利用高分辨熔解曲線分析技術檢測pah基因突變的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用高分辨熔解曲線分析技術檢測PAH基因突變的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟：采用硅膠吸附法抽提被測者口腔上皮細胞/外周血細胞樣本的基因組DNA，設計PAH基因第3、6、7、11和12外顯子序列為模板的檢測引物，根據高分辨熔解曲線分析技術對PCR擴增后的基因序列進行突變檢測。本發明靈敏度高、特異性好，檢測速度快，可實現對苯丙氨酸羥化酶基因常見突變位點的快速篩查，在PAH基因突變檢測方法方面提供了一個新依據。
【專利說明】利用高分辨熔解曲線分析技術檢測PAH基因突變的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種苯丙氨酸羥化酶基因突變的檢測方法，屬于分子生物學【技術領域】。
【背景技術】
[0002]苯丙氛酸輕化酶(phenylalanine hydroxylase, PAH)基因定位于染色體12q23.2，全長約90kb，包括13個外顯子和12個內含子。外顯子長為1353bp的單鏈，mRNA翻譯成含451個氨基酸的酶單體，單體聚合成有功能的PAH酶。PAH基因突變可導致肝臟苯丙氨酸羥化酶缺乏，苯丙氨酸不能正常轉化為酪氨酸，從而在肝臟中代謝紊亂，導致患兒出現苯丙酮尿癥(phenylketonuria, PKU)。苯丙酮尿癥是一種氨基酸代謝異常的常染色體隱性遺傳病。在歐美地區的發病率為1/10000，在我國是1/16000，雜合子頻率為1/50。
[0003]迄今已經發現PKU有560多種突變，其中60%為錯義突變，致病突變大多位于外顯子或內含子與外顯子的交接區，嚴重影響苯丙氨酸羥化酶基因轉錄和翻譯及蛋白質的異常折疊、聚合，使其加速降解，從而影響苯丙氨酸羥化酶的催化活性。在不同種族和地區人群之間苯丙氨酸羥化酶基因座突變部位及分布具有較大差異。歐洲PKU患者的常見突變位于外顯子12的R408Q (31 %);中國人群PKU患者最常見的突變為R243Q、V399V、Ex6_96A>G、R111X、R413P和Y356X等，集中于PAH基因第3、6、7、11和12外顯子區域，突變發生頻率可達80%。苯丙氨酸羥化酶基因常見突變的研究有利于建立苯丙酮尿癥的基因診斷，以便于實現苯丙酮尿癥的早期診斷和產前診斷。
[0004]目前普遍應用的突變檢測方法為DNA直接測序法，PCR產物直接進行DNA序列分析，可以明確突變位點，但存在費時費力，成本較昂貴，不適用于對大量樣本進行檢測等缺點。
[0005]本發明應用一種全新的 突變掃描和基因分型的遺傳分析方法——高分辨熔解曲線(High resolution melting, HRM)分析技術。其原理是根據DNA序列的長度、GC含量以及堿基互補性差異，應用高分辨率的熔解曲線對樣品進行分析，飽和性熒光染料高濃度占據雙鏈DNA所有堿基對，當雙鏈DNA局部解鏈時，熒光染料釋放，熒光強度的降低精準可靠地反映出DNA分子的解鏈情況。HRM不受突變堿基位點與類型局限，無需序列特異性探針，采用新型飽和染料更易于檢測單堿基突變、小片段插入或缺失。該方法與其他遺傳分型技術相比，操作簡單，具有靈敏度高、特異性好、成本低、快速、高通量檢測等優點，結果準確，且實現了真正的閉管操作。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種簡單易行的苯丙氨酸羥化酶基因突變的檢測方法。
[0007]為了達到上述目的，本發明提供一種利用高分辨熔解曲線分析技術檢測PAH基因突變的方法，其特征在于，具體步驟為:
第一步:采用硅膠吸附法抽提被測者口腔上皮細胞/外周血細胞樣本的基因組DNA，采用電泳凝膠成像法對DNA的濃度和純度作檢測，待測樣本濃度標化到lOng/ul ;正常人樣本DNA為陰性對照。
[0008]第二步:根據PAH基因的保守區域，采用在線軟件Primer 3設計PAH基因第3、6、
7、11和12外顯子HRM引物，確定最佳引物為18-25bp大小，PCR產物長度180_300bp。相關引物信息如下:
PAH基因外顯子3引物序列:
PAH-E3-F 51 -ccctccccattctctcttct-31 PAH-E3-R 5' -gacagtgtggagttacttatgttgc-3'
PAH基因外顯子6引物序列:
PAH-E6-F 5' -gccctgcttgagacacctat-3'
PAH-E6-R 5' -TCTGCAGGAAcTGAGAAACG-3'
PAH基因外顯子7引物序列:
PAH-E7-F 5' -ttcttttcatcccagCTTGC-3'
PAH-E7-R 5' -aaaagatggcgctcattgtg-3'
PAH基因外顯子11引物序列:
PAH-Ell-F 51 -cttttcacttggggcctaca-31 PAH-Ell-R 51 -agtggctcacctttgtcacc-31 PAH基因外顯子12引物序列:
PAH-EI2-F 51 -ccttcactcaagcctgtggt-31 PAH-EI2-R 5' -aaccgagtggcctcgtaag-3'
第三步:每個樣本分別進行5個PCR反應，每個PCR反應的總體系為15ul(包括Type-1tHRM PCR Mix 7.5ul、正向引物溶液0.5ul及反向引物溶液0.5ul，樣本DNA 2ul，滅菌重蒸餾水4.5ul);在Rotor-Gene Q上進行反應，PCR反應條件為92-97°C變性5_15分鐘，92-97°C變性10-30秒，57-65°C退火10-30秒，70-75°C延伸10-30秒，30-50個循環；HRM反應條件:92-97°C變性I分鐘，40°C復性I分鐘，初始熔解溫度60-65°C開始程序升溫熔解至95°C，過程中實時監測熒光信號，30-50次每秒。
[0009]第四步:應用Rotor-Gene Q軟件分析HRM結果,通過標準曲線基于曲線偏移和曲線形狀變化展現不同的基因型。定義已知的正常對照樣本后，軟件會自動調出所有檢測樣本的基因型。
[0010]本發明對PAH基因常見突變區域進行檢測，可實現對PAH基因突變的快速篩查，有利于建立苯丙酮尿癥的早期診斷和產前診斷。
[0011]本發明基于HRM分析技術，無需序列特異性探針，采用新型飽和染料，操作簡單，不僅具有靈敏度高、特異性好、成本低、檢測速度快、高通量等優點，而且分辨率高，全部反應在封閉的反應管中完成，有效避免了交叉污染。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1為本發明實施例PAH-E7 PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖2為本發明實施例樣本正 常對照的測序圖；
圖3為本發明實施例大樣本的HRM標準曲線圖；圖4為本發明實施例大樣本的HRM差異曲線圖。
【具體實施方式】
[0013]以下結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。
[0014]實施例以檢測PAH基因第7外顯子為例
1、采用硅膠吸附法抽提15例被測者口腔上皮細胞基因組DNA，電泳凝膠成像法對DNA的濃度和純度作檢測，待測樣本濃度標化到10ng/ul，電泳膠圖如圖1所示；
正常對照DNA符合以下條件時視為合格:0D值A260/A280在1.8-2.0之間；電泳條帶清晰；測序鑒定PAH基因第7外顯子無突變存在，測序結果如圖2所示。
[0015]2、根據PAH基因的保守區域，采用在線軟件Primer 3設計PAH基因第7外顯子HRM引物，確定引物為20bp大小，PCR產物長度204bp (由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。用無菌水配制濃度為lOumol/L的E7正向引物溶液以及濃度為lOumol/L的E7反向引物溶液；E7正向引物的序列為:5' -ttcttttcatcccagCTTGC-3' , E7反向引物的序列為:5' -aaaagatggcgctcattgtg-3'。
[0016]3、在每一個PCR反應孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul (QIAGEN公司生產，包括2 X HRM PCR Master ]\^1、10\?0?緩沖液、0-801111:;[0114￥36代611 Dye、HotStarTaqDNA聚合酶)和步驟2所得的E7正、反向引物溶液各0.5ul，然后在不同的PCR反應孔中分別加入步驟I得到的檢測樣品及正常對照品各2ul，用滅菌重蒸餾水補足15ul ;在Rotor-Gene Q上進行反應，PCR反應條件為95°C變性10分鐘，95°C變性10秒，57°C退火10秒，72°C延伸10秒，40個循環；HRM反應條件`:95°C變性I分鐘，40°C復性I分鐘，初始熔解溫度65°C開始程序升溫熔解至95°C，過程中實時監測熒光信號，40次每秒。
[0017]4、應用Rotor-Gene Q軟件分析HRM結果，如圖3、4所示，在7例正常人中，未篩查出有突變的基因存在；在8例苯丙酮尿癥患者中，有2例檢測出存在PAH-Exon7突變，檢出率在25%，符合國內研究報道的幾率。
【權利要求】
1.一種利用高分辨熔解曲線分析技術檢測PAH基因突變的方法，其特征在于，具體步驟為: 第一步:采用硅膠吸附法抽提被測者口腔上皮細胞/外周血細胞樣本的基因組DNA，采用電泳凝膠成像法對DNA的濃度和純度作檢測，待測樣本濃度標化到lOng/ul ;正常人樣本DNA為陰性對照； 第二步:根據PAH基因的保守區域，采用在線軟件Primer 3設計PAH基因第3、6、7、11和12外顯子HRM引物，確定最佳引物為18-25bp大小，PCR產物長度180_300bp ； 相關引物信息如下: PAH基因外顯子3引物序列: PAH-E3-F 51 -ccctccccattctctcttct-31 PAH-E3-R 5' -gacagtgtggagttacttatgttgc-3' PAH基因外顯子6引物序列: PAH-E6-F 5' -gccctgcttgagacacctat-3' PAH-E6-R 5' -TCTGCAGGAAcTGAGAAACG-3' PAH基因外顯子7引物序列: PAH-E7-F 5' -ttcttttcatcccagCTTGC-3' PAH-E7-R 5' -aaaagatggcgctcattgtg-3'` PAH基因外顯子11引物序列: PAH-Ell-F 51 -cttttcacttggggcctaca-31 PAH-Ell-R 51 -agtggctcacctttgtcacc-31 PAH基因外顯子12引物序列: PAH-EI2-F 51 -ccttcactcaagcctgtggt-31 PAH-EI2-R 5' -aaccgagtggcctcgtaag-3' 第三步:每個樣本分別進行5個PCR反應，每個PCR反應的總體系為15ul(包括Type-1tHRM PCR Mix 7.5ul、正向引物溶液0.5ul及反向引物溶液0.5ul，樣本DNA 2ul，滅菌重蒸餾水4.5ul);在Rotor-Gene Q上進行反應，PCR反應條件為92-97°C變性5_15分鐘，92-97°C變性10-30秒，57-65°C退火10-30秒，70-75°C延伸10-30秒，30-50個循環；HRM反應條件:92-97°C變性I分鐘，40°C復性I分鐘，初始熔解溫度60-65°C開始程序升溫熔解至95°C，過程中實時監測熒光信號，30-50次每秒； 第四步:應用Rotor-Gene Q軟件分析HRM結果，通過標準曲線基于曲線偏移和曲線形狀變化展現不同的基因型；定義已知的正常對照樣本后，軟件會自動調出所有檢測樣本的基因型。
【文檔編號】C12Q1/68GK103509865SQ201310431132
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月22日 優先權日:2013年9月22日
【發明者】張奕, 傅詠南, 王校, 毛丹丹, 卞雪蓮 申請人:上海中優醫藥高科技有限公司