專利名稱：一種spop基因雜合性缺失的熔解曲線分析檢測試劑盒及其檢測方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫學和生物學檢測領域，具體涉及一種SPOP基因雜合性缺失的熔解曲線分析檢測試劑盒及其檢測方法和應用。
背景技術：
卵巢癌是女性生殖系統的三大惡性腫瘤之一，是死亡率最高的婦科惡性腫瘤，早期無明顯癥狀，易造成患者忽視，70% -80%確診時已屬晚期。卵巢癌中以卵巢上皮性癌最為常見，占80%左右，手術治療效果不理想，術后59%患者2年內復發或其他轉移，五年生存率僅30%左右。目前紫杉醇聯合卡鉬治療卵巢癌有效率為60%左右，可作為卵巢癌術后化療及復發的一線化療方案。但紫杉醇和卡鉬均可出現耐藥，并具有較強的毒副作用。卵巢癌的發生、侵潤和轉移涉及腫瘤轉移促進基因(metastasis promoting genes)和腫瘤轉移抑制基因(metastasis suppressorgennes, MSG)的變化，是一個多因素、多步驟的連續過程。探討卵巢癌浸潤轉移發生的作用機制，就能為卵巢癌的檢測、輔助診斷、個體化治療和預后判斷提供新的靶點、新的指標。但迄今為止，明確的與卵巢癌發生相關的只有BRACl和BRAC2基因突變，然而這部分患者只占到卵巢癌患者的5%左右。因此，為卵巢癌的診治尋找新的分子靶點是卵巢癌研究中的一個重點。SPOP基因位于人染色體17q21的位點，在腫瘤細胞中具有高缺失率及雜合性缺失 (loss of heterozygosity, L0H)現象。LOH的定義為導致與某一特殊基因正常的兩個成對等位基因出現不同的基因組變化；常反映喪失該基因的一個等位基因的部分或全部基因組序列。LOH —般都與腫瘤的抑制基因有關，在兩個等位基因都存在時，會抑制惡性腫瘤的發生。而當一個等位基因明顯異常或缺失時(另一個等位基因已經處于沒有活性的狀態)不再發生抑制惡性狀態，細胞就轉化為癌細胞。近年來，學者在研究42種卵巢癌細胞株SPOP基因雜合性缺失(LOH)時，發現SPOP 基因在卵巢癌來源的細胞株中顯著雜合性缺失(LOH)，如
圖1所示。SPOP基因除了在卵巢癌中出現大量LOH外，在胃腸間質瘤，甲狀腺癌，腎癌，卵巢癌，食道癌等來源的細胞株中也出現大量的L0H。抑癌基因SPOP在卵巢癌中大量出現L0H，而正常卵巢組織中SPOP則不會出現這種LOH現象，因此，SPOP的雜合性缺失可作為卵巢癌的輔助診斷標志。目前，檢測SPOP基因雜合性缺失(LOH)的方法主要是傳統的聚合酶鏈式反應 (PCR)方法、傳統測序、變性高效液相色譜分析(dHPLC)、芯片雜交等方法。傳統PCR方法應用較廣，但因其是通過PCR后的產物電泳，通過判斷條帶的數量和分布來達到區分野生型、 純合缺失、雜合性缺失的目的，其操作繁瑣，易出現假陽性和假陰性；傳統測序的靈敏度為 20%左右，容易出現假陰性；dHPLC操作復雜、花費高，一般不適于臨床檢測；芯片雜交的方法花費較高，一般實驗室沒有此平臺，其應用于臨床檢測尚有許多限制因素。
發明內容
因此，本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種檢測SPOP基因雜合性缺失的方法。本發明的再一個目的是提供一種SPOP基因雜合性缺失的熔解曲線分析檢測試劑
盒本發明的另一個目的是提供一種SPOP基因雜合性缺失的熔解曲線分析檢測試劑盒在卵巢癌檢測過程中的應用。為實現上述目的，本發明采取的技術方案是提供一種SPOP基因雜合性缺失的高分辨率熔解曲線分析檢測試劑盒在卵巢癌檢測中的應用，其特征在于該試劑盒由卵巢癌抑癌基因SPOP高分辨率熔解曲線分析的SPOP 特異引物、DNA 提取試劑(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit)、LC480 HRM master mix、陽性質控DNA、陰性質控DNA組成；其中，高分辨率熔解曲線分析的SPOP特異引物由兩對引物片段組成，其中一對擴增SPOP高頻LOH區的序列，擴增片段長度為120bp ；另一對引物擴增SPOP基因以外兩端的序列，片段長度為lOObp，其序列如下表。
權利要求
1.一種SPOP基因雜合性缺失的高分辨率熔解曲線分析檢測試劑盒在卵巢癌檢測中的應用，其特征在于該試劑盒由卵巢癌抑癌基因SPOP高分辨率熔解曲線分析的SPOP特異引物、LC480 HRM master mix、DNA提取試劑、陽性質控DNA、陰性質控DNA組成；其中，高分辨率熔解曲線分析的SPOP特異引物由兩對引物片段組成，其中一對擴增 SPOP高頻LOH區的序列，擴增片段長度為120bp ；另一對引物擴增SPOP基因以外兩端的序列，片段長度為lOObp，其序列如下表。基
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述試劑組成包括1對SPOP基因擴增引物；1對SPOP基因外兩端擴增引物；LC480 HRM master mix ；DNA提取試劑；陽性質控DNA;陰性質控DNA。
3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述LC480HRM master mix帶有飽和熒光染料，激發波長440-470nm，發射熒光波長470-520nm。
4.根據權利要求1、2或3所述的應用，其特征在于通過檢測SPOP基因的雜合性缺失的情況，輔助臨床診斷卵巢癌。
5.一種SPOP基因雜合性缺失的高分辨率熔解曲線分析檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒由卵巢癌抑癌基因SPOP高分辨率熔解曲線分析的SPOP特異引物、LC480 HRM master mix、DNA提取試劑和陽性質控DNA ；陰性質控DNA組成；其中，高分辨率熔解曲線分析的SPOP特異引物由兩對引物片段組成，其中一對擴增 SPOP高頻LOH區的序列，擴增片段長度為120bp ；另一對引物擴增SPOP基因以外兩端的序列，片段長度為lOObp，其序列如下表。
6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述試劑組成包括1對SPOP基因外兩端擴增引物； LC480 HRM master mix ； DNA提取試劑； 陽性質控DNA; 陰性質控DNA。
7.如權利要求5或6所述的檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于依次按下述步驟進行(1).按照DNA提取試劑即QIAampDNA FFPE Tissue Kit操作說明提取組織DNA.(2).配制總體積為10μ 1的PCR反應體系；(3).反應條件94°C預變性:3min，94°C lmin，59 °C 45S，72 °C lmin，30 個循環，最后 72°C延伸lOmin，在進行高分辨率熔解曲線分析之前，進行變性和復性處理95 °C 30s, 25°C 2min,94°C 30s，24°C 3min，共 2 個循環；(4).PCR反應完成后進行HRM分析，LigtitCycler 480熒光定量PCR儀從60°C開始，以 0. 05°C/s的斜率采集熔解曲線，到90°C結束，用.LightCyCler 480所配分析軟件對采集后的曲線進行分析；(5).檢測曲線對比分析，獲得結果。
8.如權利要求7所述的方法，其中配制總體積為10μ 1的PCR反應體系為LC480 HRM master mix5ul引物Fl0. Iul引物Rl0. Iul引物F20. Iul引物R20. IulDNA5ng補水到IOul依次配制樣品PCR反應體系、陽性質控DNA PCR反應體系、陰性質控DNA PCR反應體系。
全文摘要
本發明提供了一種SPOP基因雜合性缺失的熔解曲線分析檢測試劑盒及其在卵巢癌檢測中的應用，該試劑盒使用了卵巢癌抑癌基因SPOP，包括用于高分辨率熔解曲線分析的SPOP特異引物、DNA提取試劑、LC480 HRM master mix、陽性質控DNA、陰性質控DNA。本發明還涉及試劑盒的制作及檢測方法。
文檔編號C12Q1/68GK102399893SQ20111039844
公開日2012年4月4日 申請日期2011年12月6日 優先權日2011年12月6日
發明者于超, 余秋波, 吳蘭香, 李春莉, 楊竹, 黎剛 申請人:重慶醫科大學