專利名稱：一種花生四烯酸的微生物發酵方法
技術領域：
本發明涉及一種花生四烯酸的微生物發酵方法。
背景技術：
花生四烯酸(Arachidonic acid)即全順5，8，11，14 二十碳四烯酸，它是一種多價不飽和脂肪酸，也被稱為5，8，11，14-花生酸，簡稱ARA或AA。花生四烯酸是一種重要的人體必需脂肪酸，在體內不能自身合成，必須由食物供給，是人體前列腺素合成的重要前體物質，也是人體中含量最高，分布最廣的一種多不飽和脂肪酸，主要存在于器官肌肉和血液組織中，與磷脂結合成結構脂類起著重要作用。花生四烯酸在調節心臟興奮性、參與神經內分泌、促進細胞分裂、抑制血小板凝集、抗炎癥、抗癌、 抗脂質氧化、促進腦組織發育和保護視力等方面具有獨特的生物活性，被廣泛應用于食品、 化妝品、飼料及其添加劑、嬰兒配方奶粉、生物制藥等領域。花生四烯酸廣泛存在于動物體中，主要來源于動物的腎上腺、肝臟以及沙丁魚、雞蛋黃等，但含量較低，一般低于0. 2%(wt/
Wt) O因人體內的花生四烯酸主要靠從外界攝取，所以加強對花生四烯酸的研究與開發具有十分重要的作用。目前人們主要利用微生物發酵法獲得花生四烯酸，而種子的擴大培養是發酵生產的關鍵步驟，母種質量的優劣對生產質量和產量起著至關重要的作用，但現有技術中生產花生四烯酸油脂的大多數母種都是采用液體發酵培養法，獲得的產品中仍然存在著油脂中花生四烯酸含量偏低、微生物生長周期長、培養工藝未達到最優化或發酵所采用的培養基成本高等問題，限制了花生四烯酸的大規模工業化生產。
發明內容
本發明的目的，是要提供一種花生四烯酸的微生物發酵方法，它摒棄傳統的液體發酵培養方法，采用固料培養花生四烯酸母種，所獲菌種細胞的生長活力強、同步性較好、 生理狀態穩定，移種至發酵罐后能迅速生長，縮短延遲期，并能保持穩定的產品收得率。本發明是這樣實現的，所述一種花生四烯酸的微生物發酵方法，其步驟如下 (1)產花生四烯酸普通被孢霉發酵固料種子培養
(i )菌種活化采用斜面菌種活化，試管斜面培養基為PDA固體培養基，將產花生四烯酸的普通被孢霉菌種接于PDA斜面，M 26°C培養2 3天。( ii )固料種子培養基的制備
固料培養基，包含液體組分與固料組分，其中液體組分包括葡萄糖7 10 g/L，酵母粉 0. 5 1 g/L，蛋白胨 Γ5 g/L,NaNO3 0. 3 1. 0 g/L,KH2PO4 0. Γ . 0 g/L，維生素B1 1 3 μ g/L， 維生素 K Γ3 μ g/L,維生素 A 1. 5 2· 0 μ g/L, CuSO2 · 5Η20 0. 6 1· 5 μ g/L, MnSO4 0. 5 1· 5 μ g/L, ZnSO4 · 7Η20 1. 2 1. 8 μ g/L, NaBr 0. 44 0. 66 μ g/L, pH 6. 0 6. 4 之間；固料組分選擇麩皮、大米、小米中的一種或幾種，并與液體組分按10 7比例混合，8(T10(TC蒸煮2(Γ30 min，晾干至散開不結團，按200g/瓶分裝進規格為IOOOmL的K氏瓶中，121 °C滅菌30min。
(iii)固料種子的培養將新鮮斜面菌種加15 25mL無菌水洗下孢子，制成孢子懸液，倒入已滅菌固料培養基，輕搖使其盡量混勻，并于M 26°C培養2 3天，分別于1 和 24h各搖勻一次，作為一級發酵的母種。(2)發酵培養
(i)發酵培養基組分包括葡萄糖2(T25 g/L，酵母粉1(T15 g/L，蛋白胨5 10 g/L， 氯化鈉 10 15 g/L，硫酸銨 5 8 g/L, KH2PO4 3 6 g/L, CuSO2 · 5H20 1. 2 1· 8 μ g/L, MnSO4 1. 6 3· 2 μ g/L, ZnSO4 · 7Η20 2. 4 3· 5 μ g/L, KNO3 0. 66 1· 5 μ g/L, NaBr 0. 88 1· 5 μ g/ L, pH 5. 8 6. 0，121°C滅菌 30min。(ii)搖瓶發酵培養，即小樣發酵培養
以200 300ml無菌水洗下上述固料種子表面的孢子，制成孢子懸液，按體積百分比為 5 10%接種量接入搖瓶發酵培養基，培養溫度為^T30°C，搖床轉速15(T200r/min，培養；Γ5 天；發酵結束后收集濕菌體，烘干后提取干菌體中的油脂進行氣相色譜檢測，檢測花生四烯酸收得率。(iii)發酵罐發酵培養，即中樣發酵培養
以200 300ml無菌水洗下上述固料種子表面的孢子，制成孢子懸液，按體積百分比為 5 10%接種量接入一級發酵罐，發酵溫度為^T30°C，培養1. 5^2. 5天；一級發酵至二級發酵的接種量體積百分比為1(Γ20%，發酵溫度前期控制在^T30°C，促進菌體生長，后期為促進花生四烯酸油脂合成，將溫度下調至1纊20°C，培養周期為3、. 5天；為保證菌體生長和合成油脂的需要，整個發酵過程除自動流加經118°C滅菌25min的重量百分比為40%葡萄糖溶液，以及重量百分比為28%氨水用于控制還原糖在前40h為6 8g/L、40h之后為3 8g/L以及pH為5. 8 6. 0外，另外進行2次手動補加輔料，補加輔料時間分別為發酵3 和69h，輔料分別由葡萄糖、大豆餅粉、玉米漿粉、橄欖油、磷酸氫二鉀及各類微量元素組成， 微量元素可以是維生素B1、維生素化、維生素 、維生素B12、煙酸、煙酸胺、泛酸鈣、葉酸、生物素、葉綠素中的一種或幾種的組合；發酵結束后收集濕菌體，烘干后提取干菌體中的油脂進行氣相色譜檢測，檢測花生四烯酸收得率。本發明所述輔料含量為葡萄糖10 20 g/L，大豆餅粉8 10 g/L,玉米漿粉15 20 g/L，橄欖油8 10 g/L，磷酸氫二鉀2 4 g/L，維生素&20 30 μ g/L、維生素化2 5 μ g/L、 維生素 6 8 μ g/L、維生素B12廣3 μ g/L、煙酸25 30 μ g/L、煙酸胺15 25 μ g/L、泛酸鈣廣3 μ g/L、葉酸疒10 μ g/L、生物素12 16 48/1、葉綠素3 6 μ g/L ；補加輔料體積按發酵液中控制含還原糖量4g/L及pH5. 8 6. 0為準。本發明的有益效果是，通過固料培養獲得的花生四烯酸母種，菌種細胞的生長活力強、同步性較好、生理狀態穩定；通過對發酵工藝的優化，縮短發酵級數，簡化發酵工藝， 有效降低發酵生產成本，花生四烯酸產量穩定，有較高的收得率。
具體實施例方式本發明所述一種花生四烯酸的微生物發酵方法，由以下實施例作進一步論述。首先進行產花生四烯酸普通被孢霉發酵固料種子培養
(i )菌種活化采用斜面菌種活化，試管斜面培養基為PDA固體培養基，將產花生四烯酸的普通被孢霉菌種接于PDA斜面，M 26°C培養2 3天；(ii)固料種子培養基的制備
固料培養基，包含液體組分與固料組分，其中液體組分包括葡萄糖7 10 g/L，酵母粉 0. 5 1 g/L，蛋白胨 Γ5 g/L,NaNO3 0. 3 1. 0 g/L,KH2PO4 0. Γ . 0 g/L，維生素B1 1 3 μ g/L， 維生素 K Γ3 μ g/L,維生素 A 1. 5 2· 0 μ g/L, CuSO2 · 5Η20 0. 6 1· 5 μ g/L, MnSO4 0. 5 1· 5 μ g/L，ZnSO4 ·7Η20 1. 2 1· 8 μ g/L, NaBr 0. 44 0· 66 μ g/L, pH 6. 0 6· 4 之間；固料組分選擇麩皮、大米、小米中的一種或幾種，并與液體組分按10 7比例混合，8(T10(TC蒸煮2(Γ30 min，晾干至散開不結團，按200g/瓶分裝進規格為IOOOmL的K氏瓶中，121 °C滅菌30min ；
(iii)固料種子的培養將新鮮斜面菌種加15 25mL無菌水洗下孢子，制成孢子懸液，倒入已滅菌固料培養基，輕搖使其盡量混勻，并于M 26°C培養2 3天，分別于1 和24h各搖勻一次，作為一級發酵的母種。以下是不同體積的發酵罐培養花生四烯酸的情況分析。(一)花生四烯酸固料種100L罐發酵培養
新鮮斜面一固料種一30L種子罐一100L發酵罐一GC檢測發酵水平。具體過程如下 新鮮斜面與固料種子的培養同上；以200 300ml無菌水洗下上述固料種子表面的孢子，制成孢子懸液，將固料種子孢子懸液按5% (ν/ν)接種量接入30L種子罐，接后體積 15L, 26 30°C，pH5. 8 6. 0，150r/min, 0. 03 0. 05MPa,通氣量 0. 8 1. lm3/h 培養 2 天；將種子液按10% (ν/ν)接種量壓入100L發酵罐中，接后體積60LJ6 30°C，pH5.8 6.0，150r/min， 0. 03 0. 05MPa,通氣量1. 8 2. 8m3/h培養2天，后2. 5天發酵溫度調為18 20°C。在發酵40h 后每他取樣檢測花生四烯酸含量。整個發酵過程除自動流加40% (w/v)葡萄糖溶液(118°C滅菌25min)和觀％ (w/ ν)氨水控制還原糖在前40h為6 8g/L、40h之后為3 8g/L以及pH為5. 8 6. 0夕卜， 另外進行2次手動補料，補料時間分別為發酵3 和69h，輔料分別由葡萄糖、大豆餅粉、玉米漿粉、橄欖油、磷酸氫二鉀及各類微量元素組成，微量元素可以是維生素B1、維生素化、維生素B6、維生素B12、煙酸、煙酸胺、泛酸鈣、葉酸、生物素、葉綠素中的一種或幾種的組合。其中輔料含量為葡萄糖10 20 g/L，大豆餅粉8 10 g/L,玉米漿粉15 20 g/L，橄欖油8 10 g/L，磷酸氫二鉀2 4 g/L，維生素&20 30 μ g/L、維生素化2 5 μ g/L、維生素 6 8 μ g/ L、維生素B12廣3 μ g/L、煙酸25 30 μ g/L、煙酸胺15 25 μ g/L、泛酸鈣廣3 μ g/L、葉酸 7 10 μ g/L、生物素12 16 μ g/L、葉綠素3飛μ g/L。補料體積按發酵液中控制含還原糖量4g/L，pH5. 8 6. 0為準。發酵結束后收集濕菌體，烘干后提取干菌體中的油脂進行氣相色譜檢測。其檢測結果是，固料種100L發酵培養獲得的干菌體收率為89. 8 g/L，油脂含量 47.8%，花生四烯酸產量為21. 3 g/L。發酵結果體現以下優點①菌種細胞的生長活力強、同步性較好，移種至發酵罐后能迅速生長，延遲期短；②生理狀態穩定，保持穩定的生產能力； ③簡化擴種工藝，縮短發酵周期。(二)花生四烯酸固料種1000L罐發酵培養
新鮮斜面一固料種一100L發酵罐一1000L發酵罐一GC檢測發酵水平。具體過程如
下
(1)菌種、菌種活化、固料種子孢子懸液的制備同上。(2) 二級種子罐(100L):將制備好的固料種子孢子懸液按5% (ν/ν)接種量接入二級種子罐，接后體積 60LJ6 30°C，pH5. 8 6. 0，150r/min,0. 03 0. 05MPa，通氣量 1. 8 2. 8m3/h的條件下培養2天；
(3)三級發酵罐(1000L)將種子液按10% (ν/ν)接種量壓入1000L三級發酵罐中，接后體積 600LJ6 30°C，pH5. 8 6. 0，150r/min，0. 02 0. 05MPa，通氣量 18 28m3/h 培養 2 天，后 2. 5天發酵溫度調為1纊20°C。發酵過程流加葡萄糖溶液、氨水，使還原糖、pH值等指標控制在一定范圍內，培養4. 5天放罐。整個發酵過程除自動流加40% (w/v)葡萄糖溶液(118°C滅菌25min)和觀％ (w/ ν)氨水控制還原糖在前40h為6 8g/L、40h之后為3 8g/L以及pH為5. 8 6. 0夕卜， 另外進行2次手動補加輔料，補加輔料時間分別為發酵3 和69h，輔料分別由葡萄糖、大豆餅粉、玉米漿粉、橄欖油、磷酸氫二鉀及各類微量元素組成，微量元素可以是維生素A、維生素化、維生素 、維生素B12、煙酸、煙酸胺、泛酸鈣、葉酸、生物素、葉綠素中的一種或幾種的組合。其中輔料含量為葡萄糖10 20 g/L，大豆餅粉8 10 g/L,玉米漿粉15 20 g/L， 橄欖油8 10 g/L，磷酸氫二鉀2 4 g/L，維生素B1 20 30 yg/L、維生素化2 5 μ g/L、維生素 6 8 μ g/L、維生素B12廣3 μ g/L、煙酸25 30 μ g/L、煙酸胺15 25 μ g/L、泛酸鈣廣3 μ g/L、葉酸疒10 μ g/L、生物素12 16 48/1、葉綠素3 6 μ g/L。補料體積按發酵液中控制含還原糖量4g/L，pH5. 8 6. 0為準。發酵結束后收集濕菌體，烘干后提取干菌體中的油脂進行氣相色譜檢測。檢測結果顯示，固料種1000L罐花生四烯酸發酵獲得的干菌體收率為90. lg/L，油脂含量48.8%，花生四烯酸產量為23. 1 g/L。發酵結果體現以下優點菌種細胞的生長活力強、同步性較好，移種至發酵罐后能迅速生長，延遲期短；生理狀態穩定，保持穩定的生產能力，產能高；簡化擴種工藝，降低生產成本。本發明固料種與傳統的液體種花生四烯酸搖瓶發酵的比較
(一)固料種搖瓶發酵流程新鮮斜面一固料種一搖瓶發酵一油脂提取一GC檢測發酵水平。具體過程如下
菌種活化將產花生四烯酸的普通被孢霉菌種接于PDA斜面，M 26°C培養2 3天。固料種子的培養同上。將備好的固料種子加入300mL無菌水洗下固料表面的孢子制成孢子懸液，按10% (ν/ν)接種量接入搖瓶發酵培養基，裝液量為500mL搖瓶裝入50mL培養液。培養溫度為 ^T30°C，搖床轉速150r/min，培養72h。發酵結束后收集濕菌體，烘干后提取干菌體中的油脂進行氣相色譜檢測。(二)液體種搖瓶發酵流程新鮮斜面一一級種子活化培養一二級搖瓶發酵一油脂提取一GC檢測發酵水平。具體過程如下
斜面菌種孢子懸液的制備同上；將備好的斜面孢子懸液按1. 5% (ν/ν)接種量接入一級搖瓶種子培養基，26 30°C，150r/min振蕩培養Mh ；將一級搖瓶種子按10% (ν/ν)移種量移接到二級搖瓶發酵培養基，26 30°C，150r/min振蕩培養48h，搖瓶裝液量均為500mL搖瓶裝入50mL培養液。發酵結束后收集濕菌體，烘干后提取干菌體中的油脂進行氣相色譜檢測。固料種與液體種搖瓶發酵結果如表1所示 表權利要求
1.一種花生四烯酸的微生物發酵方法，其步驟如下(1)產花生四烯酸普通被孢霉發酵固料種子培養(i )菌種活化采用斜面菌種活化，試管斜面培養基為PDA固體培養基，將產花生四烯酸的普通被孢霉菌種接于PDA斜面，M 26°C培養2 3天；(ii)固料種子培養基的制備固料培養基，包含液體組分與固料組分，其中液體組分包括葡萄糖7 10 g/L，酵母粉0.5 1 g/L，蛋白胨 Γ5 g/L,NaNO3 0. 3 1. 0 g/L,KH2PO4 0. Γ . 0 g/L，維生素B1 1 3 μ g/L， 維生素 K Γ3 μ g/L,維生素 A 1. 5 2· 0 μ g/L, CuSO2 · 5Η20 0. 6 1· 5 μ g/L, MnSO4 0. 5 1· 5 μ g/L, ZnSO4 · 7Η20 1. 2 1. 8 μ g/L, NaBr 0. 44 0. 66 μ g/L, pH 6. 0 6. 4 之間；固料組分選擇麩皮、大米、小米中的一種或幾種，并與液體組分按10 7比例混合，8(T10(TC蒸煮2(Γ30 min，晾干至散開不結團，按200g/瓶分裝進規格為IOOOmL的K氏瓶中，121 °C滅菌30min ；(iii)固料種子的培養將新鮮斜面菌種加15 25mL無菌水洗下孢子，制成孢子懸液，倒入已滅菌固料培養基，輕搖使其盡量混勻，并于M 26°C培養2 3天，分別于1 和24h各搖勻一次，作為一級發酵的母種；(2)發酵培養(i )發酵培養基組分包括葡萄糖2(T25 g/L，酵母粉1(T15 g/L，蛋白胨5 10 g/L, 氯化鈉 10 15 g/L，硫酸銨 5 8 g/L, KH2PO4 3 6 g/L, CuSO2 · 5H20 1. 2 1· 8 μ g/L, MnSO41.6 3· 2 μ g/L, ZnSO4 · 7Η20 2. 4 3· 5 μ g/L, KNO3 0. 66 1· 5 μ g/L, NaBr 0. 88 1· 5 μ g/ L, pH 5. 8 6. 0，121°C滅菌 30min ；(ii)搖瓶發酵培養，即小樣發酵培養以200 300ml無菌水洗下固料種子表面的孢子制成孢子懸液，按體積百分比為5 10% 接種量接入搖瓶發酵培養基，培養溫度為26 30°C，搖床轉速15(T200r/min，培養3飛天；發酵結束后收集濕菌體，烘干后提取干菌體中的油脂進行氣相色譜檢測，檢測花生四烯酸收得率。
2.一種花生四烯酸的微生物發酵方法，其步驟如下(1)產花生四烯酸普通被孢霉發酵固料種子培養(i )菌種活化采用斜面菌種活化，試管斜面培養基為PDA固體培養基，將產花生四烯酸的普通被孢霉菌種接于PDA斜面，M 26°C培養2 3天；(ii)固料種子培養基的制備固料培養基，包含液體組分與固料組分，其中液體組分包括葡萄糖7 10 g/L，酵母粉 0. 5 1 g/L，蛋白胨 Γ5 g/L,NaNO3 0. 3 1. 0 g/L,KH2PO4 0. Γ . 0 g/L，維生素B1 1 3 μ g/L， 維生素 K Γ3 μ g/L,維生素 A 1. 5 2· 0 μ g/L, CuSO2 · 5Η20 0. 6 1· 5 μ g/L, MnSO4 0. 5 1· 5 μ g/L，ZnSO4 ·7Η20 1. 2 1· 8 μ g/L, NaBr 0. 44 0· 66 μ g/L, pH 6. 0 6· 4 之間；固料組分選擇麩皮、大米、小米中的一種或幾種，并與液體組分按10 7比例混合，8(T10(TC蒸煮2(Γ30 min，晾干至散開不結團，按200g/瓶分裝進規格為IOOOmL的K氏瓶中，121 °C滅菌30min ；(iii)固料種子的培養將新鮮斜面菌種加15 25mL無菌水洗下孢子，制成孢子懸液，倒入已滅菌固料培養基，輕搖使其盡量混勻，并于M 26°C培養2 3天，分別于1 和24h各搖勻一次，作為一級發酵的母種；(2)發酵培養(i)發酵培養基組分包括葡萄糖2(T25 g/L，酵母粉1(T15 g/L，蛋白胨5 10 g/L， 氯化鈉 10 15 g/L，硫酸銨 5 8 g/L, KH2PO4 3 6 g/L, CuSO2 · 5H20 1. 2 1· 8 μ g/L, MnSO4 1. 6 3· 2 μ g/L, ZnSO4 · 7Η20 2. 4 3· 5 μ g/L, KNO3 0. 66 1· 5 μ g/L, NaBr 0. 88 1· 5 μ g/ L, pH 5. 8 6. 0，121°C滅菌 30min ；( )發酵罐發酵培養，即中樣發酵培養以200 300ml無菌水洗下固料種子表面的孢子制成孢子懸液，按體積百分比為5 10% 接種量接入一級發酵罐，發酵溫度為26 30°C，培養1. 5^2. 5天；一級發酵至二級發酵的接種量體積百分比為1(Γ20%，發酵溫度前期控制在^T30°C，促進菌體生長，后期為促進花生四烯酸油脂合成，將溫度下調至1纊20°C，培養周期為3、. 5天；為保證菌體生長和合成油脂的需要，整個發酵過程除自動流加經118°C滅菌25min的重量百分比為40%葡萄糖溶液， 以及重量百分比為28%氨水用于控制還原糖在前40h為6 8g/L、40h之后為3 8g/L以及pH為5. 8 6. 0外，另外進行2次手動補加輔料，補加輔料時間分別為發酵36h和69h， 輔料分別由葡萄糖、大豆餅粉、玉米漿粉、橄欖油、磷酸氫二鉀及各類微量元素組成，微量元素可以是維生素B1、維生素化、維生素 、維生素B12、煙酸、煙酸胺、泛酸鈣、葉酸、生物素、葉綠素中的一種或幾種的組合；發酵結束后收集濕菌體，烘干后提取干菌體中的油脂進行氣相色譜檢測，檢測花生四烯酸收得率。
3.根據權利要求2所述一種花生四烯酸的微生物發酵方法，其特征是所述輔料含量為葡萄糖10 20 g/L，大豆餅粉8 10 g/L,玉米漿粉15 20 g/L，橄欖油8 10 g/L，磷酸氫二鉀2 4 g/L，維生素B1 20 30 yg/L、維生素化2 5 yg/L、維生素 6 8 μ g/L、維生素 B12I 3 μ g/L、煙酸25 30 μ g/L、煙酸胺15 25 μ g/L、泛酸鈣廣3 μ g/L、葉酸疒10 μ g/ L、生物素12 16 μ g/L、葉綠素3飛μ g/L;補加輔料體積按發酵液中控制含還原糖量4g/L 及pH5. 8 6. 0為準。
全文摘要
本發明提供一種花生四烯酸的微生物發酵方法，將產花生四烯酸的普通被孢霉菌種接于PDA斜面；固料培養基包含液體組分與固料組分，固料組分選擇麩皮、大米、小米中的一種或幾種，并與液體組分按107比例混合，80~100℃蒸煮20~30min，晾干至散開不結團；將新鮮的產花生四烯酸普通被孢霉菌種斜面加15~25mL無菌水洗下孢子，制成孢子懸液，均勻接入固料培養基，24~26℃培養2~3天，作為一級發酵的母種；以200～300ml無菌水洗下上述固料種子表面的孢子，制成孢子懸液，按體積百分比為5~10%接種量接入一級發酵罐，同時通過控制發酵前后期的溫度，采用變溫培養，以及在發酵過程另外補加2次輔料，促進菌體生長和油脂合成，有效提高了花生四烯酸發酵水平，縮短周期，降低成本。
文檔編號C12R1/645GK102373244SQ20111038916
公開日2012年3月14日 申請日期2011年11月30日 優先權日2011年11月30日
發明者吳美瓊, 林超, 陳俊煌, 陳金卿 申請人:廈門金達威集團股份有限公司