專利名稱：促進載體和插入片段連接的方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，具體而言涉及一種通過插入片段的去磷酸化促進載體和插入片段連接的方法。
背景技術：
DNA片段的酶切連接，載體的構建最常用和經典的方法是通過限制性內切酶對載體和插入片段進行酶切，然后利用T4DNA連接酶將載體與目的片段連接成我們想要的DNA 片段。堿性磷酸酶在這個過程當中常被用做去磷酸化載體DNA 5’端磷酸基團，從而防止載體自身的連接。而插入片段與載體的連接其實是先由兩片段連接成為一條線狀DNA，然后在連接為環化DNA，這只是我們期望的情況，連接體系中還存在插入片段與插入片段的連接，載體與載體的連接，而這種情況DNA無法環化，無法用抗性篩選出來，單這些連接都是我們不期望的，且會降低我們期望的載體與插入片段連接后環化的情況。因此，如何提高載體與插入片段之間連接是本領域亟待解決的問題。
發明內容
針對目前載體與插入片段連接效率不高的缺陷，本發明提出通過插入片段的去磷酸化促進載體和插入片段連接。為了實現本發明的目的，采用如下技術方案本發明一方面涉及載體和插入片段連接的方法，包括如下步驟(1)使用限制性內切酶處理插入片段，然后使用堿性磷酸酶處理酶切片段；(2)使用相應的限制性內切酶處理載體；(3)酶切載體以及堿性磷酸酶處理的插入片段通過DNA連接酶連接。在本發明的一個優選實施方式中，所述的載體是pPic9K。在本發明的另一個優選實施方式中，所述的插入片段是米曲霉M16家族金屬蛋白酶基因M036。在本發明的另一個優選實施方式中，上述步驟(1)和步驟O)中的限制性內切酶為相同的酶，優選是EcoRI和NotI的組合。在本發明的另一個優選實施方式中，上述DNA連接酶是T4DNA連接酶。本發明另外一方面還涉及堿性磷酸酶處理的插入片段在促進載體和插入片段連接中的用途。出人意料的，本發明載體和插入片段連接的方法可以顯著提高插入片段和載體的連接效率。
圖 1 第一道為 DNA marker 15000 (tiangen), V V_ap I I_ap 分別代表酶切后處理最終膠回收得到的未處理載體片段，堿性磷酸酶處理的載體片段，未處理的插入片段，堿性磷酸酶處理的插入片段。每孔均加入了5微升對應膠回收片段溶液。從圖中可以看出V 和V-ap的濃度一致，I和I-ap的濃度一致。
具體實施例方式實施例1:實驗材料載體pPic9K，插入片段米曲霉M16金屬蛋白酶家族基因，限制性內切酶EcoRI 和NotI來源于Fermentas公司，堿性磷酸酶購自TAKARA的CIAP，T4 DNA Ligase購自 Fermentas公司，膠回收試劑盒及大腸桿菌Dffia感受態，Taq mix購自Tiangen。實驗步驟1.制備載體片段和插入片段載體3yg pPic9K通過EcoRI和NotI雙酶切后，平分為兩份，一份加入堿性磷酸酶 CIAP buffer及CIAP，一份只加入CIAP buffer，37°C處理1小時，分別回收處理和未處理的載體DNA片段約9000bp，并通過DNA濃度測定和凝膠電泳檢測，保證經堿性磷酸酶處理和未處理的載體片段的濃度被稀釋成相同濃度，分別將處理和未處理載體片段命名為V-ap和 V。插入片段米曲霉M16家族屬蛋白酶基因cDNA約1800bp通過PCR擴增，20μ g PCR 產物直接用EcoRI和NotI雙酶切，產物平分為兩份，分別如載體一樣用CIAP處理和不處理，然后分別膠回收ISOObp目的片段，并保證兩組插入片段的濃度一致，CIAP處理和未處理插入片段分別命名為I_ap和I。2. T4DNA連接酶連接按照相同的比例，構建四組連接V-ap+1-ap ；V-ap+I ；V+I ；V+1-ap連接在PCR儀中進行，16°C連接過夜。3.轉化DH5a感受態，通過克隆數確認連接效率4只100 μ 1大腸桿菌Dffia感受態細胞混合后，按照每管90ul的量分別分裝到冰上的0. 5ml EP管中，然后分別加入4組連接產物，按照冰上30mins，42度熱擊90s，冰上2 分鐘，加入無抗性LB 37度搖床培養1小時后，分別涂布于同批次IOcm amp抗性的固體LB 平板上篩選陽性克隆。通過克隆的多少反映載體與插入片段的連接效率，實驗結果如表1 所示。表1載體與插入片段的連接效率
權利要求
1.載體和插入片段連接的方法，包括如下步驟(1)使用限制性內切酶處理插入片段，然后使用堿性磷酸酶處理酶切片段；(2)使用相應的限制性內切酶處理載體；(3)酶切載體以及堿性磷酸酶處理的插入片段通過DNA連接酶連接。
2.根據權利要求1所述的載體和插入片段連接的方法，所述的載體是PPic9K。
3.根據權利要求1所述的載體和插入片段連接的方法，所述的插入片段是來源于米曲霉蛋白酶M16家族中的金屬蛋白酶基因。
4.根據權利要求1-3任意一項所述的載體和插入片段連接的方法，步驟(1)和步驟 (2)中的限制性內切酶為相同的酶，優選是EcoRI和NotI的組合。
5.根據權利要求4所述的載體和插入片段連接的方法，上述DNA連接酶是T4DNA連接酶。
6.堿性磷酸酶處理的插入片段在促進載體和插入片段連接中的用途。
全文摘要
本發明公開了載體和插入片段連接的方法，包括如下步驟(1)使用限制性內切酶處理插入片段，然后使用堿性磷酸酶處理酶切片段；(2)使用相應的限制性內切酶處理載體；(3)酶切載體以及堿性磷酸酶處理的插入片段通過DNA連接酶連接。通過本發明載體和插入片段連接的方法可以顯著提高插入片段和載體的連接效率。
文檔編號C12N15/66GK102517316SQ20111036041
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月15日 優先權日2011年11月15日
發明者單志, 吳琦, 唐自鐘, 廖 燕, 王德華, 陳惠 , 韓學易 申請人:四川農業大學