專利名稱：含哈克尼西棉不育胞質的棉花三系雜交種的分子鑒定方法
含哈克尼西棉不育胞質的棉花三系雜交種的分子鑒定方法技術領域
本發明屬于生物技術領域，涉及含哈克尼西棉不育胞質的棉花三系雜交種后代真實性的分子鑒定方法。
背景技術：
雜種優勢的研究和利用可顯著提高棉花的產量、改進品質、提高抗性。我國育苗移栽地區的絕大部分棉農栽種雜交棉；黃河流域棉區，甚至新疆等直播棉區也正在大力發展雜交棉。目前棉花雜交種子的生產方式主要是人工去雄授粉雜交制種法，棉花生產上種植的雜交種子90%以上都是通過這種方式生產的。然而隨著棉花主要生產區及其周邊地區勞動力成本逐年提高，種子生產成本越來越高，大規模推廣利用難度也愈來愈大。因此，開展三系雜交棉選育和推廣工作就顯得尤為重要。與其它制種方式相比，三系雜交棉具有明顯的優勢:制種程序簡便，成本僅為人工去雄雜交的30-40%，種子純度高，適合大面積制種。因而,三系雜交棉花的大面積推廣,對于提高植棉效益,增加棉農收益,穩定棉花種植面積都具有重要的意義。基于三系雜交種在制種方式特殊性的考慮，為了確保三系雜交種的真實性，如何穩定可靠又快速簡便的鑒定三系雜交種成為本專利的關鍵核心。
DNA是生物的基本遺傳物質，DNA多態性是生物多樣性的本質內容。分子標記直接從分子水平反映出核苷酸序列的任何差異，它不受發育階段、環境因素以及基因是否表達的影響，數量非常豐富，遺傳穩定。分子標記的檢測技術多種多樣，新的方法不斷產生，已有幾十種技術可用于分子標記的篩選，比較常用的有RFLP、RAPD, ISSR、SSR、SCAR、STS、AFLP、CAPS和SNP等，隨著分子標記技術的不斷發展和應用，目前，國內外在植物雜交種鑒定中已經越來越多的應用各種分子標記技術。SSR(simple sequence repeat)也稱為微衛星,是由基因組中1-6個核苷酸組成的基本單位重復多次構成的一段DNA。在所有真核生物基因組中均存在并且含量非常豐富，不僅存在于內含子中，也可以存在于編碼區以及染色體的其它任何區域，具有多態性豐富、穩定性好、位點專一性、共顯性等特點。序列特異擴增區域(Sequencecharacterized amplified regions, SCAR)標記是由 Paran 等于 1993 年提出的一種基于PCR技術的單基因位點多態性遺傳標記，由于使用較長引物和引物序列與模板DNA完全互補，在高嚴謹條件下擴增，結果穩定性好、重復性強。該方法對于目的基因具有很好的輔助選擇效果，已成為分子標記在育種實踐中直接應用的首選方法。發明內容
本發明的目的是解決現有技術中含哈克尼西棉細胞質雄性不育胞質的棉花三系雜交種真實性的田間鑒定檢測方法所需時間長，消耗大、準確性差等的問題，提供一種棉花三系雜交種真實性的分子鑒定方法。
為了實現上述的 目的，本發明首先提供一種用于鑒定含哈克尼西棉不育胞質的棉花三系雜交種的SCAR標記，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
本發明以含哈克尼西棉細胞質雄性不育胞質的棉花不育系和保持系為研究材料，通過對10個線粒體基因的RFLP和Genomewalking的分析，從不育系atpA基因側翼序列中分離到可能與棉花細胞質雄性不育相關的一段約500bp的特異片段(見參考文獻 WuJianyong, Gong Yangcang, Cui Minghui, Qi Tingxiang, Guo Liping, Zhang Jinfaand Xing Chaozhu.Molecular characterization ofcytoplasmic male sterilityconditioned by Gossypium harknessii cytoplasm(CMS-D2)in upland cotton[J].Euhpytica，DO1:10.1007/sl0681-011-0357-6.)，該特異性片段可作為鑒定含哈克尼西棉不育胞質的棉花三系雜交種的SCAR標記。本發明優選了 315bp的特異性片段作為鑒定含哈克尼西棉不育胞質的棉花三系雜交種的SCAR標記(SEQ ID N0.1)，該片段特異性更強。
本發明還提供用于鑒定前述SCAR標記或其特異性片段的引物，優選的引物為:
正向引物5’ -AAGTGGCCGCCCTTGCTCAATTT-3’ (SEQ IDN0.2)；
反向引物5’ -GGTTTGTGTGTGCCCCTGAAGT-3’ (SEQ IDN0.3)。
更進一步，本發明以含恢復基因近等基因系的群體為材料，通過對7256對SSR引物的篩選，從中篩選到得到兩對可以用于檢測恢復系和棉花三系雜交種的SSR引物:
NAU3938 引物對:
正向引物5’ -CCAGTCGGAGATTTCTTCTT-3’ (SEQ IDN0.4)；
反向引物5’ -AGCCCTAACGATCTCTCTCA-3’ (SEQ IDN0.5)。
NAU6466 引物對:
正向引物5，-GCCTCATGTTTGTTTTCTGTT-3，(SEQ IDN0.6)；
反向引物5’ -TCTTGAAACCTTTCGGACTC-3’ (SEQ IDN0.7)。
本發明還提供用于鑒定含哈克尼西棉不育胞質的棉花三系雜交種的SSR標記，其為用SEQ ID N0.4和5所示的引物擴增出的400bp處的特異性條帶和/或SEQ ID N0.6和7所示的引物擴增出的280bp處的特異性條帶。
本發明的另一個目的在于提供用所述的標記或引物在鑒定含哈克尼西棉不育胞質的棉花三系雜交種中的應用。
在本發明一個優選的實施方案中，用鑒定所述SCAR標記或其特異性片段的引物擴增待測棉花樣本的基因組DNA，篩選`出與不育系具有相同特異性條帶的棉花樣本；
2)用所述的SSR引物擴增步驟I)篩選出的具特異性條帶的棉花樣本的基因組DNA，能擴增出與恢復系具有相同特異性條帶的即為含哈克尼西棉不育胞質的棉花三系雜交種。
本發明采用SSR標記和SCAR相結合的方法對含哈克尼西棉細胞質雄性不育胞質的棉花三系材料及其三系雜交種后代進行了分子水平的多態性檢測，結果表明，兩標記鑒定的結果條帶清晰、穩定、可靠，因此該方法非常適用于棉花三系雜交種真實性的室內鑒定，也可用于三系雜交品種鑒定和純度分析。
本發明與現有技術相比，有益效果為:
I)速度快:結合SSR標記和SCAR標記鑒定含哈克尼西棉細胞質雄性不育胞質的棉花三系雜交種的真實性具有重要的作用。棉花三系雜交種制種過程中，如果發生混雜將在雜交后代中產生不育棉株，從而對棉花產量造成重大影響，并嚴重影響棉農受益。而正常的田間鑒定試驗需要測量大量的外部性狀，需要投入大量的時間、人力和物力，且易受環境因素影響，不能準確、真實地反映雜交種的遺傳情況。該發明只需提供雜交種材料的DNA，用SSR和SCAR引物對進行分子標記鑒定，利用相應分子鑒定體系可以很快地鑒定出雜交種的真實性。
2)準確率高:SSR標記和SCAR標記具有簡單、穩定可靠、重復性好等優點，很容易通過PCR快速擴增和瓊脂糖或者聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。本發明結合SSR弓丨物對和SCAR引物對對雜交種進行真實性鑒定，增加了鑒定的可靠性，且分子鑒定不受環境因素的影響，真正從DNA水平上鑒定雜交種的遺傳情況，提高了準確性。
3)實用簡單:本發明鑒定含哈克尼西棉細胞質雄性不育胞質的棉花三系雜交種真實性的整個程序只是幾次機械式的加樣過程，易于操作，具有很好的商業化應用前景。
圖1不育系、恢復系、保持系、3個三系雜交種和2個人工制種雜交種SCAR分析。M:marker, 1-9分別為恢復系親本9708R(配組中棉所83的恢復系)，不育系親本9708A，恢復系親本中恢46，三系雜交組合中棉所83，三系雜交組合CRI 09-1，三系雜交組合CR108-2，人工制種雜交種中棉所47,人工制種雜交種中棉所52和保持系9708B。其中不育系未本9708A和3個三系雜交種組合中棉所83、CRI 09-1, CRI 08_2在以marker為標準的315bp處有特異性條帶。
圖2 1-9分別為恢復系親本9708R，不育系親本9708A，恢復系親本中恢46，三系雜交組合中棉所83，CRI 09-1，CRI 08_2，人工制種雜交種中棉所47，人工制種雜交種中棉所52和保持系9708B。其中兩個恢復系親本9708R、中恢46和3個三系雜交種組合中棉所83、CRI 09-1、CRI 08-2 在以 marker 為標準的 400bp (A,以 NAU3938 引物對(SEQ ID N0.4和5)進行擴增)和280bp (B,以NAU6466引物對(SEQ ID N0.6和7)進行擴增)處有特異性條帶。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
實施例1含哈克尼西棉不育胞質的棉花三系雜交種的分子鑒定方法
1.DNA 提取
含哈克尼西棉不育胞質的不育系親本9708A(配組中棉所83的不育系)、哈克尼西棉不育胞質恢復系親本9708R、中恢46 (CGMCC5166)、保持系9708B(不育系9708A的保持系)、含哈克尼西棉不育胞質的不育系親本及其相應恢復系親本配制的3個三系雜交種組合中棉所83 (審定編號:晉審棉2011003)、CRI 09-1 (不育系ZBA (CGMCC5168)和中恢46配組)>CRI 08-2 (不育系ZBA和中恢80 (CGMCC5167)配組)和2個非三系雜交種(中棉所47 (審定編號:國審棉2004001)、中棉所52 (品種權授權號:CNA20050668.4))材料的種子去殼，粉碎后轉入2ml的離心管中；加入ΙΟΟΟμ IDNA提取液，漩渦混勻后，65°C水浴30min，間隔IOmin左右輕搖下；水浴結束后，加入800 μ I苯酚:氯仿:異戊醇(25: 24: 1)，上下顛倒混勻至不分層(動作輕緩時間充分)，12000rpm離心IOmin ;吸取上清液(約800 μ I)轉移到另一 2ml離心管 中，加入2 μ I RNase酶(10mg/ml),混勻后37°C水浴30min ;取出后加入1000 μ I的苯酚:氯仿:異戊醇(25: 24: I)，上下顛倒混勻至不分層(動作輕緩時間充分)，12000rpm離心IOmin ;用剪口槍頭吸取上清液轉移(約700 μ I)到另一 2ml離心管中，加入0.7倍體積(500 μ I)異丙醇緩慢搖動幾次，靜置30min，絮狀DNA成團析出；用剪口槍頭吸取DNA轉移至盛有70%乙醇的2ml硅化離心管中，浸泡兩次，每次十分鐘，無水乙醇浸泡過夜；倒掉乙醇，倒置管壁晾干后(約30min)，加入200 μ I ddH20,溫室溶解2h，測定濃度后稀釋到25ng/l.! 1，_20°C保存備用。
其中，DNA抽提液:0.05M Tris-Cl, 0.0lM EDTA，2% SDS，I % PVP，0.5 % 山梨醇，0.705M NaCl，調整PH值為8.0，高壓滅菌；使用前加入I % β-巰基乙醇。
2.SCAR 標記
將上述DNA 樣品 I μ I 與 19 μ I PCR 反應液(10 XPCR Buffer2.0 μ 1，IOmM dNTPs0.4 μ l,25mM MgCL2L 6 μ I, IOmM SCAR 引物對各 1.0 μ 1，5U/μ I TaqDNA 聚合酶 0.2 μ 1，ddH2012.8μ I)混合，進行 PCR反應:94°C預變性 3min，94°C變性 30s，59°C退火30s，72°C延伸Imin, 25個循環；72°C延伸10min，4°C保存。
配制1%瓊脂糖凝膠，將10μ I PCR產物加入凝膠點樣孔中，6伏特/厘米的電壓進行穩壓電泳30分鐘；取出凝膠，放入I μ g/ml溴化乙錠(EB)溶液中，染色15分鐘；放入凝膠成像系統，在254nm紫外光下,記錄樣品DNA條帶,結果如圖1所示。不育系親本9708A和3個三系雜交種中棉所83、CRI 09-UCRI 08-2能擴增出315bp的特異條帶，2個恢復系親本、保持系和2個非三系雜交種沒有擴增產物。
3.SSR 標記
SSR:將上述 DNA 樣品 I μ I 與 9μ I PCR 反應液(10XPCR Bufferl.0 μ 1，IOmMdNTPs 0.2 μ l,25mM MgCL20.8 μ I, IOmM SSR 引物對各 0.5 μ 1，2U/μ I TaqDNA 聚合酶0.2 μ 1，ddH20 5.8 μ I)混合，進行 PCR 反應:95°C預變性 2min，94°C變性 30sec，55°C退火45sec，72°C延伸 45sec，30 個循環；72°C延伸 10min，4°C保存。
擴增結束后，在擴增產物中加入2 μ I溴酚藍混勻，加樣與6%的聚丙烯酰胺凝膠中，在IXTBE的電泳緩沖液中電泳檢測，電泳電壓為:220伏，電流:164毫安，時間:50分鐘。電泳結束后采用銀染的方法進行染色，具體步驟如下:固定液(95%乙醇40ml+100%乙酸2ml+358ml蒸餾水)中固定10分鐘；染色液(0.6g硝酸銀+300ml蒸餾水)中染色12分；用蒸懼水快速洗兩遍，在顯色液(6g氫氧化鈉+5ml甲醒+3ml 0.2%硫代硫酸鈉(最后力口)+400ml蒸餾水)中顯色約5分鐘，直`至條帶清晰為止；蒸餾水速洗兩遍，放入終止液(3g碳酸鈉+400ml蒸餾水)中終止反應。結果如圖2所示。2個恢復系親本9708R、中恢46和3個三系雜交種中棉所83、CRI 09-UCRI 08_2分別以NAU3938引物對(SEQ ID N0.4和5)和以NAU6466引物對(SEQ ID N0.6和7)進行擴增，兩對引物分別在400bp (NAU3938)和280bp(NAU6466)位置有特征帶，不育系、保持系和2個非三系雜交種不能擴增得到相應特征帶。
因此，利用SCAR引物對和兩對SSR引物對對含哈克尼西棉細胞質雄性不育胞質的三系親本、三系雜交種和非三系雜交種的鑒定結果表明，含哈克尼西棉細胞質雄性不育胞質的不育系親本、恢復系親本和3個三系雜交種能很好的被SCAR引物對和SSR引物對檢測至丨J，從而確定其為真三系雜交種。
實施例2本發明的分子鑒定方法的應用
利用篩選出的SCAR和SSR引物對含哈克尼西棉不育胞質的3個不育系母本9708A、DBA (ffu Jianyong等，2011，中棉所)、ZBA和3個恢復系父本9708R、中恢46、中恢80配制的9個三系雜交組合進行鑒定，首先利用SCAR引物(SEQ ID N0.2和3)對9個雜交組合進行鑒定，擴增結果表明所有的雜交組合在以marker為標準的315bp處有含哈克尼西棉不育胞質母本的特異性條帶，然后進一步以NAU3938引物對(SEQ ID N0.4和5)和以NAU6466引物對(SEQ ID N0.6和7)對9個雜交組合進行擴增，在以marker為標準的400bp (NAU3938)和280bp (NAU6466)位置處分別能檢測到恢復系父本的特異性條帶。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保 護范圍。
序列表〈110>中國農業科學院棉花研究所<120>含哈克尼西棉不育胞質的棉花三系雜交種的分子鑒定方法〈130〉KHPl1112806.0<160>7<170>PatentIn version 3.3<210> I〈211〉 315〈212> DNA〈213〉含哈克尼西棉不育胞質的棉花〈400〉 Iaagtggccgc ccttgctcaa tttgggtcag accttgatgc tgcgactcag gcattactca 60atagaggtgc aaggcttaca gaagtaccga aacaaccaca atattcacca ctgccaattg 120aaaaacaaat tcccaaaaag aaaaaatgtc cgtcgttccg ctttttagga attttttctt 180ttttcctaaa aatcctcatt ttgttttggg tcctatattc catcaaccat gaccttttcc 240ttgtggcttt ttgcgatgag gacgtggggg gtgtagatgc tacgggtgct tctacttcag 300gggcacacac aaacc315<210> 2〈211〉 23〈212> DNA〈213〉人工序列〈400〉 2aagtggccgc ccttgctcaa ttt23<210> 3<211> 22〈212> DNA<213>人工序列〈400〉 3ggtttgtgtg tgcccctgaa gt22<210>4〈211〉20〈212>DNA〈213〉人 工序列
權利要求
1.用于鑒定含哈克尼西棉不育胞質的棉花三系雜交種的SCAR標記，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1 所示。
2.用于鑒定權利要求1所述的SCAR標記或其特異性片段的引物。
3.根據權利要求2所述的引物，其核苷酸序列如SEQID N0.2和3所示。
4.用于鑒定含哈克尼西棉不育胞質棉花三系雜交種的SSR標記的引物，其為核苷酸序列如SEQ ID N0.4和5所示的引物和/或SEQID N0.6和7所示的引物。
5.用于鑒定含哈克尼西棉不育胞質的棉花三系雜交種的SSR標記，其為用SEQIDN0.4和5所示的弓I物擴增出的400bp處的特異性條帶和/或SEQ ID N0.6和7所示的弓I物擴增出的280bp處的特異性條帶。
6.權利要求1所述的SCAR標記和權利要求5所述的SSR標記在鑒定含哈克尼西棉不育胞質的棉花三系雜交種中的應用。
7.權利要求2或3所述的用于鑒定SCAR標記或其特異性片段的引物和權利要求4所述的SSR標記的引物在鑒定含哈克尼西棉不育胞質的棉花三系雜交種中的應用。
8.一種鑒定含哈克尼西棉不育胞質的棉花三系雜交種的方法，其包括: 1)用權利要求2或3所述的用于鑒定SCAR或其特異性片段的引物擴增待測棉花樣本的基因組DNA，篩選出與不育系具有相同特異性條帶的棉花樣本； 2)用權利要求4所述的SSR標記的引物擴增步驟I)篩選出的具特異性條帶的棉花樣本的基因組DNA，能擴增出與恢復系具有相同特異性條帶的即為含哈克尼西棉不育胞質的棉花三系 雜交種。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，涉及棉花三系雜交種后代真實性的分子鑒定方法。本發明采用SSR標記和SCAR相結合的方法對含哈克尼西棉細胞質雄性不育胞質的棉花三系材料及其三系雜交種后代進行了分子水平的多態性檢測。該方法鑒定速度快、準確率高、操作簡單，非常適用于棉花三系雜交種真實性的室內鑒定。
文檔編號C12N15/11GK103146807SQ20111040510
公開日2013年6月12日 申請日期2011年12月7日 優先權日2011年12月7日
發明者邢朝柱, 吳建勇, 郭立平, 戚庭香 申請人:中國農業科學院棉花研究所