專利名稱：極端嗜鹽古菌NaSOD基因在提高水稻耐鹽性中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及功能基因組學領域，尤其涉及極端嗜鹽古菌NaSOD基因在提高水稻耐鹽性中的應用。
背景技術：
隨著生態環境的惡化、設施農業的發展和化肥使用的不當，土壤鹽漬化已成為一個世界性的資源問題和生態問題，鹽堿地的面積逐年增加(Mahajan S，Tuteja N. Cold, salinity and drought stresses :an overview [J] · Arch.)。據不完全統計，全世界鹽喊地面積約9.討億111112爾40，2008)。我國鹽漬土面積大，分布廣泛，類型多樣，各類鹽堿地面積總計9913. 3萬hm2，其中現代鹽堿土面積為3693萬hm2，殘余鹽堿土約4487萬hm2，并且尚存在有約1733萬hm2的潛在鹽堿土(李彬等.中國鹽堿地資源與可持續利用研究[J].干旱地區農業研究.2005，23 :巧4-158.)。鹽脅迫已經成為影響植物生長、導致糧食和經濟作物減產的主要限制因素。解決土壤鹽漬化一般采取以下兩種措施，一是用排水和灌溉洗鹽等物理方法或石膏和硫磺等化學方法改良土壤；二是通過常規育種或生物技術手段培育耐鹽作物品種。前者投入成本高。目前生物改良措施(如種植耐鹽植物)已成為治理鹽堿地最積極主動而長期有效的途徑，提高植物尤其是作物的耐鹽性已是未來農業發展的重大課題之一。功能基因的發掘與利用是當今世界生物資源競爭的制高點。一旦誰擁有更多的功能基因資源，誰就會在生物經濟競爭中掌握主動權。海底熱液口和高山鹽湖是地球上二個最為典型的極端環境。高山鹽湖是古海洋的殘留產物，與鹽池同樣具有太陽輻射強、多風少雨、蒸發量大等極端惡劣的環境條件，使得原本豐富的生物圖消失了，而進化出了高山鹽湖特有的生物種類-嗜鹽微生物。這些具有高度耐鹽能力的生物在長期進化的過程中不斷完善了它們的代謝途徑以適應由高鹽引起的巨大滲透壓。自上個世紀50年代，人們就開展了其適應機理的研究，但是高山鹽湖耐高鹽基因資源的開發利用到目前為止尚未有突破性的進展。生物學家和育種家通過傳統的育種方法培育耐鹽品種，提高植物的耐鹽能力，從而減輕鹽堿對農林業生產的影響，現已取得一定的進展，但發展緩慢。轉基因技術打破了物種之間的生殖隔離障礙，拓寬植物資源的遺傳背景，直接在基因水平上改造植物的遺傳物質，定向改造植物的遺傳性狀或特性，從而有效地提高植物的耐鹽性，彌補常規育種方法的不足。至今植物抗鹽轉基因工程的研究取得了長足的進展，展現出誘人的前景。如Ohta等 (2002)將液泡型Na+/H+反向轉運蛋白(SOSl)基因轉入水稻中，可顯著提高轉基因植株后代的耐鹽性。將胞間囊泡轉運蛋白在擬南芥中過表達，轉基因植物降低了 ROS的積累，提高了耐鹽能力(Alexander Μ, Yehoram L, Budhi ST, Alex L. Induction of salt and osmotic stress tolerance by overexpression of an intracellular vesicle trafficking protein AtRab7 (AtRabG3e) [J]. Plant Physiol，2004，134 :118-1 .)。P5CS(2_ 氫吡咯 5-羧酸合成酶)基因是合成脯氨酸必需的中間酶，將P5CS基因轉入煙草、小麥、馬鈴薯和水稻，轉基因植株的耐鹽性均明顯高于對照。植物體內ROS清除系統活性或含量的高低是植物耐鹽性的重要指標之一。 SOD (superoxide dismutase，超氧化物歧化酶)是抗氧化系統中的第一道防線，在酶保護系統中處于核心地位。許多研究發現，在鹽分脅迫下，植物體內SOD等酶的活性與植物的抗氧化脅迫能力呈正相關。將SOD基因轉入不同作物中，如水稻、煙草、白菜和辣椒，其轉基因株系的耐鹽性均顯著增強。水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的糧食作物之一，是世界近一半人口、特別是亞洲居民的主糧。但由于大量鹽漬化土壤的存在，使得相當大的一部分水稻，受不同程度鹽害而產量大幅度降低。充分利用抗鹽基因培育出新的抗鹽新品種，是提高作物抗鹽性經濟、有效的方法。中國專利申請 200810163748. 8 公開了極端嗜鹽菌(Natrinema altunense sp.) 高鹽耐受相關蛋白及其編碼基因與應用，該基因的序列為序列表SEQ. ID. NO. 1所示，序列全長為6(X3bp，編碼的蛋白為嗜鹽古菌的MnSOD。該基因在大腸桿菌中表達可提高大腸桿菌耐受高鹽環境的能力。
發明內容
本發明提供了一種極端嗜鹽古菌(Natrinema altunense sp. )NaSOD基因在提高水稻耐鹽性中的應用。一種極端嗜鹽古菌(Natrinema altunense sp. ) NaSOD基因在提高水稻耐鹽性中的應用，所述的極端嗜鹽古菌NaSOD基因的堿基序列如SEQ IDN0. 3所示。具體包括構建包含所述極端嗜鹽古菌NaSOD基因的表達載體，通過農桿菌介導將極端嗜鹽古菌(Natrinema altunense sp.)NaSOD基因轉入水稻細胞，培養生成水稻耐鹽植株。所述的表達載體包括原始載體和插入原始載體的啟動子和終止子，所述的原始載體為 pCAMBIA1301。所述的啟動子為CaMV 35S啟動子。所述的終止子為NOS終止子。過表達NaSOD轉基因水稻具有較高的ROS清除能力，能夠減輕鹽處理引起的膜脂過氧化，從而保證了較高的光合速率，本發明將極端嗜鹽古菌(Natrinema altunense sp.) NaSOD基因轉入水稻中，可顯著提高水稻耐鹽性能。
圖1為植物表達載體pl301_NaS0D構建示意圖；圖 2 為 ρ 1301-NaSOD 轉基因水稻 T0 代 PCR 檢測，M :DL 2000 DNAladder ；NC 水； WT:野生型；1-14:轉基因植株;圖3為NaCl鹽處理8d對水稻幼苗生長的影響；A =Ommol/L NaCl ；B =IOOmmol/L NaCl。WT 野生型水稻；L1、L2 轉基因水稻；圖4為SOD活性分析；A 鹽脅迫對SOD酶活性的影響，0，3，6 =IOOmmol/L NaCl處理天數；Student' s t-test. (*，P ^ 0. 05 ；**，P ^ 0. 01) ；B :S0D 染色分析WT 野生型水稻；Li、L2 轉基因水稻。TOTAL 總SOD活性；H2O2處理后染色的是MnSOD活性。Li、L2有兩條條帶，上面一條為水稻MnSOD，下面一條為NaSOD ；圖5為鹽脅迫對O2. _產生速率和H2O2含量的影響；A 0廠產生速率；B =H2O2含量；WT 野生型水稻；Li、L2 轉基因水稻；0，3，6 鹽處理天數；Student' s t_test. (*， P ≤ 0· 05)；圖6為鹽脅迫對水稻葉片相對電導率和MDA含量的影響；A 相對電導率；B :MDA含量；WT 野生型水稻；L1、L2 轉基因水稻；0，3，6 鹽處理天數；圖7為鹽脅迫對水稻幼苗光合速率和葉綠素熒光參數的影響；A 凈光合速率 (Pn) ；B =PSII的最大光化學效率(Fv/Fm) ；C 有效光化學量子產量(Fv' /Fm’)；D 電子傳遞速率(ETR) ；WT 野生型水稻；Li、L2 轉基因水稻；0，3，6 鹽處理天數；Student' s t-test.(氺，P^O. 05)。
具體實施例方式實施例1表達載體pl301_NaS0D構建培養含質粒pGEX-SOD(專利申請200810163748. 8)的大腸桿菌，用嗜鹽古菌NaSOD 基因的特異性引物(分別添加I3St I和Kpn I酶切位點)進行菌液PCR，將回收純化的PCR 產物連接到中間載體PMD19-T上，轉化大腸桿菌DH5ci。挑取陽性克隆，PCR及測序鑒定。 搖取正確的菌液提取質粒pMD19-NaS0D。Pst I和Kpn I雙酶切質粒pMD19_NaS0D，然后插入pCAMBIA1301的多克隆位點中，并在目的基因前后分別插入CaMV35S啟動子和NOS終止子，得植物表達載體pl301-NaS0D (如圖1所示)。重組子經酶切鑒定后，凍融法導入農桿菌 EHA105 中。NaSOD特異性引物NaSOD-F :5’ -CGGGGTACCATGACTGATCACGAACTTCCAC-3’ (Kpn I)NaSOD-R :5，-AAACTGCAGTTACTCGAAGTGGTCGAG GCAG-3，(Pst I)實施例2農桿菌介導的水稻遺傳轉化分別采用水稻的成熟胚為外植體誘導、培養愈傷組織，挑選胚性愈傷組織作為轉化受體°按照見6[等(Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumashiro T. Efficient transformation of rice(Oryza sativa L. )mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA[J]. Plant. 1994，6 :271-82.)的遺傳轉化策略，通過攜帶植物表達載體pl301-NaMnS0D的根癌農桿菌EHA105轉化到水稻愈傷組織中，經一系列篩選，分化得到轉基因水稻。具體如下(1)水稻成熟胚愈傷組織的誘導及繼代培養日本晴(Oryza sativa L. cv. Nipponbare)成熟種子去殼后以70%酒精消毒2min，20% (V/V)次氯酸鈉溶液(加2 3 滴吐溫-200)浸泡30min，用無菌蒸餾水清洗種子4 5遍后以無菌濾紙吸干表面水分，移至成熟胚誘導培養基中二8°C光照培養2周，誘導愈傷組織；用鑷子將愈傷組織取出，轉入繼代培養基中，28°C光照培養，繼代培養1周即可用于轉化。(2)農桿菌的培養在感染前1周，活化農桿菌。感染前2 3d，在含50mg/L Kam(卡那霉素)和40mg/L Rif (利福平)的YM培養基上劃線，28°C暗培養。收集菌體，將其懸浮于含有200 μ mol/L已酰丁香酮(As)的AAM液體懸浮培養基，調整菌體濃度至0D600為0.8 1.0，既可用于轉化。(3)侵染將準備好的水稻愈傷組織轉移到無菌三角瓶中，倒入適量農桿菌懸浮液，侵染15min。(4)共培養傾去菌液，將愈傷組織置于無菌濾紙上浙干30 40min。然后將愈傷組織置于鋪有一層無菌濾紙的固體共培養培養基于25°C暗培養3d。(5)抗性愈傷組織的篩選及植株再生將共培養后的愈傷組織用無菌水清洗后晾干，轉入含500mg/L羧芐青霉素和50mg/L潮霉素的選擇培養基上進行第一輪選擇，28 °C，暗培養14天；長有抗性愈傷的初始愈傷轉到新的選擇培養基上進行第二輪選擇，28°C，光照培養，直到顆粒性的抗性愈傷組織長出；選擇致密的抗性愈傷組織轉移到含有潮霉素的分化培養基上，于25°C，1 光照/1 黑暗條件下培養；待再生小苗長成約1 2cm高時，將其移到生根培養基，25°C，光周期培養；(6)煉苗與移栽將苗根部和莖葉分化得較完好的挑出，打開封口膜，煉苗3d至1 周左右，洗去瓊脂，培養箱水培1周，移栽到溫室的土缽中種植。實施例3轉基因植株的鑒定潮霉素篩選再生苗移栽到溫室后，選取同位新葉，取2 3cm，浸泡于含50mg/L 潮霉素和1. Omg/L 6-BA的無菌水中。5d后非轉基因水稻葉片變黃變褐，假陽性植株葉片也變黃，轉化植株葉片保持綠色。轉基因水稻的PCR檢測SDS法提取水稻葉片總DNA，以NaSOD特異性引物擴增，14 株轉基因樣本均在621bp處有條帶(如圖2所示)。實施例4轉基因水稻的耐鹽性觀察Tl代種子用潮霉素篩選，選擇感/抗比為1 3的兩個株系，繼續繁殖。純合株系及野生型以國際水稻所標準營養液(Yoshida et al. ,1976)進行水培，20d后以lOOmmol/L NaCl處理，處理3d后野生型植株下部老葉失水萎蔫，上部新葉葉尖變黃且發生卷曲，但轉基因植株鹽處理5d后才開始萎蔫和卷曲現象。8d后，野生型植株幾乎整株萎蔫、枯萎，而轉基因水稻只有下部老葉枯萎(如圖3所示)。 實施例5轉基因水稻的耐鹽機理分析另選水培至35d的幼苗，以100mmol/L NaCl處理3d和6d，測定SOD活性、光合氣
體交換參數、葉綠素熒光參數、丙二醛含量。Brennan (Brennan Τ, Rychter A, Frenkel C. Activity of enzymes involved in the turnover of hydrogen peroxide during senescence[J]. Bot Gaz. . 1979，140 :384-388.)的方法略作修改。待測樣品0. Ig在預冷研缽中加液氮研磨成粉末狀，以 2mL 預冷的提取緩沖液(50mmol/L PBS pH7. 0, lmmol/L EDTA,3mmol/L DTT 禾口 5% PVP-40)，冰浴研磨。勻漿物在4°C，15000Xg離心20min，上清液用于酶活性分析。SOD定量分析用NBT染色法。如圖4 (A)所示，在正常條件下，轉基因植株的SOD總酶活比非轉基因水稻的SOD總酶活分別高出14. 3%和14. 5%，達到顯著性差異。隨著IOOmM NaCl的處理，轉基因植株的SOD總酶活呈逐漸上升的趨勢，非轉基因水稻的SOD總酶活先上升后下降。鹽處理第6天時，轉基因植株的SOD總酶活遠遠高于非轉基因水稻的SOD總酶活，達到極顯著水平。SOD定性分析首先用非變性PAGE垂直平板凝膠電泳分離，每齒點樣8_10 μ L上清液(約50 μ g蛋白)，電泳時上層2. 5%凝聚膠為15mA，下層10%分離膠為20mA，約2. 5h 可電泳完畢。電泳后凝膠用蒸餾水洗2遍，加入SOD活性染液1(2. 45mmol/L NBT)，黑暗下浸泡 30min，倒掉染液 I，加入 SOD活性染液 II (28mmol/L TEMED, 0. 028mmol/L核黃素，36mmol/ L PBS，pH 7. 8)黑暗浸泡20min，倒掉染液II，快速用蒸餾水洗2遍，倒入50mM PBS (pH 7.8， 10mmol/L EDTA)置于36W日光燈下顯色，至青紫色背景中顯出SOD透明亮帶。可在SOD活性染液II加入5mmol/L H2O2抑制!^eSOD和Cu/ZnSOD的活性，從而分辨出水稻MnSOD和 NaSOD。如圖4(B)所示，非轉基因水稻顯示六條帶，轉基因水稻電泳膠上多出一條新的帶， 并且這條帶經H2A處理后仍然存在。因為H2A會抑制i^eSOD和Cu/ZnSOD的活性，但MnSOD 對H2A不敏感，說明轉基因水稻電泳膠上多出這一新的條帶為來自嗜鹽古菌的MnSOD，所以 NaMnSOD已成功地在轉基因植株中功能性表達。0廠產生速率的測定取待測樣品0. 2g加3mL磷酸鉀緩沖液(50mmol/L，pH 7. 0)， 冰浴研磨，勻漿液IOOOOXg離心20min，取上清為0廠提取液。0. 5mL樣品提取液中加入 0. 5mL磷酸鉀緩沖液(50mmol/L，pH7. 8)和lmmol/L鹽酸羥胺lmL，搖勻，于25°C中保溫lh， 然后再加入17mmol/L對氨基苯磺酸ImL和7mmol/L α -萘胺lmL，混勻，于25°C中保溫 20min,于波長530nm下測定OD值。用N02_作標準曲線，若要排除葉綠素干擾，可在樣品與羥胺溫浴后，加入等體積的乙醚萃取葉綠素，離心吸取下相，在530nm比色。結果以[nmol/ (min. gFff)]表示。H2O2含量的測定稱取0. Ig葉片在液氮中研磨成粉末狀，加入3mL預冷的提取緩沖液(50mmol/L PBS, ρΗ7· 0)冰浴研磨。勻漿物以6000X g，4°C離心25min，上清液為H2O2 提取液。3mL提取液加入ImL 0.1%氯化鈦(含20%硫酸)，6000Xg離心15min，取上清液于410nm下測定OD值。消光系數0. 28 μ mol/L · cm。如圖5㈧所示，隨著鹽脅迫時間的延長，轉基因植株與非轉基因水稻葉片內 0廠產生速率都有升高的趨勢，但IOOmM NaCl處理6d后，轉基因植株葉片內02__產生速率又有所下降，分別升高了 15.4%和16.2%，而非轉基因水稻葉片內0廠產生速率升高了 49. 9%。如圖5⑶所示，H2A含量的變化趨勢和02__產生速率的變化趨勢相似。鹽處理3 天后非轉基因水稻的H2O2含量增加了 62%，而轉基因植株分別增加了和19%。脅迫 6天后，轉基因植株含量只增加了 8. 75%和7. 3%，非轉基因水稻卻增加了 46. 7%。總之， IOOmM NaCl脅迫下，轉基因植株H2A含量顯著低于非轉基因水稻的H2A含量，因此過表達 NaSOD轉基因水稻具有較高的ROS清除能力。相對電導率的測定稱取新鮮葉片0. lg，加20mL雙蒸水，抽真空lOmin，室溫浸泡過夜，用電導儀(H0RIBA.)測定溶液初電導率Re，之后將葉片連同浸泡液一起置于沸水浴中加熱lOmin，冷卻至室溫后再次測定溶液終電導率Re’，最后計算相對電導率(Rec = Re/ Re，X 100% ) ο每樣重復3次。丙二醛含量測定稱取0. Ig水稻葉片在液氮中研磨成粉末狀，以3mL預冷的提取緩沖液勻菜(50mmol/L PBS ρΗ7· 0，3mmol/L DTT，lmmol/L EDTA_Na2，5% PVP)。勻漿物以 4000Xg離心lOmin，上清液為樣品提取液。取上清液Iml加入3mL 27%三氯乙酸和ImL 2%巴比妥酸，混合物沸水浴保溫30min，冰浴上迅速冷卻后，15000Xg離心lOmin，在分光光度計上分別于450nm、532nm、600nm處測定上清液的OD值。MDA的濃度按照如下公式計算MDA ( μ mol/L) = 6· 45 X (OD532-OD600) _0· 56 X OD450。如圖6(A)所示，正常條件下，轉基因水稻的相對電導率與對照沒有顯著差異。隨著IOOmM NaCl處理時間的延長，兩種水稻的相對電導率均不斷增加，說明隨著鹽脅迫時間的延長，膜透性增加，對膜傷害越來越嚴重。但轉基因水稻的相對電導率均小于對照組，且達到顯著性差異，表明IOOmM NaCl脅迫下，轉基因植株膜穩定性好，受到的傷害小，即轉基因植株對鹽脅迫耐性增強。如圖6(B)所示，正常條件下，轉基因水稻的MDA含量與對照沒有顯著差異。但鹽處理3d后，非轉基因水稻MDA含量增加達148. 3 %，而轉基因植株只增加了 44%和18. 2%。 鹽處理6d后膜脂過氧化程度有所下降，可能是由于此時它的膜泄露程度過大而膜脂過氧化程度有所降低。但轉基因植株的MDA含量仍顯著性低于非轉基因水稻。說明轉基因植株更能有效地清除R0S，降低鹽脅迫誘導的活性氧對植物造成氧化損傷。光合氣體交換參數與葉綠素熒光參數的測定選取長勢一致的完全展開的第五葉片，用美國LI-COR公司生產的LI-6400便攜式光合系統于處理后0、3、6d在8:00-11:00測定其光合速率(Pn)，每次測定重復三次，每處理測3株水稻。用LI-6400配套的熒光葉室， 測定相同葉位的葉綠素熒光。測定前植株要暗適應30min。暗適應30min的植株測R)，用 0. 8-s飽和的紅藍光8000 μ mol JiT2iT1照射，獲取最大熒光(Fm)，然后，把植株置于持續的光化學活性光(PPFD = 1500 μ mol πΓ、—1)光平衡30min，得到穩態熒光(Fs)；接著，用飽和光 (PPFD = 6000 μ mol mH照射，得到光適應后的最大熒光(Fm’)；最后施加遠紅光以測量光適應最小熒光你’。其他的葉綠素熒光參數按下述公式計算PSII 的最大光化學活性(Fv/Fm) = (Fm-Fo)/Fm ；PSII 原初光能轉化效率(Fv，/Rn，)= 0 ' -Fo' )/Fm'；PSII 的電子傳遞速率(ETR) = (Fm' -Fs)/Fm' 1X0.84X0.5。如圖7(A)所示，鹽脅迫導致轉基因植株與非轉基因水稻葉片凈光合速率(Pn)持續下降，但轉基因植株的下降程度較輕，從而維持在鹽脅迫下有較高的光合效率。如圖7 (B) 所示，鹽脅迫導致轉基因植株與非轉基因水稻的Fv/Fm隨著鹽脅迫而持續下降，但轉基因植株的Fv/Fm下降幅度很小，與非轉基因水稻相比達到了顯著性差異，說明較IOOmMNaCl鹽脅迫導致非轉基因水稻PSII的永久失活或破壞而言，轉基因植株對PSII有較好的保護作用。如圖7(C)和7(D)所示，Fv’ /Fm’和ETR的變化趨勢與Fv/Fm相似，進一步說明轉基因植株能降低ROS對葉綠體類囊體膜的損傷從而保證了較高的光合速率。
權利要求
1.一種極端嗜鹽古菌(Natrinema altunense sp.) NaSOD基因在提高水稻耐鹽性中的應用，所述的極端嗜鹽古菌NaSOD基因的堿基序列如SEQ ID NO. 3所示。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，包括構建包含所述極端嗜鹽古菌NaSOD基因的表達載體，通過農桿菌介導將極端嗜鹽古菌 (Natrinema altunense sp.)NaSOD基因轉入水稻細胞，培養生成水稻耐鹽植株。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的表達載體包括原始載體和插入原始載體的啟動子和終止子，所述的原始載體為PCAMBIA1301。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述的啟動子為CaMV35S啟動子。
5.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述的終止子為NOS終止子。
全文摘要
本發明公開了一種極端嗜鹽古菌(Natrinema altunense sp.)NaSOD基因在提高水稻耐鹽性中的應用，所述的極端嗜鹽古菌NaSOD基因的堿基序列如SEQ ID NO.3所示。過表達NaSOD轉基因水稻具有較高的ROS清除能力，能夠減輕鹽處理引起的膜脂過氧化，從而保證了較高的光合速率，本發明將極端嗜鹽古菌NaSOD基因轉入水稻中，可顯著提高水稻耐鹽性能。
文檔編號C12N15/53GK102399816SQ20111036030
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月15日 優先權日2011年11月15日
發明者朱誠, 楊衛軍, 潘艷會, 陳珍 申請人:中國計量學院, 臺州學院, 浙江大學