一種動脈血管模擬微流控裝置及其應用的制作方法

專利名稱：一種動脈血管模擬微流控裝置及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種動脈血管模擬微流控裝置及其應用，屬于生物醫藥技術領域。
背景技術：
異常血流動力學因素是導致心腦血管疾病的關鍵危險因子之一，但其作用機理尚不清楚，而傳統研究方法的局限性阻礙了相關研究進展。近年來，血管體外研究模型的建立和應用大大促進了相關研究的進展。血管的血流動力學體外研究模型可以根據它們模擬血液流經血管時產生力學刺激的種類分為三類，即流體剪切力模型、牽張應力模型、流體剪切力和牽張應力共同作用模型。流體剪切力模型主要是采用層流板，液體通過開口于兩側的液體進口和出口對種植在基底的細胞施加流體剪切應力；而牽張應力模型則通過彈性膜或板的形變對粘附在上面的細胞施加機械拉伸刺激。前兩種模型可以探討細胞在單一力學刺激情況下的行為變化，然而，細胞所處的生物體內是一個有著多種力學刺激的復雜環境，一個更接近體內環境的心血管系統體外研究模型必須考慮多種力學刺激對細胞的作用。近年來，人們設計和改進了一些能夠同時施加流體剪切力和牽張應力的裝置(Moore，J.E.，Burki, E., Suciu, A., Zhao, S.Μ., Burnier, Μ., Brunner, H.R.and Meister, J.J.(1994)A Device for Subjecting Vascular Endothelial-Cells to Both Fluid Shear-Stressand Circumferential Cyclic Stretch.Ann Biomed Eng.22,416-422 ；Qiu, Y.C.andTarbell，J.M.(2000)Interaction between wall shear stress and circumferentialstrain affects endothelial cell biochemical production.J Vasc Res.37，147—157 ；Toda，M.，Yamamoto，K.，Shimizu, N.，Obi，S.，Kumagaya, S.，Igarashi，T.，Kamiya，A.andAndo, J.(2008)Differential gene responses in endothelial cells exposed to acombination of shear stress and cyclic stretch.J Biotechnol.133，239-244)，其最基本的原理就是用內壁貼附了內皮細胞的硅橡膠管模擬血管，在管腔內保持一定壓力的情況下通過管腔的擴張給粘附的細胞施加牽張應力，同時通過液體的沖刷給細胞施加剪切應力。但是，上述裝置的缺點也很明顯，即細胞在管壁的粘附不好控制、不能對細胞在力學刺激下的行為進行實時 觀察以及干預等，這些問題也制約著相關研究的進展。近年來，微流控技術的快速發展為許多疾病病理研究模型的建立提供了契機，微流控芯片可以為細胞提供更接近于生理、病理條件下的微環境，可以結合表面化學和軟刻蝕技術對細胞行為進行操控和干預，還可以在細胞群體和單細胞兩種水平對細胞的行為變化進行觀察和分析。Huh等(Huh, D., Matthews, B.D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, Μ., Hsin, H.Y.and Ingber,D.Ε.(2010)Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip.Science.328,1662-1668)采用的微流控裝置可以對貼附在膜上的細胞產生流體剪切力和拉伸力，其用途是模擬和研究肺泡功能，其制作工藝相對比較復雜，由于膜沒有支撐物，容易變形，顯微鏡下不易觀察細胞形態和變化過程。Douville等(Douville, N.J.，Zamankhan, P.，Tung,Y.C.，Li，R.，Vaughan, B.L，Tai，C.F.，White, J.，Christensen，P.J.，Grotberg，J.B.andTakayama,S.(2011)Combination of fluid and solid mechanical stresses contributeto cell death and detachment in a microfluidic alveolar model.Lab Chip.11,609-619)采用的微流控裝置同樣可以提供流體剪切力和機械拉伸力，其用途也是模擬和研究肺泡的結構和功能，可以形成氣液界面，模擬肺泡細胞的微環境。然而，上述的微流控裝置只適合做肺泡模型，微流控血管模型尚無文獻報道。而用于微流控血管生理病理機理的研究模型國內外尚無專利申請。

發明內容
因此，本發明的目的是針對現有的模擬動脈血管生理病理狀態的體外模型有的不能同時提供流體剪切力和機械拉伸力兩種刺激，有的不利于動態觀察和分析，而微流控血管體外模擬裝置目前尚屬空白的不足，設計一種能夠同時提供流體剪切力和機械拉伸力的微流控裝置及其應用，能夠構建某些生理、病理機理研究的體外模型，為相關的研究提供有效工具。針對上述目的，本發明的技術方案如下:一方面，本發明提供一種動脈血管模擬微流控裝置，該裝置包括透明的微流通道模塊和與其相適配的透明的負壓產生模塊，所述微流通道模塊底部和負壓產生模塊頂部通過彈性膜相連接，所述微流通道模塊用于流體流動，所述負壓產生模塊用于產生使彈性膜發生形變的負壓；所述微流通道模塊頂部設有流體入口和流體出口，所述流體入口和流體出口分別通過與流體入口和流體出口相適配的第一 PE管連接于微流通道模塊底部的微流通道，并與其相貫通；所述負壓產生模塊頂部設有負壓凹槽，所述負壓凹槽設于微流通道的下方，從而形成與微流通道相隔離的單獨的空間，所述負壓產生模塊頂部設有一氣路開口，所述氣路開口通過與其相適配的第二 PE管與負壓凹槽相連。優選地，所述負壓凹槽一側還設有與其相貫通的負壓緩沖池，所述第二 PE管通過負壓緩沖池與負壓凹槽 相連。優選地，所述負壓緩沖池通過一凹槽與負壓凹槽相貫通，優選地，所述第二 PE管垂直連接于負壓緩沖池底部。優選地，所述負壓凹槽中間圍繞成一個長方形平臺，與所述彈性膜緊貼并對應于其上方的所述微流通道，所述長方形平臺和彈性膜間填充有液體潤滑劑，用于使在負壓的作用下發生相互移動。優選地，所述長方形平臺長為1.5 X IO4 μ m，寬為1.0 X IO3 μ m所述負壓產生模塊
頂部和底部封合為一體結構。優選地，所述微流通道呈第二長方體結構，其由第三、第四側壁和微流通道底部和微流通道底部構成，所述微流通道底部由彈性膜構成，優選地，所述第二長方體的長為
1.8 X IO4 μ m，寬為 1.5 X IO3 μ m，高為 0.5 X IO3 μ m。優選地，所述微流通道模塊的頂部和底部通過第一、第二側壁連接成水平方向貫通的第一長方體結構，優選地，所述第一長方體的長為2.5-3.0X IO4 μ m,寬
2.0-2.5 X IO3 μ m,高為 3.0-5.0 X IO3 μ m。優選地，所述微流通道模塊、負壓產生模塊和彈性膜均由聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料制成。
優選地，所述流體入口和流體出口均為圓形孔，優選地，所述圓形孔的直徑為8.0X IO2 μ m ;所述第一 PE管垂直連接于所述微流通道模塊底部的微流通道。
優選地，所述負壓產生模塊的頂部呈長方形，該長方形的長為2.5-3.0X IO4 μ m，寬為2.0-2.5 XlO4Um,所述負壓凹槽呈第三長方體結構，其截面為長方形，高為5X IO2 μ m，寬為2.5X IO2 μ m ;所述負壓緩沖池呈垂直于平臺區的圓柱形空腔狀，所述圓柱形空腔的直徑為5.0X IO3 μ m,高為1.0X IO3 μ m ;所述凹槽呈第四長方體結構，其長為3.0 X IO3 μ m，寬為5 X IO2 μ m,高為5 X IO2 μ m ;所述氣路開口為圓形孔氣路開口，優選地，所述圓形孔氣路開口的直徑為8.0 X IO2 μ m。
優選地，所述微流通道模塊和負壓產生模塊長均為2.5-3.0 X IO4 μ m，寬均為 2.0-2.5 X IO4 μ m，厚均為 3.0-5.0 X IO3 μ m ;所述彈性膜為長 2.5-3.0 X IO4 μ m，寬2.0-2.5 X IO4 μ m,厚為 10-100 μ m。
另一方面，本發明提供了一種動脈血管模擬微流控裝置在動脈血管生理病理機制研究或藥物篩選中的應用。
又一方面，本發明提供了一種動脈血管模擬微流控裝置在制備用于生物檢測的試劑盒中的應用，優選地，所述試劑盒為動脈血管生理病理機制研究或藥物篩選的試劑盒。
再一方面，本發明提供一種用于生物檢測的試劑盒，該試劑盒包括根據本發明的動脈血管模擬微流控裝置，還包括檢測試劑和緩沖液，優選地，所述檢測試劑為血管活性小分子、細胞因子、抗體或用于篩選的藥物。
本發明的有益效果為:基于微流控技術，通過合理設計和整合微流通道模塊、彈性膜、負壓產生模塊的微流控裝置，能夠同時提供流體剪切力和機械拉伸力，建立動脈粥樣硬化體外研究模型，為相關研究提供有效工具，體積小，結構簡單，易于制作和使用；光學透明材料制作，易于肉眼或鏡下觀察通道內的情況，可以在顯微鏡和培養箱之間任意轉換，可以實現對細胞在兩種力學刺激下以及化學刺激下的原位動態監測，兩種力學刺激的大小、頻率隨時可調，可以隨時改變細胞的化學微環境。



以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中:
圖1為本發明所述的動脈血管模擬微流控裝置的結構示意圖2為本發明所述的動脈血管模擬微流控系統的結構示意圖3為所述彈性膜放置于本發明所述的動脈血管模擬微流控裝置(只有負壓產生模塊)進行拉伸的實驗結果示意圖，圖中a為拉伸前的彈性膜的結果示意圖，圖中b為拉伸后的彈性膜的實驗結果示意圖4為將大鼠骨髓基質干細胞(MSC)輸入本發明所述的動脈血管模擬微流控裝置后與MSC細胞單獨拉伸和單獨剪切進行對比的實驗結果示意圖，圖中a為MSC細胞單獨拉伸的實驗結果示意圖，b為MSC細胞單獨剪切的實驗結果示意圖，c為MSC細胞在本發明的裝置中經拉伸和剪切后的實驗結果示意其中:
I為微流通道模塊，101為微流通道模塊的頂部，102為微流通道模塊的底部，103為第一側壁，104為第二側壁，105為流體入口，106為流體出口，107為第一 PE管，108為微流通道，1081為微流通道頂部、1082為微流通道底部、1083為第三側壁、1084為第四側壁；2為彈性膜；3為負壓產生模塊，301為負壓產生模塊的底部，302為負壓產生模塊的頂部，303為負壓凹槽，304為氣流開口，303負壓凹槽，305為第二 PE管，306負壓緩沖腔，307為凹槽、308為長方形平臺；4為動脈血管模擬微流控裝置；5為細胞培養驅動系統；6為負壓發生器。
具體實施例方式如圖1所示，本發明所述的動脈血管模擬微流控裝置4，該裝置包括透明的微流通道模塊I和與其相適配的透明的負壓產生模塊3，所述微流通道模塊底部和負壓產生模塊頂部通過彈性膜2經等離子氧化處理共價鍵合，所述微流通道模塊1、負壓產生模塊3和彈性膜2均由聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料制成，所述彈性模2為長2.5-3.0XlO4Um,寬2.0-2.5 X IO4 μ m，厚為10-100 μ m的彈性模2，所述微流通道模塊I用于液體流動，所述負壓產生模塊3用于產生使彈性膜2發生形變的負壓；所述微流通道模塊頂部101和底部102通過第一、第二側壁103、104連接成水平方向貫通的第一長方體結構，所述第一長方體的長為2.5-3.0 X IO4 μ m,寬2.0-2.5 X IO4 μ m,高為3.0-5.0XlO3U m,所述微流通道模塊長為2.5-3.0XlO4Um,寬為2.0-2.5 X IO4 μ m，厚為3.0-5.0 X IO3 μ m，所述微流通道模塊頂部101設有流體入口 105和流體出口 106，所述流體入口 105和流體出口 106分別通過與流體入口 105和流體出口 106相適配的第一 PE管107垂直連接于微流通道模塊底部102的微流通道108，所述微流通道108呈第二長方體結構，其由微流通道頂部、底部1081,1082和第三、第四側壁1083、1084構成，并與其相貫通，所述微流通道底部由彈性膜構成，所述第二長方體的長為1.8 X IO4 μ m,寬為1.5 X IO3 μ m,高為5.0X IO2 μ m,所述流體入口 105和流體出口 106均為圓形孔，所述圓形孔的直徑為8.0 X IO2 μ m;所述負壓產生模塊3的底部301和頂部302封 合而成一體結構，所述負壓產生膜塊為長2.5-3.0X IO4 μ m，寬2.0-2.5 X IO4 μ m，厚為3.0-5.0XlO3Um的PDMS模塊，所述負壓產生模塊頂部302設有負壓凹槽303，所述負壓凹槽303設于微流通道108的下方，從而形成與微流通道108相隔離的單獨的空間，所述負壓產生模塊頂部302設有一個氣流開口 304，所述氣路開口 304通過與其相適配的第二 PE管305與負壓凹槽303相連，所述負壓凹槽303中間圍繞成一長方形平臺308，與所述彈性膜2緊貼并對應于其上方的所述微流通道108，所述長方形平臺308長為1.5Χ104μπι，寬為1.0Χ103μπι，所述長方形平臺308與彈性膜2不鍵合，添加液體潤滑劑，使之在負壓作用下相互之間可以移動；所述負壓凹槽303 —側還設于與其相貫通的負壓緩沖池306，所述第二 PE管305通過負壓緩沖池306與負壓凹槽303相連，所述負壓緩沖池306通過一凹槽307與負壓凹槽303相貫通，所述第二 PE管305垂直連接于負壓緩沖池306底部，，所述負壓產生模塊的頂部302呈長方形，該長方形的長為
2.5-3.0XlO4 μ m，寬為2.0-2.5 X IO4 μ m,所述負壓凹槽303呈第三長方體結構，其截面為長方形，高為5.0X IO2 μ m,寬為2.5 X IO2 μ m ;所述負壓緩沖池306呈垂直于底部301的圓柱形空腔狀，所述圓柱形空腔的直徑為5.0 X IO3 μ m，高為1.0 X IO3 μ m ;所述凹槽307呈第四長方體結構，其長為3.0Χ103μπι，寬為5.0Χ102μπι，高為5.0 X IO2 μ m ;所述氣路開口304為圓形孔氣路開口，所述圓形孔氣路開口 304的直徑為8.0 X IO2 μ m。
如圖2所示，本發明所述的動脈血管模擬微流控的系統，包括上述所述的動脈血管模擬微流控裝置4，還包括細胞培養驅動系統5和負壓發生器6，所述細胞培養驅動系統5通過流體入口 105和流體出口 106與微流通道108連接，所述細胞培養驅動系統5驅動微流通道108內的液體流動；所述負壓發生器6通過第二 PE管305連接至氣流開口 304與負壓發生模塊連接，用于使負壓發生模塊產生負壓。
使用時，首先通過微流通道模塊I的流體入口 105將細胞懸液加入微流通道108，在37°C，5%二氧化碳條件下，使細胞貼壁于微流通道108底部的彈性膜2上，然后，將微流通道108的流體入口 105和流體出口 106與細胞培養基驅動系統5連接；再將負壓產生模塊3的氣路開口 304通過第二 PE管和負壓發生器6連接，然后，開動細胞培養基驅動系統5，細胞培養基驅動系統5可以驅動微流通道108內的液體流動，從而對微流通道108內基底上附著的細胞產生流體剪切力，而負壓發生器6產生的負壓可以通過第二 PE管305傳導入負壓產生模塊3內的負壓凹槽303內，使負壓凹槽303上方的彈性膜2發生形變，從而拉動貼于長方形平臺的彈性膜2，使之發生水平方向的形變，從而使貼附在上面的細胞受到機械拉伸力。由于彈性膜2在平行于通道長軸方向上的形變非常小，可以忽略不計，施加在彈性膜2以及彈性膜上細胞的力主要是垂直于通道長軸方向的，因此，細胞的受力情況為:平行于通道方向的流體剪切力和垂直于通道方向的機械拉伸力。
具體試駘實施例
試駘實施例1
將彈性膜(PDMS膜)(其上面印有熒光標記的蛋白陣列)放置于本發明所述的動脈血管模擬微流控裝置進行拉伸，結果如圖3所示，經負壓拉伸后彈性膜，與拉伸前的彈性膜相比，拉伸率達25%，其拉伸率和均勻性能夠達到預期效果，完全可以滿足模擬體內試驗的需要。
試駘實施例2
將MSC細胞(大鼠骨髓基質干細胞，取自SD大鼠(購自北京維通利華實驗動物公司)，提取方法參考以下文獻進行:Bosnakovski D, Mizuno M, Kim G, Takagi S, OkumuraM， Fujinaga T.1solation and multilineage differentiation of bovine bone marrowmesenchymal stem cells.Cell Tissue Res2005 ;319:243-53.)輸入本發明所述的動脈血管模擬微流控裝置，與MSC細胞單獨拉伸和單獨剪切的結果相比，如圖4所示，從該圖可以看出單獨拉伸可以使細胞的骨架沿拉伸力平行方 向排列，而單獨流體剪切力可以使細胞骨架沿剪切力方向排列；拉伸力和流體剪切力的合力則可使細胞骨架的排列呈現與合力方向相同的趨勢。因此，流體剪切力和拉伸力對血管內細胞的排列有重要影響，從而說明本發明的動脈血管模擬微流控裝置為相關研究的有力工具。
權利要求
1.一種動脈血管模擬微流控裝置，該裝置包括透明的微流通道模塊和與其相適配的透明的負壓產生模塊，所述微流通道模塊底部和負壓產生模塊頂部通過彈性膜相連接，所述微流通道模塊用于流體流動，所述負壓產生模塊用于產生使彈性膜發生形變的負壓； 所述微流通道模塊頂部設有流體出口和流體入口，所述流體出口和流體入口分別通過與流體入口和流體出口相適配的第一 PE管連接于微流通道模塊底部的微流通道，并與其相貫通； 所述負壓產生模塊頂部設有負壓凹槽，所述負壓凹槽設于微流通道下方，所述負壓產生模塊頂部設有一氣路開口，所述氣路開口通過與其相適配的第二 PE管與負壓凹槽相連。
2.根據權利要求1所述的動脈血管模擬微流控裝置，其特征在于，所述負壓凹槽一側還設有與其相貫通的負壓緩沖池，所述第二 PE管通過負壓緩沖池與負壓凹槽相連。
3.根據權利要求2所述的動脈血管模擬微流控裝置，其特征在于，所述負壓緩沖池通過一凹槽與負壓凹槽相貫通，優選地，所述第二 PE管垂直連接于負壓緩沖池底部。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的動脈血管模擬微流控裝置，其特征在于，所述負壓凹槽中間圍繞成一長方形平臺，與所述彈性膜緊貼并對應于其上方的所述微流通道，所述長方形平臺和彈性膜間填充有液體潤滑劑，優選地，所述負壓產生模塊的底部和頂部封合而成一體結構，所述長方形平臺長為1.5X 104 μ m，寬為1.0X 103 μ m。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的動脈血管模擬微流控裝置，其特征在于，所述微流通道呈第二長方體結構，其由第三、第四側壁和微流通道底部構成，所述微流通道底部由彈性膜構成，優選地，所述第二長方體的長為1.8 X 104 μ m,寬為1.5 X 103 μ m,高為0.5 X 103 μ m。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的動脈血管模擬微流控裝置，其特征在于，所述微流通道模塊的頂部和底部通過第一、第二側壁連接成水平方向貫通的第一長方體結構，優選地，所述第一長方體的長為2.5-3.0XlO4Um,寬2.0-2.5X IO4Um,高為3.0-5.0 X 103 μ m。
7.根據權利要求1至6中任一項所述的動脈血管模擬微流控裝置，其特征在于，所述微流通道模塊、負壓產生模塊和彈性膜均由聚二甲基硅氧烷材料制成。
8.根據權利要求1至7中任一項所述的動脈血管模擬微流控裝置，其特征在于，所述流體出口和流體入口均為圓形孔，優選地，所述圓形孔的直徑為8.0X IO2 μ m ;所述第一 PE管垂直連接于所述微流通道模塊底部。
9.根據權利要求1至8中任一項所述的動脈血管模擬微流控裝置，其特征在于，所述負壓產生模塊的頂部呈長方形，該長方形的長為2.5-3.0 X 104 μ m，寬為2.0-2.5 X 104 μ m,所述負壓凹槽呈第三長方體結構，其截面為長方形，高為5.0X 102 μ m，寬為2.5X IO2 μ m ;所述負壓緩沖池呈垂直于平臺區的圓柱形空腔狀，所述圓柱形空腔的直徑為5.0Χ103μπι，高為1.0 X 103 μ m ;所述凹槽呈第四長方體結構,其長為3.0 X 103 μ m,寬為5.0 X 102 μ m,高為5.0 X 102 μ m ;所述氣路開口為圓形孔，優選地，所述圓形孔的直徑為8.0 X 102 μ m。
10.根據權利要求1至9中任一項所述的動脈血管模擬微流控裝置，其特征在于，所述微流通道膜塊和負壓產生膜塊長均為2.5-3.0 X IO4 μ m，寬均為2.0-2.5 X 104 μ m，厚均為 3.0-5.0Χ103μπι ;所述彈性膜的為長 2.5-3.0XlO4Um,寬 2.0-2.5Χ104μπι，厚為10-100 μ m
11.根據權利要求1至10中任一項所述的動脈血管模擬微流控裝置在動脈血管生理病理機制研究、藥物篩選或在制備用于生物檢測的試劑盒中的應用，優選地，所述試劑盒為動脈血管生理病理機制研究或藥物篩選的試劑盒。
12.一種用于生物檢測的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1至10中任一項所述的動脈血管模擬微流控裝置，還包括檢測試劑和緩沖液，優選地，所述檢測試劑為血管活性小分子、細胞 因子、抗體或用于篩選的藥物。
全文摘要
本發明提供一種動脈血管模擬微流控裝置及其應用，所述裝置包括透明的微流通道模塊和與其相適配透明的負壓產生模塊，所述微流通道模塊底部和負壓產生模塊頂部均由彈性膜構成，所述微流通道模塊底部與所述負壓模塊頂部相鍵合，所述微流通道模塊用于流體流動，所述負壓產生模塊用于產生負壓；及其在動脈血管生理病理機制研究、藥物篩選或制備用于生物檢測的試劑盒中的應用。本發明基于微流控技術，通過合理設計和整合微流通道模塊、彈性膜、負壓產生模塊的微流控裝置，能夠同時提供流體剪切力和機械拉伸力，建立動脈粥樣硬化體外研究模型，為相關研究提供有效工具，易于制作使用和觀察，實現對細胞在兩種力學刺激下以及化學刺激下的原位動態監測。
文檔編號C12M1/34GK103146573SQ20111040450
公開日2013年6月12日 申請日期2011年12月7日 優先權日2011年12月7日
發明者蔣興宇, 鄭文富, 張偉, 王棟, 姜博 申請人:國家納米科學中心