一種人源抗鼻咽癌lmp1胞外區抗體及其應用的制作方法

專利名稱：一種人源抗鼻咽癌lmp1胞外區抗體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程領域和免疫靶向診療領域，涉及一種人源抗鼻咽癌LMPl胞外區抗體及其應用。
背景技術：
鼻咽癌是來源于鼻咽上皮的高度惡性腫瘤，腫瘤進展極易侵犯顱底等重要結構， 并較早發生頸部淋巴結轉移和遠處轉移。鼻咽癌表現為種族和地區分布的特點，是我國十大高發惡性腫瘤之一，其發病率為20/100，000，已引發嚴重健康問題。鼻咽癌是由 Epstein-Ban·病毒(EBV)的潛伏感染、環境因素和宿主的基因遺傳因素共同參與的多步驟交互作用而逐步形成的復雜性疾病。所有的鼻咽癌細胞都含有EBV基因組，并表達EBNA1， EBERl, EBER2，和LMP1，LMP2A，LMP2B，這使得這些病毒蛋白成為理想的腫瘤標志物，其中 LMPl (latent membrane proteinl,LMP1)在鼻咽上皮細胞的轉化和癌變過程中的作用倍受關注，是目前公認的病毒癌基因。它以其獨特的蛋白分子結構參與鼻咽癌發生和發展的全過程。目前還沒有一種能夠具有靶向作用的人源抗鼻咽癌LMPl胞外區抗體。

發明內容
本發明目的是提供一種人源抗鼻咽癌LMPl胞外區抗體。本發明另一個目的是提供上述抗體在制備靶向作用于人類鼻咽癌LMPl胞外區的藥物中的應用。本發明還有一個目的是提供能夠靶向作用于人類鼻咽癌LMPl胞外區的藥物。發明人通過建立潛伏膜蛋白I(LMPl)胞外區-GST融合蛋白作為抗原，以噬菌體抗體展示技術，利用細胞與抗原固相篩選相結合的方法進行篩選人源噬菌體抗體庫(Fab抗體庫)。多輪篩選后經噬菌體酶聯免疫吸附反應(phage enzyme linked immunosorbent assay, phage ELISA)進行陽性克隆鑒定。篩選出人源抗LMPl胞外區抗體Fab (命名為 HLEAFab)。原核表達HLEAFab抗體，表達蛋白產物使用ftOtein L親和層析柱純化；純化產物經ELISA、流式細胞技術以及免疫熒光技術進行鑒定。進一步通過體外實驗顯示該抗體與鼻咽癌細胞HNE2-LMP1胞外區特異性結合特性和靶向功能。在此基礎上，靶向鼻咽癌細胞LMPl胞外區人源抗體Fab結合絲裂霉素C制備免疫毒素HLEAFab-絲裂霉素 C(HLEAFab-MMC)。MTT法檢測HLEAFab-MMC對人鼻咽癌細胞系HNE2-LMP1生長的抑制作用； 流式細胞術檢測HLEAFab-MMC對鼻咽癌細胞HNE2-LMP1細胞凋亡和細胞周期的影響。觀察靶向鼻咽癌細胞LMPl胞外區人源抗體Fab-MMC免疫毒素體內抑瘤效應。本發明的目的是通過下列措施實現的一種人源抗鼻咽癌LMPl胞外區抗體，該抗體的輕鏈可變區氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，重鏈可變區氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。所述的抗體，其中編碼其輕鏈可變區氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示，編
3碼其重鏈可變區氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。所述抗體的表達載體，該表達載體為質粒、噬菌粒或噬菌體。所述的抗體在制備靶向作用于人類鼻咽癌LMPl胞外區的藥物中的應用一種藥物組合物，含有上述抗體和抗鼻咽癌藥物。所述的藥物組合物，其中上述抗體與抗鼻咽癌藥物化學偶聯。所述的藥物組合物，其中抗鼻咽癌藥物為絲裂霉素。本發明有益效果本發明利用基因重組技術，以噬菌體抗體展示技術篩選人源抗LMPl胞外區抗體 Fab,并制備靶向作用于鼻咽癌的免疫毒素HLEAFab-絲裂霉素C(HLEAFab-MMC)，為鼻咽癌治療提供了更多的藥物選擇。


圖1. LMPl胞外區融合基因在大腸桿菌系統中的表達。其中M:蛋白標準分子質量；1 :pGEX-4T-2載體誘導純化后的GST蛋白；2 :pGEX_LEDl誘導后的重組菌；3 誘導前的重組菌；4 非重組菌BL21 (DE3)。圖2.噬菌體抗體庫篩選的ELISA檢測結果。圖3.抗LMPl胞外區抗體Fab表達的western blot結果。其中1. ToplO空菌； 2. HLEAFab克隆超聲上清；3. HLEAFab克隆超聲沉淀；4. HLEAFab。圖4.純化的抗LMPl胞外區抗體Fab (HLEAFab) SDS-PAGE結果(純化的36號陽性克隆表達產物)。圖5.純化的HLEAFab與細胞株HNE2-LMP1的結合的細胞ELISA測定結果。圖 6. HLEAFab 與 HNE2-LMP1 細胞結合的 FACS 結果。圖7. HLEAFab與腫瘤細胞株HNE2-LMP1的結合而不與HNE2細胞結合的免疫熒光結果。其中a 腫瘤細胞株HNE2-LMP1經Fab染色；b 普通光學顯微鏡檢視；c 腫瘤細胞株 HNE2經Fab染色；d 圖a與b普通光學顯微鏡檢視。圖8. HLEAFab-MMC與細胞株HNE2-LMP1的結合測定。圖9. HLEAFab-MMC對鼻咽癌HNE2-LMP1細胞生長抑制匪T實驗結果。圖10. HLEAFab-MMC偶聯抗體作用于HNE2/LMP1的細胞周期和凋亡流式細胞儀檢測結果。圖11. HLEAFab-MMC偶聯抗體治療后鼻咽癌荷瘤各組裸鼠腫瘤體積的動態變化結^ ο
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步說明。實施例1人源抗LMPl胞外區抗體!^ab的制備與鑒定一、潛伏膜蛋白1 (LMPl)胞外區抗原的制備與純化1. LMP-I胞外區的基因序列來源于GenBank公布數據，LMP-I三段胞外區 LMP-I[46-50]DffTGG, [98-103]WNLHGQ, [161-166]QQNWff 拼接成 WNLHGQ WNLHGQ QQNWff QQNWff DffTGG WNLHGQ WNLHGQ QQNWff QQNWff DffTGG (SEQ ID NO. 5)基因序列為 5，-GCGGATCCTGG MC CTG CAC GGT CAG TGG MC CTG CAT GGT CM CAG CM AAC TGG TGG CM CM AAC TGG TGG GAC TGG ACC GGT GGC TGG MC CTG CAC GGT CAG TGG AAC CTG CAC GGC CAG CAG CAA AAC TGG TGG CAG CAG AAC TGG TGG GAT TGG ACT GGC GGT TGAGAATTCG-3‘ (SEQ ID NO. 6)；并分別在5’端和3’端設計BamH I和EcoR I的酶切位點(下劃線處)，由南京賽百盛生物公司進行全基因合成，并將LMPl胞外區重組基因(LEDl)克隆到pMDIS-T載體中而構建成質粒PMD18-LMP1 (南京賽百盛生物公司構建，構建的方法為本領域技術人員熟知的技術)。2. GST-LMPl胞外肽段質粒的構建(1).用限制性內切酶BamH I和EcoR I雙酶切質粒pMD18_LMPl，將LMP-1胞外基因片段使用TAKARA公司膠回收試劑盒切膠回收；(2).使用 T4DNA 連接酶聯接到 pGEX-4T-2 表達質粒(GE Healthcare)；(3).氯化鈣法轉入大腸桿菌BL21(DE3)中涂布于LB瓊脂平板(100 μ g/ml氨芐青霉素抗性)上37°C孵育12小時。(4).培養后提取質粒用BamH I和EcoR I對質粒進行雙酶切鑒定。最后通過核酸序列的測定和分析，重組質粒命名為pGEX-LEDl。3. GST-LMPl胞外肽段融合蛋白的表達(1).將含有重組質粒pGEX-LEDl和空載體pGEX_4T_2的BL21菌株接種到含氨芐青霉素(ΙΟΟμ g/L)的LB中，37°C震蕩過夜；(2).次日轉接，37°C培養至菌液吸光度(A)值600約0.6時，加異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)誘導表達蛋白，至 IPTG 終濃度為 lmmol/L， 25 °C 190r/min 震蕩； (3).誘導12小時，以未加IPTG菌液作對照。用12% SDS-PAGE電泳分析GST-LMP1
融合蛋白表達。4. GST-LMPl融合蛋白的純化(1).離心收集表達GST-LMPl膜外肽段融合蛋白菌液。用PBS 45ml重懸細菌，超聲碎菌。4°C收集上清過濾；(2).將含有GST-LMPl膜外肽段融合蛋白的上清經Glutathione Sepharose 4B 親和層析柱(GE Healthcare)，用洗脫液(10mmol/L glutathione, 50mmol/L Tris-HCl, pH 8. 0)洗脫，收集蛋白；(3).經SDS-PAGE分析蛋白表達含量與純度，樣品于_70°C貯存。二、交替固相法與差減法的篩選抗體Fab1.本發明采用基于固相抗原的篩選與基于細胞的篩選，差減篩選法選擇人鼻咽癌細胞HNE2為陰性細胞，大量表達LMPl的鼻咽癌細胞株HNE2-LMP1 (表面表達LMPl分子) 為陽性細胞；固相篩選時GST-LMPl胞外肽段融合蛋白為抗原；人鼻咽癌HNE2和HNE2-LMP1 細胞系購自湖南萬百生物公司。2.基于細胞表面的差減篩選(1)抗體庫滴度測定采用pComb3X載體構建Fab人源噬菌體抗體原庫(Jiao Y， Zhao P, Zhu J, Grabinski T, Feng Z, Guan X, Skinner RS, Gross MD, Hay RV, Tachibana H,Cao B. Construction of human naive Fab library and characterization of anti—metFab fragment generated from the library. Mol Biotechnol. 2005Sep ；31 (1) :41-54.), 多樣性約為2X109，保存于8%甘油中。將_80°C保存的噬菌體抗體原庫于冰上解凍后，取噬菌體上清1 μ 1加入Iml SB培養基(此為a液)，充分混勻。取a液1 μ 1加入Iml SB 培養基(此為b液)，充分混勻。取b液ΙΟΟμΙ加入900μ1 SB培養基(此為c液)，充分混勻。取c液100 μ 1加入900 μ 1 SB培養基(此為d液)，充分混勻。從b、c、d液中各取 1 μ 1稀釋的抗體原庫與50 μ 1對數生長期的XLl-blue (OD600約1. 0)于室溫下混合30min 后鋪板，于第二天通過菌落數測滴度，大腸桿菌XLl-blueGtratagene，LaJolla, CA Cat #200158)，使用前通過抗性(抗氨芐青霉素、抗卡那霉素)檢測與噬菌斑檢測排除污染。公式如下每微升噬菌體數=稀釋倍數X菌落數首輪準備約IO13噬菌體；篩庫加入的體積數按需要的噬菌體數+每微升噬菌體數計算；如噬菌體滴度低，則將幾個不同離心管內的噬菌體混合后加入1/5體積20%的PEG， 15% NaCl沉淀后用Iml 1 %的BSA-PBS溶解；(2)篩庫前一天接種單克隆XLl-blue于含IOml 30 μ g/ml四環素SB培養液的 50ml燒瓶中，37°C，250r/min，過夜，第二天按1 100用含10 μ g/ml四環素的SB培養液轉接，注意OD6tltl不要超過1.0 ；(3)至少準備HNE2細胞(為消除部分非特異性結合抗體的陰性細胞)與 HNE2-LMP1細胞(為細胞表面高表達抗原的陽性細胞，用于結合特異性抗體)各100萬個， 即150cm2的細胞培養瓶70%長滿后1-2瓶；(4)首先移去HNE2細胞培養瓶內的培養基，用10ml pH 7. 4的PBS洗三次，移去 PBS，再向每個培養瓶中移入IOml細胞解離液(購自Invitrogen, Cat :13151-014)，37°C孵育 IOmin ；(5)此時大部分細胞應已經從瓶壁分離，少量仍貼壁者可用細胞鏟將細胞從培養瓶壁中緩慢刮下，收集至一個1. 5ml的聚丙烯離心管內，1800r/minX5min ；(6)仔細吸去上清，再加入Iml pH 7. 4PBS吹打重懸，按前述轉速及時間離心，用 pH 7. 4PBS洗滌三次；(7)最后一次洗滌后移去PBS，用溶于Iml 5% milk (non-fat)-PBS的噬菌體抗體庫重懸HNE2細胞，37°C混合30min ；在此同時按照相同方法準備HNE2-LMP1細胞；(8)離心，1800r/minX5min，然后將上清轉移至HNE2-LMP1細胞(注意不要將 HNE2細胞帶出)，與HNE2-LMP1細胞37°C混合30min ；(9)離心，1800r/min，5min，棄去上清，再用 Iml 0. 1% BSA-PBS 洗滌，共 8 次；(10) 50 μ 1 0. 25 % 胰酶-EDTA (trypsin-EDTA，Invitrogen)重懸細胞沉淀， 370C 20min ；把上液加入 2ml XLl-blue (OD600 約 1. 0)，37°C 30min ；(11)向裝有感染了洗脫噬菌體細菌的離心管中補加事先預熱至37°C的6ml SB 培養液，向其中補充1. 6 μ 1羧芐霉素保存液(羧芐霉素溶于滅菌水配制成100mg/ml保存液，-20°C保存)，吸取2μ 1加入200 μ 1 SB，混勻。取10 μ 1、100 μ 1鋪板，計算洗脫噬菌體產量為第一輪產出(output)；洗脫噬菌體產量=菌落數X稀釋倍數X 103，剩余菌液轉到 50ml 三角瓶中，250r/min，37°C Ih ；(12)補充2. 4μ 1羧芐霉素，相同條件再培養Ih ；
(13)加入 IO13VCSM 13 輔助噬菌體(購自 Stratagene Cat :#0450468)，將整個培養液轉移至含91ml預熱SB培養液的500ml燒瓶中，補充46 μ 1羧芐霉素保存液與184 μ 1 四環素保存液(四環素溶于75%酒精中配成5mg/ml保存液，-20°C保存)，繼續前述條件培
養(14)加入140 μ 1卡那霉素保存液(卡那霉素溶于滅菌水配成50mg/ml保存液，保存于-20°C)，過夜培養；(15)將培養液轉移至500ml離心瓶中，室溫，3，000g, 15min ；(16)上清中加入4g PEG，3g NaCl，搖晃混勻后于冰上靜置Ih ；(17)4°C離心，15，000gX15min ；(18)棄上清，將離心瓶口朝下置于紙上，將剩余的液體清除；(19)用Iml 1% BSA-PBS溶解噬菌體，用前述方法測定滴度，取IO13次級噬菌體抗體庫(基于細胞表面的差減篩選得到最后一輪噬菌體抗體庫)用于下一輪篩選，共篩選5 輪；剩余保存于_80°C。3.固相篩選法方法(1)包被抗原在兩個1. 5ml的離心管中，分別將純化的GST (購自genscript公司 Cat. No. z02039), GST-LMPl融合蛋白(見實施例1中潛伏膜蛋白1 (LMPl)胞外區抗原的制備與純化)溶于400 μ 1 ELISA包被緩沖液(0. 05mol/l碳酸鹽緩沖液ρΗ9· 6 =Na2CO3L 59g NaHC032. 93g蒸餾水1000ml)使終體積達到400 μ 1，GST-LMPl融合蛋白濃度為3 μ g/ml， 每孔中分別加入50 μ 1，每次篩庫每個濃度用8孔，4°C過夜；篩庫前一天及當天按前述方法 (見基于細胞表面的差減篩選( 條)準備細菌；(2)次日，次級抗體庫 250μ 1 與 5% milk (non-fat) 250 μ 1，37°C 30min ；(3)將上液以每孔50 μ 1加入GST包被的ELISA 8孔板中；(4)將包被了 GST-LMPl融合蛋白的八個孔棄去封閉液(5%脫脂牛奶-PBS)，拍干液體后；(5)將GST包被的ELISA八孔板中的Fab抗體庫(次級抗體庫)50 μ 1轉入 GST-LMPl融合蛋白的8個孔中，蓋上塑料膜，37 °C 2h ；(6)甩去噬菌體，0. 5% TWEEN-TBS 洗滌向孔中加滿 0. 5% TWEEN-TBS，用 Iml Tip 頭反復吹打10次，靜置約5min，待氣泡完全消失，甩去孔中洗滌緩沖液，孔頂朝下拍打3次， 反復10次后再用裝于無菌塑料瓶中的洗滌緩沖液沖洗，甩去緩沖液后再拍打3次，反復5 次；(7)向每孔中加入約50 μ 1胰酶-EDTA，37°C 30min,用Tip頭猛烈吹打10次；剩余轉移到2ml當日接種培養的XLl-blue (OD6tltlL 0左右)的12ml聚丙烯培養管中，室溫孵育 20min ；(8)向裝有感染了洗脫噬菌體細菌的離心管中補加事先預熱至37°C的6ml SB培養液，向其中補充1. 6 μ 1羧芐霉素保存液，12 μ 1四環素保存液，于37°C，250r/min, Ih ；同時取2μ1加入200μ1 SB，混勻。取10μ 1、100μ 1于LB-Agar/羧芐霉素培養液(羧芐霉素終濃度為100 μ g/ml)，37°C過夜生長后數單菌落數目，計算產出噬菌體(output)；(9)補充2· 4μ 1羧芐霉素(100mg/ml)，相同條件再培養Ih ；(10)加入IO13VCSM 13輔助噬菌體，將整個培養液轉移至含91ml預熱SB培養液的500ml燒瓶中，補充46 μ 1羧芐霉素保存液與184 μ 1四環素保存液，繼續前述條件培養 2h ；(11)加入140 μ 1卡那霉素保存液，過夜培養；(12)將培養液轉移至250ml離心瓶中，4°C離心，3，000g, 15min ；(13)上清中加入4gPEG，3gNaCl，37°C，250r/min，15min搖晃混勻完全溶解后于冰上靜置Ih ；(14)4°C離心，15，000g，30min ；(15)棄上清，將離心瓶口朝下置于紙上，將剩余的液體清除；(16)用500 μ 1 BSA-TBS溶解噬菌體，用前述方法(見基于細胞表面的差減篩選(1)條)測定滴度，取IX IO12噬菌體次級抗體庫用于下一輪篩選；剩余保存于-80°C。4.噬菌體ELISA挑選陽性克隆(1)本過程需新鮮準備的包被抗原。用ELISA包被緩沖液(同上)分別稀釋純化的GST和GST-LMPl融合蛋白至濃度為3 μ g/ml，每孔中加入50 μ 1，4°C過夜；(2)第二天甩去每板中的包被緩沖液，每孔中加滿ELISA洗滌緩沖液(0. 05% PBST 緩沖液含終濃度為0. 05% Tween-20的PBS溶液)，甩去，于紙上拍打三次洗滌，反復三次；(3)每孔中加新鮮配制的 1 % BSA-PBS, 37°C，1. 5h ；(4)最后一輪產出噬菌體2ml鋪四塊板，37°C孵箱中過夜培養；(5)次日晨用槍頭挑選60個單菌落分別接種于Iml SB培養基(100 μ g/ml氨芐青霉素及葡萄糖)，于12ml聚丙烯培養管中37°C震蕩培養；(6)約8-10h后，0D_達到0. 3，此時向每個培養管中加入IO9VCSM 13輔助噬菌體， 繼續37°C震蕩培養池；(7)每管中加入1.4μ 1 50mg/ml的卡那霉素至終濃度為701^/1111，搖床中371過
夜培養。(8)次日，將每根培養管標號，3，OOOg離心，15min，每管中剩余的噬菌體暫存于 4 0C ；(9)以GST孔做對照組，GST-LMPl融合蛋白孔做實驗組，甩去ELISA板中的封閉牛奶，吸取出50 μ 1過夜培養液上清與50 μ 11 % BSA-PBS混勻，按順序加入分別在對照孔 (GST)和實驗孔(GST-LMP1融合蛋白)中加入同一克隆的噬菌體，留至少兩對孔加入含相同濃度抗生素及葡萄糖的SB培養液(100 μ g/ml氨芐青霉素及葡萄糖)作為空白對照， 37°C，2h ；(10)棄去噬菌體培養液，拍打三次后再用IOml移液管吸取0. 1 % TffEEN-PBS沖洗后再拍打三次，用此方法共洗滌五次；(11)每孔中再加入50μ 1 1 3，000稀釋的HRP標記的羊抗Μ13 二抗，室溫Ih;(12)用(3)中的方法再次洗滌；(13)顯色，每孔中加入100 μ 1顯色底液(TMB與H2A按1 1混合)，20min后加 Λ IM H2SO4停止顯色；(14)于波長450nm讀數記錄。5.陽性克隆的測序(試劑盒購自大連寶生物工程公司，操作方法詳見大連寶生物工程公司 TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 2. 0 說明書)
(1) 2ml隨機挑取轉化菌，12000r/min離心2min，棄上清；(2)加入 250 μ 1 的 Solution I (含 RNase Al)，充分重懸細菌；(3)加入250 μ 1的Solution II，輕輕地上下翻轉混合5_6次，使菌體充分裂解， 形成透明溶液；(4)加入400 μ 1 4°C預冷的Solutionlll，輕輕地上下翻轉混合5_6次，直至形成緊實凝集塊，室溫靜置aiiin;(5) 12000r/min 離心 lOmin，取上清；(6) Spin Column 安置于 Collection Tube，上清置于 Spin Column 中；(7) 12000r/min 離心 lmin，棄濾液；(8)將 500 μ 1 的 Rinse A 加入 Spin Column 中，12000r/min 離心 30s，棄濾液；(9)將 700 μ 1 的 Rinse B 加入 Spin Column 中，12000r/min 離心 30s，棄濾液；(10)重復上一步，然后再12000r/min離心lmin，棄濾液；(11)將Spin Column安置于新的1. 5ml離心管，在Spin Column膜的中央處加入 60 μ 1經60°C預熱的洗脫液，室溫靜置Imin ；(12) 12000r/min 離心 lmin，洗脫 DNA。測序。三、HLEAFab的表達1. Top 10F，購自 Invitrogen (Cat :#C3030_03)，接種于含 30 μ g/ml 四環素的 LB-Agar培養液中，取單菌落于37°C震蕩培養過夜；2.將過夜培養的Top 10F，以1 100接種于含30 μ g/ml四環素的SB培養液中， 37°C震蕩培養至OD 600約為0. 8 ；3.吸取Iyl陽性克隆的噬菌體與50 μ 1對數生長期的Top 10F’混合，于常溫下孵育15mins，然后鋪板生長于含100 μ g/ml氨芐青霉素的LB-Agar，37°C過夜生長；4.次日，挑選單菌落接種于含100 μ g/ml氨芐青霉素，2%葡萄糖的SB培養液中， 37°C震蕩培養過夜；5.用含100 μ g/Ι氨芐青霉素，葡萄糖的SB培養液按1 100轉接過夜生長的細菌，37°C震蕩培養直至OD 600達到1. 0 ；6. 5000r/min，5min，37°C離心，棄上清，用Iml含100 μ g/Ι氨芐青霉素的SB重懸
細菌；7.加入IPTG至終濃度為0. ImM，加入終濃度為4%的蔗糖溶液，于25°C震蕩培養過夜。四、陽性克隆表達的鑒定1.取100 μ 1過夜誘導表達的細菌培養液，離心，10，000g ；2.將上清與細菌沉淀分離，取10μ 1上清與相同體積的SDS 2Χ上樣緩沖液混勻， 100 °C 煮沸 5min ；3.向pH 7. 4PBS加入200mM苯甲基磺酰氟(PMSF)至終濃度為ImM，用200 μ 1重懸細菌沉淀，然后于冰水混合物中超聲處理5min ；4.再離心，10，000gX5mins ；5.取10 μ 1上清與相同體積的SDS樣緩沖液混勻，100°C煮沸5min ；6.上樣，蛋白電泳，90V，大約Ih左右；
7.轉膜，150mA，2h ；8.封閉，5% milk-PBS，將膜完全浸泡于封閉液中，37°C Ih ；9.洗滌三次(洗滌方法為加入PBST(0. 1 % TffEEN-PBS緩沖液)，室溫下于搖床上反復搖晃5min，然后棄去再加入PBST)；然后加入1 3000稀釋的HRP標記的羊抗人 IgG(Fab)，，室溫下于搖床上搖晃Ih ；10.按前述方法再洗滌三次，加入HRP底物沖洗硝纖膜，約4 后曝光。五、陽性克隆表達產物的純化1.取IL過夜誘導表達HLEAFab的細菌培養液，離心細菌培養液， 10，OOOgX 15min ；2.細菌沉淀重懸于1/10細菌培養液體積的含ImM PMSF的pH 7. 4的20mM磷酸緩沖液；3.將重懸的液體分裝于50ml的聚丙烯離心管中，于冰水混合物中超聲處理，約 12min ；4.將超聲后的菌液再次聚集在一起，離心，15，000gX30min ；5.棄沉淀，上清通過0. 22 μ 1濾器過濾；6.準備好AKTA-FPLC(美國GE公司AKTA-purifer蛋白純化系統)與Protein L 親和層析柱(購自genscript公司Cat. No. L00239)，從柱中先后流過2倍柱體積的去離子水及10倍柱床體積的結合緩沖液(Νει2ΗΡ0420πιΜ NaCl 0. 15M，調節pH到7. 0)，平衡protein L-瓊脂糖親和層析柱；7.取待純化樣品上柱，流速為0. 5 lmL/min ；8.然后以同樣的流速依次用20倍柱床體積的結合緩沖液；9.上 5mL 洗脫緩沖液(Citric acid 0. 1M,調節 pH 到 3. 0)，在 AKTA-FPLC 上根據峰值收集洗脫蛋白，并用0. lmol/L Tris堿中和收集的洗脫液至pH7. 0 7. 5 ；10.用BCA法測蛋白質含量，置4°C保存備用。11.純化的HLEAFab用SDS-PAGE鑒定其純度。用0. 12g/mL分離膠、0. 04g/mL濃縮膠，設低分子量標準，恒壓下電泳。考馬斯亮藍R250染色。純化的HLEAFab的活性用上述ELISA法鑒定；12.經旋轉透析管(Centricon, Millipore Corp.，Bellerica, MA)離心換緩沖液溶解于pH 7. 4，PBS中濃縮保存。六、純化的HLEAFab與LMPl胞外區結合能力ELISA1.包被抗原及封閉方法詳見前，分為兩組包被抗原，第一組每孔中GST 600ng、 第二組GST-LMPl融合蛋白每孔600ng包被抗原；2.將純化的 HLEAFab 分別稀釋為 10、5、2. 5、1. 25、0. 625、0. 313、0. 156 μ g/ml，向每孔中加入50 μ 1稀釋的HLEAFab于常溫下孵育Ih ；3.洗滌后加入1 2000稀釋的HRP標記的羊抗人二抗，室溫下Ih ；4.洗滌后加入底物顯色30min于加入IM硫酸中止顯色，于波長450處讀數。七、HLEAFab細胞 ELISA 檢測1.用胰蛋白酶消化細胞培養瓶中的細胞；收集細胞并計數；離心，1500r/min， IOmin ；
2.用1640培養液重懸細胞調整濃度4X IO5個細胞/ml，分成三組，第一組鼻咽癌細胞株HNE2-LMP1細胞，第二組對照組肝癌細株7721細胞，第三組鼻咽癌細胞株HNE2 ；3.滴加到96孔培養板中，100 μ 1/孔；37°C環境孵育過夜；4.用PBS洗板兩次；5.每孔加125 μ 1 10%福爾馬林緩沖液；于室溫環境下固定15min ；6.用雙蒸水洗滌三次；晾干；貯存于2_8°C ；7.用雙蒸水洗滌ELISA板兩次；8.每孔加 250 μ 1 含 2% BSA 的 PBS ；37°C孵育 Ih ；9.雙蒸水洗板三次；10.每孔加50 μ 1 Fab (依次用含BSA的PBS稀釋至濃度為20、5、1. 25、0. 313、 0. 078,0. 02,0. 005μ g/ml)，37°C孵育 2h ；11. 11、0. PBST 洗板五次；12.每孔加50 μ 1用含BSA的PBS稀釋的HRP酶標抗人IgG(Fab) ；37°C孵育 lh；13. TMB顯色，顯色前按TMB H2O2 = I 1混合，100 μ 1/孔，在室溫下孵育20min ； 加IM硫酸溶液50 μ 1/孔；14.在酶標儀上測0D490波長的值。八、熒光激動的細胞分類(fluorescence-activated cell sorting, FACS)1.分別培養HNE2與HNE2/LMP1細胞至約IO6個；2.用pH 7. 4PBS洗滌三次向每個培養瓶中移入IOml pH 7. 4，PBS后倒出；反復三次；3.向每個培養瓶中分別加入2_3ml細胞解離液(購自Invitrogen，Ca 13151-014)，37°C，IOmin ；4.用細胞刮將細胞刮落，再加入約Iml pH 7. 4PBS，轉入15ml的聚丙烯離心管， 1800r/min 離心，5min ；5.棄去上清，用Iml pH 7. 4PBS重懸細胞，再離心，1800r/min，5min，反復三次；6.用 IOml 1% BSA-PBS 于 4°C封閉 30min ；7.離心，將每種細胞分為兩份，一份用含50 μ g/ml HLEAFab的PBS Iml重懸，另一份用不含HLEAFab的PBS重懸，細胞均置于microtube中，于mixer上4V轉動反應45min ；8. 1800r/min 離心，5min ；棄去上清；9.用 Iml pH 7. 4PBS 重懸細胞，再離心，1800r/min，5min，反復三次;10.用 Iml 1 200 稀釋的 FITC-labeled anti human Fab IgG 重懸每份細胞，于 4°C轉動反應30min，本步驟中就用鋁箔包裹試管避光；11. 1800r/min離心，5min ；棄去上清；再用pH 7. 4PBS洗滌三次；12.將每份細胞用200μ1 pH 7. 4PBS重懸，于流式細胞儀分析光強度，其中未加 HLEAFab反應者作為陰性對照。九、免疫熒光1.將上述兩種細胞分別接種于6孔培養皿中，每種細胞兩孔，每孔約1500細胞，直到約80%長滿，其中每種細胞培養1孔作為實驗觀察組，另1孔僅加入二抗作為陰性對照組；2.吸去培養液，用pH 7. 4PBS洗滌三次，方法為加入PBS后再吸去；3.加入按等體積混合的丙酮與甲醇混合液，室溫下固定20min ；4.吸去固定液(上述按等體積混合的丙酮與甲醇混合液)，再用去離子水洗三次， 洗滌方法為加入去離子水后吸去；5.用新鮮配制的5%脫脂牛奶-PBS在37°C封閉Ih ；6.陰性對照組繼續用封閉液(上述5%脫脂牛奶-PBS)處理，實驗組中加入 20 μ g/ml HLEAFab 抗體，37 °C，Ih ；7.用pH 7.4PBS洗滌，方法同前；8.在無光條件下加入 1 200 稀釋的 FITC-Iabeled goat anti human Fab，室溫 0. 5h ；9.有用前述方法洗滌后于顯微鏡下觀察；FITC激發波長494nm。結果一、LMP-I胞外肽段融合蛋白的表達與純化LMP-I胞外肽段的相對分子質量為6. 2ku,加上^ku相對分子質量的GST，融合蛋白預期的相對分子質量應為32. 2ku。轉化有重組質粒pGEX-4T-2的BL21 (DE3)經IPTG誘導后，在相應區域有濃染蛋白帶一條，與預期大小相吻合，而在^ku處的蛋白帶消失，說明插入的外源基因已成功地在大腸桿菌中表達，并與GST形成了融合蛋白。經SDS-PAGE分析， 含有表達載體的BL21(DE!3)菌株經IPTG誘導，可表達與預期分子量相符蛋白帶(圖1)。二、phage ELISA的陽性克隆挑選我們于第7輪篩庫結束后挑選單克隆噬菌體擴增進行phage ELISA selection，把陽性標準定義為P/N > 2、OD450高于0. 5，結果僅有兩株克隆達到我們預定的陽性克隆的標準，即30號與36號克隆。挑選2個ELISA信號最強的質粒送檢，結果提示2株的基因型符合Fab基因型，且該Fab輕鏈為κ鏈，提示特異性30號和36號克隆從抗體庫中被挑選出來。挑選36號克隆命名為HLEAFab (圖2)。陽性克隆序列的測定表1 :36號克隆的輕鏈可變區(上)及重鏈可變區(下)序列
權利要求
1.一種人源抗鼻咽癌LMPl胞外區抗體，其特征在于該抗體的輕鏈可變區氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，重鏈可變區氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2.根據權利要求1所述的抗體，其特征在于編碼其輕鏈可變區氨基酸的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 3所示，編碼其重鏈可變區氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
3.權利要求1或2所述抗體的表達載體。
4.根據權利要求3所述的表達載體，其特征在于所述表達載體為質粒、噬菌粒、噬菌體。
5.權利要求1或2所述的抗體在制備靶向作用于人類鼻咽癌LMPl胞外區的藥物中的應用。
6.一種藥物組合物，其特征在于該組合物含有權利要求1或2所述抗體和抗鼻咽癌藥物。
7.根據權利要求6所述的藥物組合物，其特征在于權利要求1或2所述抗體與抗鼻咽癌藥物化學偶聯。
8.根據權利要求6所述的藥物組合物，其特征在于抗鼻咽癌藥物為絲裂霉素。
全文摘要
本發明屬于基因工程領域和免疫靶向診療領域，公開了一種人源抗鼻咽癌LMP1胞外區抗體及其應用。該抗體的輕鏈可變區氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重鏈可變區氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，該抗體能與人類鼻咽癌LMP1胞外區結合，可用于制備靶向作用于人類鼻咽癌LMP1胞外區的藥物。
文檔編號C12N15/63GK102516388SQ20111036406
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月17日 優先權日2011年11月17日
發明者馮振卿, 張大為, 朱進, 陳仁杰 申請人:南京醫科大學第二附屬醫院