IL培養基加入谷氨酸鈉IO-IOOg；碳源IO-IOOg ；無機氮源 3-20g ；K2HPO4 · 3H20 0. l_2g ；MgSO4 · 7H20 0. l_2g ；檸檬酸鈉 2-10g ；MnSO4O. 01-0. 2g ；補充蒸餾水至IOOOmL,調節pH 6. 0-7. 5 ；(2)將上述發酵培養基投入搖瓶或發酵罐中，高壓蒸汽滅菌至少20min后，冷卻至 30-37°C，按1-5%的接種量接入種子液，培養Μ-4 !；e、提取將d中得到的菌株培養液離心除去菌體、收集上清液，并用乙醇或異丙醇沉淀、回收Y-PGA0
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，制備種子液步驟( 時培養8-1 至對數生長中期。
5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，搖瓶培養時，按50-100mL/500mL三角瓶的裝液量投入發酵培養基。
6.如權利要求3所述的方法，其特征在于，發酵罐培養時，按發酵罐容積的40-80%投入發酵培養基，攪拌速度為200-600rpm，通氣量為0. 5-2vvm。
7.如權利要求3-6之一所述的方法，其特征在于，在發酵罐培養過程中進行補料；補料方式優選加入葡萄糖。
8.如權利要求3-7之一所述的方法，其特征在于，所述LB固體培養基含蛋白胨10g/L、 酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L、瓊脂18g/L，pH7. 0 ；LB液體種子培養基含蛋白胨10g/L、酵母浸出物 5g/L、NaCl 10g/L, ρΗ7· 0。
9.如權利要求3-8之一所述的方法，其特征在于，所述發酵培養基的成分還包括 NaNO3> CaCl2 · 2Η20 ；所述谷氨酸鈉的含量優選30-100g/L ；優選地，無機氮源為硫酸銨、氯化銨或硝酸鈉中的一種或幾種；含量為5-20g/L ； 優選地，碳源為葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、淀粉或淀粉水解液中的一種或幾種；含量為 30-100g/L。
10.如權利要求3-9之一所述的方法，其特征在于，各步驟所述的培養優選在30-37°C條件下進行；所述高壓蒸汽滅菌優選在115°C下滅菌30min。
全文摘要
本發明涉及一種用于γ-PGA發酵生產的地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis P-104及其應用，于2010年9月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.4156。本發明的地衣芽孢桿菌P-104是從中國傳統豆醬制品中篩選分離得到，生產周期短、生產效率高、生產成本低，利用本發明的菌株及其發酵方法，γ-聚谷氨酸的7L發酵罐產量達到32g/L，補料發酵產量可達到41.6g/L。本發明具有生產周期短、生產效率高、生產成本低等優點。
文檔編號C12R1/10GK102367431SQ20111035837
公開日2012年3月7日 申請日期2011年11月11日 優先權日2011年11月11日
發明者劉會洲, 張業偉, 羅明芳, 魏雪團 申請人:中國科學院過程工程研究所