專利名稱：一種低溫木聚糖酶ba-xyl11a及其基因和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地，涉及一種低溫木聚糖酶BA-XYL11A及其基因和應用。
背景技術：
半纖維素作為植物細胞壁的主要組分，是陸生植物中繼纖維素之后含量最豐富的碳水化合物，約占植物干重的35%。其中木聚糖是半纖維素中的代表性組分，是自然界中含量僅次于纖維素的第二豐富的多聚糖，幾乎占地球可更新有機碳含量的三分之一(Collins et al.FEMS Microbiology Reviews. 2005,29 :3-23.) 但是木聚糖是一種雜聚多糖，它的主鏈是由吡喃木糖通過β -1，4糖苷鍵連接而形成的，在主鏈的吡喃木糖環的2號，3號和5 號位有不同的取代基。這些取代基包括4-0-甲基-D-葡萄糖醛酸殘基、α -L-阿拉伯糖殘基、0-乙酰基等，其中α -L-阿拉伯糖殘基上又可與阿魏酸和香豆酸等酚酸酯化。木聚糖酶是可將木聚糖降解成低聚糖和木糖的一類酶，它能夠隨機地切割木聚糖主鏈骨架β _1，4糖苷鍵，最后生成木糖、寡聚木糖或帶有側鏈的寡聚木糖。雖然木聚糖的完全降解需要多種酶的協同作用，包括β -D-木糖苷酶、α -D-葡萄糖醛酸苷酶、α -L-阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶等酶；但是在木聚糖的降解過程中，內切-I，4_i3-D-木聚糖酶，也就是我們通常所說的木聚糖酶，從木聚糖的主鏈內部隨機切割吡喃木糖殘基之間的β_1，4-連接鍵，發揮的作用是最主要和最重要的。它們是木聚糖降解相關酶中研究最多和最有應用價值的一類酶。木聚糖酶在多個領域有著重要的應用作為飼料添加劑可以消除飼料里的木聚糖的抗營養作用，提高飼料的營養價值和利用率；在造紙工業上，可以用于紙漿的漂白，減少環境的污染；在食品行業上，可以用來生產功能性低聚木糖、面包發酵等；在能源上，可以用來水解木聚糖得到的木單糖發酵生產的燃料乙醇等等。此外，木聚糖酶在紡織、醫藥等其它行業也有廣泛的應用。據報道各種微生物如細菌和真菌等都能產生木聚糖酶。但獲得新型具有優良特性木聚糖酶的研究仍具有重大意義。低溫木聚糖酶由于其在低溫環境中具有較高的酶活，相對于中溫或高溫木聚糖酶有其特有的應用優勢(Gerday et al. Trends Biotechnology. 2000,18 :103-107)。比如水產動物由于水體環境影響其腸道溫度偏低，因此低溫木聚糖酶更適合作為水產飼料添加劑使用以提高養殖魚類對飼料中營養成分的吸收。同時，在食品工業中，低溫木聚糖酶與果膠酶及纖維素酶同時在低溫作用可有效降低果汁黏度，有效提高果汁口味。因此開發新型的低溫木聚糖酶將對推動木聚糖酶在各種工業中應用。目前報道的低溫木聚糖酶為第十和第八家族的木聚糖酶，而對糖苷水解酶第十一家族的木聚糖酶還未見報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種低溫木聚糖酶BA-XYLl 1A。本發明的另一目的是提供編碼上述低溫木聚糖酶的基因BA-xylllA。
本發明的另一目的是提供包含上述低溫木聚糖酶基因的重組載體。本發明的另一目的是提供包含上述低溫木聚糖酶基因的重組菌株。本發明的另一目的是提供制備上述低溫木聚糖酶的方法。本發明的另一目的是提供上述低溫木聚糖酶的應用。本發明從Bispora antennata CBS 126. 38菌株中獲得了一種低溫木聚糖酶 BA-XYLl 1A，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示MVSFSSLIFV VAAAVGVAAA PSEVLVERGG TPSSTGTNNG FYYSFffTDGAGDITYTNGAA60GQYNVKffSGN NGNFVGGKGff NPGSGRVINY SGTYCPNGNSYLSIYGffTRN PLIEYYIVEN120YGTYNPSSAA TKKGSITVDG SNYDILQTTR TNQPSIDGTK TFQQYffSVRTSKRSSGSVNT180QAHFDAffAKV GMKLGTEFNY LIVATEGYFS SGSATITVS 219其中，該酶全長219個氨基酸，N端19個氨基酸為其預測的信號肽序列 "MVSFSSLIFV VAAAVGVAA”。因此，成熟的低溫木聚糖酶BA-XYLlIA的理論分子量為21. 7kDa,其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2 APSEVLVERG GTPSSTGTNN GFYYSFffTDG A⑶ITYTNGA AGQYNVKffSGNNGNFVGGKG60WNPGSGRVIN YSGTYCPNGN SYLSIYGffTR NPLIEYYIVE NYGTYNPSSAATKKGSITVD120GSNYDILQTT RTNQPSIDGT KTFQQYffSVR TSKRSSGSVN TQAHFDAffAKVGMKLGTEFN180YLIVATEGYF SSGSATITVS 200該木聚糖酶BA-XYLlIA的最適pH為5. 0，在pH 3. 5-6. 0的范圍內，酶活性均維持在最大酶活性的50%以上。木聚糖酶在pH 4. 0-10.0之間均很穩定，在此pH范圍內處理 60min后剩余酶活性在90%以上，這說明此酶具有較好的pH穩定性。最適溫度為40°C，在 0-50°C間具有較高的木聚糖降解活性；在50°C處理30min，保持40%的酶活性，即使在0°C 時仍然具有約27%的相對活性，這為在低溫條件應用提供了可能；具有極好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶處理能力，經過糜蛋白酶、枯草蛋白酶、膠原蛋白酶、胃蛋白酶、或胰蛋白酶處理 Ih后，仍能維持40% -70%的活性；同時高密度發酵酶活性高，易于工業化生產。該酶的性質非常適合在飼料食品等行業中應用。本發明還提供了編碼上述低溫木聚糖酶BA-XYL11A的基因BA_xylllA。該酶的全基因序列如SEQ ID NO. 3所示atggtatcct tctcctccct catcttcgtt gtcgctgctg ccgttggggt tgctgctgcc 60ccttctgagg tccttgtaga gcgtggtgga acacctagct caacaggaac caacaacggt 120ttctactatt ctttctggac tgatggagct ggagatatca catataccaa tggagcagct 180ggacaataca atgtgaaatg gtctggcaac aatggaaact ttgttggagg aaagggatgg 240aacccaggaa gcggcaggta agaaaatccg attcactttg tcacaaattc ctataaaagc 300
aactcactaatcttctccgcgcttcagagtcatcaactactccggcacctactgccctaa360
tggcaatagctacctttccatctacggttggaccagaaaccctcttatcgagtactacat420
tgtcgaaaactacggcacctacaacccttctagtgctgctacgaagaagggctccatcac480
cgttgacggctcaaactacgatattctccagactacccgtaccaaccagccttccatcga540
tggtaccaagacctttcagcagtactggtctgtccgaacgagcaagcgctccagtggatc600
tgtcaacactcaagctcatttcgacgcatgggccaaggttggaatgaagttgggcacgga660
attcaactacttgatcgttgcaaccgagggatacttcagcagcggatcagcaactatcac720
cgtttcatag730
本發明通過PCR的方法分離克隆了這一木聚糖酶基因BA-xyl 11A，DNA全序列分析
結果表明，木聚糖酶BA-xylllA結構基因全長730bp，含有1個內含子，+258 328bp，為其
內含子序列，cDNA長660bp，其cDNA序列如SEQ ID NO. 4所示
atggtatccttctcctccctcatcttcgttgtcgctgctgccgttggggttgctgctgcc60
ccttctgaggtccttgtagagcgtggtggaacacctagctcaacaggaaccaacaacggt120
ttctactattctttctggactgatggagctggagatatcacatataccaatggagcagct180
ggacaatacaatgtgaaatggtctggcaacaatggaaactttgttggaggaaagggatgg240
aacccaggaagcggcagagtcatcaactactccggcacctactgccctaatggcaatagc300
tacctttccatctacggttggaccagaaaccctcttatcgagtactacattgtcgaaaac360
tacggcacctacaacccttctagtgctgctacgaagaagggctccatcaccgttgacggc420
tcaaactacgatattctccagactacccgtaccaaccagccttccatcgatggtaccaag480
acctttcagcagtactggtctgtccgaacgagcaagcgctccagtggatctgtcaacact540
caagctcatttcgacgcatgggccaaggttggaatgaagttgggcacggaattcaactac600
ttgatcgttgcaaccgagggatacttcagcagcggatcagcaactatcaccgtttcatag660
其中，信號肽的堿基序列為
"atggtatcct tctcctccct catcttcgtt gtcgctgctg ccgttggggt tgctgct” 9
因此，編碼成熟木聚糖酶的基因序列如SEQ ID NO. 5所示
gccccttctgaggtccttgtagagcgtggtggaacacctagctcaacagg3.3.CC3.3.C3.3.C60
ggtttctactattctttctggactgatggagctggagatatcacatataccaatggagca120
gctggacaatacaatgtgaaatggtctggcaacaatggaaactttgttggaggaaaggga180
tggaacccaggaagcggcagagtcatcaactactccggcacctactgccctaatggcaat240
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tag603
該酶屬于糖基水解酶第11家族。將木聚糖酶基因BA-XylllA的 cDNA
序列及推導出的氨基酸序列在GenBank中進行BLAST比對發現，與Glomerella graminicolaMl. OOl (EFQ27362)來源的一個預測的內切_1，4-β -木糖苷酶具有最高的氨基酸序列一致性為71%。說明BA-xylllA是一種新的木聚糖酶基因。本發明還提供了包含上述低溫木聚糖酶基因BA-xylllA的重組載體，優選為 pPIC-BA-xylllA。將本發明的木聚糖酶基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調控序列相連接。作為本發明的一個最優選的實施方案，優選為將本發明的木聚糖酶基因插入到質粒PPIC9上的EcoR I和NotI限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位于AOXl啟動子的下游并受其調控，得到重組酵母表達質粒 pPIC9-BA-xylllA0本發明還提供了包含上述低溫木聚糖酶基因BA-xylllA的重組菌株，所述菌株為酵母菌、大腸桿菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優選為重組畢赤酵母菌株GS115/BA-xylllA。本發明還提供了一種制備上述低溫木聚糖酶BA-XYL11A的方法，包括以下步驟1)用上述的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；2)培養重組菌株，誘導重組木聚糖酶BA-XYLl IA表達；以及3)回收并純化所表達的木聚糖酶BA-XYLl 1A。其中，所述宿主細胞為畢赤酵母細胞、啤酒酵母細胞或多型遜酵母細胞，優選將重組酵母表達質粒轉化畢赤酵母細胞(Pichic past0ris)GS115，得到重組菌株GS115/ BA-xylllA。本發明還提供了上述低溫木聚糖酶BA-XYL11A的應用，優選該酶在水解木聚糖及其在食品、飼料工業中的應用。本發明首先所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種性質優良的、 適合于在食品、飼料工業中應用新的低溫木聚糖酶。低溫木聚糖酶在室溫有非常高的活性， 因其不需要外加能量供酶促反應，所以在工業和農業上的應用可以節省大量的能源。本發明的木聚糖酶最適PH為5. 0，在pH 3-6都有較高的酶活性；在低溫下有很高的催化活性， 催化效率要比其它的低溫木聚糖酶高，即使在0°C時仍然具有約27%的相對活性。在食品工業中，低溫木聚糖酶與果膠酶及纖維素酶同時在低溫作用可有效降低果汁黏度，有效提高果汁口味，同時在面包的發酵過程中添加低溫木聚糖酶(面包發酵一般在20°C度左右) 可以改善面包的品質，增加面包的口感。在飼料工業中，低溫木聚糖酶可以作為水產飼料添加劑使用，降低飼料的黏度，增加營養物質的吸收。
圖1在畢赤酵母菌中表達的本發明重組木聚糖酶的SDS-PAGE分析，其中，1 蛋白質Marker ；2 含有木聚糖酶基因的畢赤酵母菌培養上清液濃縮液；3 純化的重組木聚糖酶；4:脫糖基后的木聚糖酶。圖2本發明重組木聚糖酶的最適pH。圖3本發明重組木聚糖酶的pH穩定性。圖4本發明重組木聚糖酶的最適溫度。圖5本發明重組木聚糖酶的熱穩定性。
具體實施例方式試驗材料和試劑
1、菌株及載體真菌Bispora antennata CBS 1 . 38，保存于荷蘭真菌保藏所 (CBS)其保藏號為CBS 1 . 38。畢赤酵母表達載體pPIC9及菌株65115購自于化“廿08611 公司。2、酶類及其它生化試劑內切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自hvitrogen公司。 燕麥木聚糖購自Sigma公司，其它都為國產試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。3、培養基(1)真菌Bispora antennata CBS 126. 38培養基為馬鈴薯汁培養基IOOOmL馬鈴薯汁，IOg葡萄糖，25g瓊脂，pH 5. O。(2)大腸桿菌培養基LB (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、NaCl，pH 7.0)。(3) BMGY 培養基1 % 酵母提取物，2 % 蛋白胨，1. 34 % YNB，0. 00004 % Biotin, 1 % 甘油(V/V)。 (4)) BMMY培養基除以0. 5 %甲醇代替甘油，其余成份均與BMGY相同，pH4. 0。說明以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J-薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行。實施例1 真菌 Bispora antennata CBS 126. 38 產酶特性將Bispora antennata CBS 126. 38經麥芽提取物培養基培養后，接種于誘導培養基中(0. 2% MgSO4 ·7Η20，0· 1% KH2PO4jO. 1% CuSO4 ·5Η20，0· 1% CaCl2,0. 5%蛋白胨，玉米芯粉，麩皮，PH 5.0)，30°C培養3 4d，測定其產纖維素酶和半纖維素酶的活性。經測定該菌為高產木聚糖酶菌株。實施例2真菌Bispora antennata CBS 126. 38木聚糖酶編碼基因BA-xylllA的克隆提取真菌 Bispora antennata CBS 126. 38 基因組 DNA 將液體培養3天的菌絲體用無菌濾紙過濾放入研缽中，加入2mL提取液，研磨 5min，然后將研磨液置于50mL離心管中，65°C水浴鍋裂解20min，每隔IOmin混勻一次，在 4°C下IOOOOrpm離心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇，于室溫靜置5min后，4°C下IOOOOrpm離心lOmin。棄上清，沉淀用70%的乙醇洗滌兩次，真空干燥，加入適量TE溶解，置于-20°C備用。根據第十一家族木聚糖酶基因的保守(P-L_[I/V/A/M]-E-Y-Y和 T-F-[QNJ-Q-Y-W-S)序列設計合成了簡并引物Pl，P2Pl 5 ‘ -TA[C/T][A/C]TG[A/G/T]S[A/T/G/C][C/G]T[C/G/T]TA[C/T]GG[C/G/T] TGG-3 ‘；P2 5' -ACCAGTA[C/T]TG[A/C/G/T]T[A/C/G/T][A/G]AA[A/C/G/T]GT-3‘。以 Bispora antennata CBS 126. 38 總 DNA 為模板進行 PCR 擴增。PCR 反應參數為94°C變性5min ；然后94°C變性30sec，48°C退火30sec，72°C延伸lmin，30個循環后72°C 保溫lOmin。得到一約200bp片段，將該片段回收后與pEASY_T3載體相連送三博生物技術有限公司測序。根據測序得到的核甘酸序列，設計上游和下游各三條TAIL-PCR特異性引物設計方向為需要擴增的未知區域方向，sp2的位置設計在spl的內側，sp3位于sp2的內側。每兩個引物之間的距離沒有嚴格規定，引物長度一般22-30nt，退火溫度在60 65°C。并將它們分別命名為uspl，usp2，usp3(上游特異性引物)，dspl，dsp2，dsp3(下游特異性引物) 見表1。表1.木聚糖酶BA-xylllA TAIL-PCR特異性引物
權利要求
1.一種低溫木聚糖酶BA-XYL11A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1或2所示。
2.一種低溫木聚糖酶基因BA-xylllA，其特征在于，編碼權利要求1所述的木聚糖酶。
3.根據權利要求2所述低溫木聚糖酶基因BA-xylllA，其特征在于，其堿基序列如SEQ ID NO. 3、4 或 5 所示。
4.包含權利要求2或3所述低溫木聚糖酶基因BA-xylllA的重組載體。
5.根據權利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為pPIC9-BA-xylllA。
6.包含權利要求2或3所述低溫木聚糖酶基因BA-xylllA的重組菌株。
7.根據權利要求6所述的重組菌株，其特征在于，所述重組菌株為畢赤酵母菌。
8.一種制備低溫木聚糖酶BA-XYLlIA的方法，其特征在于，包括以下步驟1)用權利要求4的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；2)培養重組菌株，誘導重組木聚糖酶BA-XYLlIA的表達；以及3)回收并純化所表達的木聚糖酶BA-XYLl1A。
9.權利要求1所述低溫木聚糖酶BA-XYLlIA的應用。
全文摘要
本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種低溫木聚糖酶BA-XYL11A及其基因和應用。本發明提供了一種低溫木聚糖酶BA-XYL11A，其具有如SEQ IDNO.1或2所示的氨基酸序列，且本發明還提供了編碼上述低溫木聚糖酶BA-XYL11A的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3、4或5所示，以及包含該基因的重組載體和重組菌株及其應用。本發明的低溫木聚糖酶BA-XYL11A所以在工業和農業上的應用可以節省大量的能源。本發明的低溫木聚糖酶是一種性質優良的、適合于在食品、飼料工業中應用新的低溫木聚糖酶。其最適pH為5.0，在pH 3-6都有較高的酶活性；在低溫下有很高的催化活性，催化效率要比其它的低溫木聚糖酶高，即使在0℃時仍然具有約27％的相對活性。
文檔編號C12N9/42GK102399768SQ20111036025
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月15日 優先權日2011年11月15日
發明者劉瓊, 姚斌, 孟昆, 楊培龍, 柏映國, 王亞茹, 石鵬君, 羅會穎, 袁鐵錚, 黃火清 申請人:中國農業科學院飼料研究所