專利名稱：一種細胞信號通路抑制劑誘導豬脂肪細胞形成的方法
技術領域：
本發明公開一種細胞信號通路抑制劑誘導豬脂肪細胞形成的方法，將豬胚胎成纖維細胞轉化脂肪細胞，屬于細胞誘導技術領域。
背景技術：
由于臨床治療的需要，人們需要特殊分化的細胞來治療疾病，所以干細胞誘導及分化技術逐漸成熟，但隨之發現，一些細胞能夠不通過干細胞狀態直接分化成另一種類型的分化細胞，所報道的方法都是以轉基因的手段來實現的，直接將終末分化的細胞轉化為其他類型的功能細胞如將胚胎成纖維細胞、成軟骨細胞和視網膜上皮細胞轉變為具收縮特性的肌細胞；將B淋巴細胞轉變為巨噬細胞；將胰島外分泌細胞轉化為β胰島細胞樣細胞；將小鼠成纖維細胞轉化為功能性的神經細胞；將小鼠心肌內成纖維細胞重新編程為心肌細胞來修復受損的心臟。由于誘導細胞編程都是以轉基因為主，其轉基因后導致的外源基因插入突變對生物安全性有嚴重的影響，并且該方法獲得的細胞在疾病治療或者器官移植中都是不可用的，這就導致了目前的方法只適用于研究而不適用于臨床治療。目前，對脂肪細胞分化及調控方面的研究主要使用體外分化系統。現在已經建立起來的最有代表性的兩個前脂肪細胞系是Green和Kehinde從17 — 19天小鼠胚胎的中胚層多能干細胞中分離并誘導分化出來的，即3T3-F442A和3T3-L1小鼠前脂肪細胞系，當用適當的誘導劑進行誘導刺激時，約經過一周左右的時間就可分化成為充滿著脂肪滴的脂肪細胞。如利用該方法得到脂肪細胞，就必須預先分離得到前脂肪祖細胞，這就使得獲得脂肪細胞的難度大大增加，并且前脂肪細胞在動物體內含量較少且不易分離純化，所以人們通常使用前脂肪細胞系由于研究，但其作為一種成系細胞，具有一定的致瘤性，并不適用于疾病治療。
發明內容
本發明提供一種細胞信號通路抑制劑誘導豬脂肪細胞形成的方法，通過細胞信號通路抑制劑作于細胞，獲得的豬脂肪細胞沒有外源基因的插入，解決了轉基因后導致的外源基因插入突變對生物安全性影響的問題。本發明的技術解決方案如下
將豬胚胎成纖維細胞以Γ6Χ IO4個/ cm2的比例均勻的接種到Corning細胞培養板中，使用誘導培養基培養；37°C ,5% CO2培養箱中培養20天時，對細胞進行觀察并油紅0染色，可發現油紅0著色細胞，證明其確實為脂肪細胞；
誘導培養基配方為15% (v/v) Knockout Serum Replacement (Invitrogen)血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培養基，0. ImM 非必須氨基酸 Gnvitrogen)， 0. 055πιΜβ -巰基乙醇(Invitrogen)，2 mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0. 2-1 μ M SB431542 (Stemgent)。所述細胞信號通路抑制劑誘導豬脂肪細胞形成的方法，還可加入0. 5-2 μ M通路抑制劑Thiazovivin后使其效率增加。細胞信號通路抑制劑SB431542和Thiazovivin分別作用于TGF-β /smad信號通路和ROCK信號通路。Smad3能夠與通過C/E B P β的Mad homology 1區域的結合，影響C/ E BP β與DNA的結合，從而抑制其活性，抑制脂肪細胞轉化。因此通過細胞信號通路抑制劑 SB431542的處理，可以抑制TGF- β /smad信號通路的活性，促進脂肪細胞的形成。而ROC家族成員能夠直接調節細胞骨架中的肌動蛋白進行重組，還能夠調節如細胞能動性、粘附力、 胞質分裂等多種與肌動蛋白細胞骨架相關的細胞功能。ROCK介導的他0信號肽是通過磷酸化某些參與肌動蛋白絲組裝及收縮的底物來調節肌動蛋白細胞骨架的。而在脂肪形成的過程中絲狀的肌動蛋白結構發生改變，從長的張力纖維變成皮質肌動蛋白。因此抑制ROCK信號通路可促進脂肪細胞的形成。本發明的積極效果在于利用細胞信號通路抑制劑而非轉基因來誘導細胞轉化， 可有效的防止細胞基因組因插入外源基因而導致的基因突變。同時該方法對于研究脂肪細胞的形成機制有一定的促進作用，其簡便性和安全性可被廣泛的應用，可用于脂肪形成機制的研究，也能在疾病治療等臨床應用上發揮作用。
圖1為實施例1誘導得到的脂肪細胞；
圖2為實施例1誘導得到的脂肪細胞油紅0染色； 圖3為實施例IRT-PCR分析脂肪特異基因表達； 圖4為實施例1細胞免疫熒光染色分析脂肪特異基因表達； 圖5為實施例2誘導得到的脂肪細胞油紅0染色； 圖6為實施例3誘導得到的脂肪細胞油紅0染色； 圖7為實施例4誘導得到的脂肪細胞油紅0染色； 圖8為實施例5誘導得到的脂肪細胞油紅0染色； 圖9為實施例6誘導得到的脂肪細胞油紅0染色； 圖10為實施例7誘導得到的脂肪細胞油紅0染色； 圖11為實施例8誘導得到的脂肪細胞油紅0染色。
具體實施例方式下列實施例旨在進一步舉例描述本發明，而不是以任何方式限制本發明。在不背離本發明的精神和原則的前提下，對本發明所作的本領域普通技術人員容易實現的任何改動或改變都將落入本發明的待批權利要求范圍之內。實施例1
0. 5 μ M細胞信號通路抑制劑SB431542可誘導豬胚胎成纖維細胞轉化成為脂肪細胞將豬胚胎成纖維細胞以5 X IO4個/ cm2的比例均勻的接種到6cm細胞培養板中，使用誘導培養基培養。誘導培養基配方為15%(v/v)Knockout Serum Replacement (Invitrogen) 血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培養基，0. ImM 非必須氨基酸 Gnvitrogen)， 0·055πιΜβ-巰基乙醇 Gnvitrogen)，2mM L-谷氨酰胺 Qnvitrogen)，0. 5 μ M SB431542 (Stemgent)。37°C，5% CO2 培養箱中培養。
結果表明誘導培養20天時，經觀察可發現有明亮的、富含脂滴的細胞的形成 (參見圖1、圖2)。油紅0染色后可觀察到被染成紅色的圓形的脂滴，豬脂肪特異性基因 (PPAR γ，C/EBP α、β、δ，LPL, ΑΡ2, Adipoq, CFD, SLC2A4)經 PCR 后分另Ij為 172，130，148， 127，150，114，229，88，83bp處出現特異性條帶，細胞免疫熒光呈陽性。證明0.5μΜ的 SB431542能夠促使豬胚胎成纖維細胞轉化成為脂肪細胞，計算得到的效率為17. 3%。參見圖3、20天時，誘導的到的脂肪細胞表達脂肪特異性基因，β-actin作為對照。特異基因 PPAR γ，C/EBP α、β、δ，LPL, ΑΡ2, Adipoq, CFD, SLC2A4, β -actin 片段的大小分別為 172,130,148,127,150,114,229,88,83,173 bp。圖4 用三種脂肪特異性基因蛋白抗體對誘導得到的脂肪細胞進行免疫熒光染色，從左到右分別為亮視野對照；DAPI染色；細胞免疫熒光染色。實施例2
0. 2 μ M細胞信號通路抑制劑SB431542可誘導豬胚胎成纖維細胞轉化成為脂肪細胞將豬胚胎成纖維細胞以5 X IO4個/ cm2的比例均勻的接種到6cm細胞培養板中，使用誘導培養基培養。誘導培養基配方為15%(v/v)Knockout Serum Replacement (Invitrogen) 血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培養基，0. ImM 非必須氨基酸 Gnvitrogen)， 0·055πιΜβ-巰基乙醇 Gnvitrogen)，2mM L-谷氨酰胺 Qnvitrogen)，0. 2 μ M SB431542 (Stemgent)。37°C，5% CO2 培養箱中培養。結果表明誘導培養20天時，經觀察可發現有明亮的、富含脂滴的細胞的形成。油紅O染色后可觀察到被染成紅色的圓形的脂滴，證明0. 2 μ M的SB431542能夠促使豬胚胎成纖維細胞轉化成為脂肪細胞，計算得到的效率為15. 8%。參見圖5.
實施例3
1 μ M細胞信號通路抑制劑SB431542可誘導豬胚胎成纖維細胞轉化成為脂肪細胞將豬胚胎成纖維細胞以5Χ IO4個/ cm2的比例均勻的接種到6cm細胞培養板中，使用誘導培養基培養。誘導培養基配方為15%(v/v)Knockout Serum Replacement (Invitrogen) 血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培養基，0. ImM 非必須氨基酸 Gnvitrogen)， 0. 055πιΜβ -巰基乙醇 Gnvitrogen)，2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，1 μ M SB431542 (Stemgent)。37°C，5% CO2 培養箱中培養。結果表明誘導培養20天時，經觀察可發現有明亮的、富含脂滴的細胞的形成。油紅O染色后可觀察到被染成紅色的圓形的脂滴，證明1 μ M的SB431542能夠促使豬胚胎成纖維細胞轉化成為脂肪細胞，計算得到的效率為19. 1。參見圖6。實施例4
0. 5 μ M細胞信號通路抑制劑SB431542和0. 5 μ M細胞信號通路抑制劑Thiazovivin可誘導豬胚胎成纖維細胞轉化成為脂肪細胞
將豬胚胎成纖維細胞以5 X IO4個/ cm2的比例均勻的接種到6cm細胞培養板中，使用誘導培養基培養。誘導培養基配方為15%(v/v)Knockout Serum Replacement (Invitrogen) 血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培養基，0. ImM 非必須氨基酸 Gnvitrogen)， 0. 055πιΜβ -巰基乙醇(Invitrogen) ,2mM L-谷氨酰胺 Qnvitrogen)，0. 5 μ M Thiazovivin (Stemgent)，0· 5μ M SB431542 (Stemgent)。37°C，5% CO2 培養箱中培養。結果表明誘導培養20天時，經觀察可發現有明亮的、富含脂滴的細胞的形成。油紅0染色后可觀察到被染成紅色的圓形的脂滴，證明同時加入0. 5 μ M SB431542和0. 5 μ M Thiazovivin能夠促使豬胚胎成纖維細胞轉化成為脂肪細胞，計算得到的效率為25. 5%。 參見圖7。實施例5
0. 5 μ M細胞信號通路抑制劑SB431542和ΙμΜ細胞信號通路抑制劑Thiazovivin可誘導豬胚胎成纖維細胞轉化成為脂肪細胞
將豬胚胎成纖維細胞以5 X IO4個/ cm2的比例均勻的接種到6cm細胞培養板中，使用誘導培養基培養。誘導培養基配方為15%(v/v)Knockout Serum Replacement (Invitrogen) 血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培養基，0. ImM 非必須氨基酸 Gnvitrogen)， 0. 055πιΜβ -巰基乙醇(Invitrogen) ,2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，1 μ M Thiazovivin (Stemgent)，0· 5μ M SB431542 (Stemgent)。37°C，5% CO2 培養箱中培養。結果表明誘導培養20天時，經觀察可發現有明亮的、富含脂滴的細胞的形成。油紅0染色后可觀察到被染成紅色的圓形的脂滴，證明同時加入0.5μ M SB431542和ΙμΜ Thiazovivin能夠促使豬胚胎成纖維細胞轉化成為脂肪細胞，計算得到的效率為27. 0%。 見圖8.
實施例6
0. 5 μ M細胞信號通路抑制劑SB431542和2 μ M細胞信號通路抑制劑Thiazovivin可誘導豬胚胎成纖維細胞轉化成為脂肪細胞
將豬胚胎成纖維細胞以5Χ IO4個/ cm2的比例均勻的接種到6cm細胞培養板中，使用誘導培養基培養。誘導培養基配方為15%(v/v)Knockout Serum Replacement (Invitrogen) 血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培養基，0. ImM 非必須氨基酸 Gnvitrogen)， 0·055πιΜβ-巰基乙醇(Invitrogen) ,2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，2 μ M Thiazovivin (Stemgent)，0· 5μ M SB431542 (Stemgent)。37°C，5% CO2 培養箱中培養。結果表明誘導培養20天時，經觀察可發現有明亮的、富含脂滴的細胞的形成。油紅O染色后可觀察到被染成紅色的圓形的脂滴，證明同時加入0. 5 μ M SB431542和2 μ M Thiazovivin能夠促使豬胚胎成纖維細胞轉化成為脂肪細胞，計算得到的效率為27. 4%。 見圖9.
實施例7
豬胚胎成纖維細胞密度為4X IO4個/ cm2時經細胞信號通路抑制劑SB431542(0. 5μΜ) 誘導可轉化成為脂肪細胞
將豬胚胎成纖維細胞以4Χ IO4個/ cm2的比例均勻的接種到6cm細胞培養板中，使用誘導培養基培養。誘導培養基配方為15%(v/v)Knockout Serum Replacement (Invitrogen) 血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培養基，0. ImM 非必須氨基酸 Gnvitrogen)， 0·055πιΜβ-巰基乙醇 Gnvitrogen)，2mM L-谷氨酰胺 Qnvitrogen)，0. 5 μ M SB431542 (Stemgent)。37°C，5% CO2 培養箱中培養。結果表明誘導培養20天時，經觀察可發現有明亮的、富含脂滴的細胞的形成。油紅O染色后可觀察到被染成紅色的圓形的脂滴，證明豬胚胎成纖維細胞密度為4X IO4個/ cm2時經誘導能夠得到脂肪細胞，計算得到的效率為15. 9%。見圖10.
實施例8豬胚胎成纖維細胞密度為6X104個/ cm2時經細胞信號通路抑制劑SB431542(0. 5μΜ) 誘導可轉化成為脂肪細胞
將豬胚胎成纖維細胞以6 X IO4個/ cm2的比例均勻的接種到6cm細胞培養板中，使用誘導培養基培養。誘導培養基配方為15%(v/v)Knockout Serum Replacement (Invitrogen) 血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培養基，0. ImM 非必須氨基酸 Gnvitrogen)， 0·055πιΜβ-巰基乙醇 Gnvitrogen)，2mM L-谷氨酰胺 Qnvitrogen)，0. 5 μ M SB431542 (Stemgent)。37°C，5% CO2 培養箱中培養。結果表明誘導培養20天時，經觀察可發現有明亮的、富含脂滴的細胞的形成。油紅0染色后可觀察到被染成紅色的圓形的脂滴，證明豬胚胎成纖維細胞密度為6X IO4個/ cm2時經誘導能夠得到脂肪細胞，計算得到的效率為16. 7%。見圖11。通過以下試驗例證明本發明的效果 試驗例1 油紅0染色鑒定豬脂肪細胞
1試驗過程在20天時對誘導的細胞進行油紅0染色。首先使用10%甲醛(V· :V 水=1:9) 1 30min，用60%胃丙酉享(V異丙醇V水= 3 2)清洗、晾干，然后0. 6g/ml油紅0染色 30min，用30%異丙醇(V胃:V7K=3:7)快速清洗一遍，最后用蒸餾水清洗五遍后用顯微鏡觀察。2試驗結果油紅0染料可與脂肪細胞特異性的結合。所以豬胚胎成纖維細胞經油紅0染色不著色，脂肪細胞的脂滴可被油紅0染成紅色。結果表明在顯微鏡下可觀察到被染成紅色的圓形的脂滴，證明其確實是脂肪細胞。試驗例2 油紅0染色測定脂肪細胞的形成效率
1試驗過程在20天時對誘導的細胞進行油紅0染色后。在同組的3個細胞培養板中(10X20)倍顯微鏡下隨機選取10個視野(1. 35mm2)進行油紅0染色細胞計數，取得平均數后計算每平方厘米(cm2)的脂肪細胞數目，除以起始的細胞密度(Γ6Χ104個/ cm2)，得到的結果即誘導效率。試驗例3 RT-PCR檢測豬脂肪細胞特異基因的表達
1試驗過程提取誘導20天的細胞總RNA作為模板，利用豬脂肪特異性基因(PPARy， C/EBP α、β、δ，LPL, ΑΡ2, Adipoq, CFD, SLC2A4)的引物進行 RT-PCR 鑒定。采用 Trizol (Invitrogen) i式齊Ll提取 RNA，米用 SuperScript IIIFirst-Strand SynThiazovivinesis System (Invitrogen)反轉錄試劑盒獲得 cDNA，PCR 反應采用 Taq DNA polymerase (Fermentas)試劑。具體操作步驟參照說明書。PCR產物委托北京天根公司進行測序，證明其序列正確。 RT-PCR反應的引物和大小分別為
基因上游引物(5，to3')下游引物(5’ to3')AmpliconSize(bp)PPARyCTGACCAMGCAAAGGCGAGACCCCTGAAAGATGCGAATG172C/EBPαCAAGAACAGCAACGAGTAGTCATTGTCACTGGTCAG130C/EBPβCAGCGACGAGTACAAGATCTGCTCCACCTTCTTCTG148C/EBPδGCTATCGTCAGGTCAGTTATCTCCATAATCAGTGTCCAA127LPLGCGTGTGGCTTCAGAGTCCAGGAATGAGATGGCAAGTGT150AP2CGAACTCTACAACACTCTGACCAACAAGCATATTGAACA114adipoqACTTGAAGGATGTGAAGGTATGTTGTGGTAGAGAAGGAA229CFDCATGATCTCCTCCTGCTGAAGCCTCGTGGTCCTCTCGTT88
權利要求
1.一種細胞信號通路抑制劑誘導豬脂肪細胞形成的方法，包括以下步驟將豬胚胎成纖維細胞以Γ6Χ IO4個/ cm2的比例均勻的接種到Corning細胞培養板中， 使用誘導培養基培養；37°C，5% C02培養箱中培養20天時，對細胞進行觀察并油紅0染色證明其為脂肪細胞；誘導培養基配方為15% (v/v) Knockout Serum Replacement (Invitrogen)血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培養基，0. ImM 非必須氨基酸 Gnvitrogen)， 0. 055πιΜβ -巰基乙醇(Invitrogen)，2 mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0. 2-1 μ M SB431542 (Stemgent)。
2.如權利要求1所述細胞信號通路抑制劑誘導豬脂肪細胞形成的方法，其特征在于 在誘導培養過程中還加入0. 5-2 μ M通路抑制劑Thiazovivin。
全文摘要
本發明提供一種細胞信號通路抑制劑誘導豬脂肪細胞形成的方法，將豬胚胎成纖維細胞以4~6×104個/cm2的比例均勻的接種到Corning細胞培養板中，使用誘導培養基培養；37℃，5％CO2培養箱中培養20天時，對細胞進行觀察并油紅O染色證明其為脂肪細胞。利用細胞信號通路抑制劑而非轉基因來誘導細胞轉化，可有效的防止細胞基因組因插入外源基因而導致的基因突變。同時該方法對于研究脂肪細胞的形成機制有一定的促進作用，其簡便性和安全性可被廣泛的應用，可用于脂肪形成機制的研究，也能在疾病治療等臨床應用上發揮作用。
文檔編號C12N5/077GK102382800SQ201110404508
公開日2012年3月21日 申請日期2011年12月8日 優先權日2011年12月8日
發明者全龍泉, 周楊, 唐成程, 張明軍, 朱建國, 歐陽紅生, 逄大欣, 高飛 申請人:吉林大學